Une méthode rapide et efficace de disséquer les ailes Pupal de Drosophila adapté aux Immunodetections ou des analyses par PCR

L’objectif global de cette procédure est une méthode rapide et efficace pour disséquer les ailes nymphales de la drosophile adaptée aux immunodétections ou aux tests PCR. La procédure décrite ici a été développée par la demande de trouver une méthode rapide et efficace pour obtenir des échantillons d’ailes de nymphe adaptés à la réalisation de tests PCR ou de protocoles d’immunodétection. À l’aide d’un pinceau humide, retirez délicatement les nymphes APF de zéro heure des flacons de culture et placez-les dans de nouveaux flacons pour terminer la période de développement.

Par exemple, si vous utilisez une chrysalide de 24 heures, elle ne restera dans le flacon que 22 heures. À 22 heures, transférez la chrysalide sur la lame de microscope avec le ruban adhésif double face collé dessus. Ce transfert pourrait se faire à l’aide d’un pinceau pour éviter d’endommager la nymphe.

La chrysalide doit être positionnée en formant une rangée, les côtés dorsaux vers le haut et les extrémités céphaliques orientées dans la même direction. Après cela, remettez la lame de microscope à une température constante et laissez la nymphe terminer le temps de développement approprié. Dans ce cas, il s’agirait de 24 heures.

La lame de microscope avec le ruban adhésif double face sera une plate-forme de dissection transitoire pour retirer l’enveloppe nymphale. Pendant les deux heures passées sur la lame de microscope, la nymphe sèche, ce qui la rend facilement cassable avec des pinces. La première étape de la dissection consiste à retirer la chrysalide de la carcasse.

Ensuite, la chrysalide sera transférée sur une autre diapositive avec du ruban adhésif double face collé dessus. La carcasse sera laissée sur place. Cette chrysalide sera collée avec la face ventrale vers le haut, placée au milieu du ruban.

Avant d’effectuer la coupe de l’aile, la chrysalide doit être recouverte d’une solution selon la procédure d’immunohistochimie. Cette solution sera affixative et l’aile sera libérée de la cuticule. À l’aide d’une pince, retirez délicatement l’opercule de la nymphe.

Cassez l’étui avec une pince en faisant une ligne le long du côté de la chrysalide jusqu’à l’extrémité caudale de celle-ci. Avec l’éclairage approprié, il est possible de visualiser la forme interne de la nymphe, créant un espace évident juste au-dessus de la charnière de l’aile de la nymphe. Cet espace sert de guide pour effectuer l’ouverture sans endommager la nymphe.

Au fur et à mesure que l’étui est ouvert latéralement, il sera possible d’en retirer des parties, de les ramasser par le bord ouvert et de les transporter du côté opposé où le ruban adhésif double face les maintiendra. À la fin de la dissection, la chrysalide sera presque nue. Seul un morceau de boîtier couvrira l’extrémité postérieure.

À l’aide de la pince, enfoncez doucement le reste de l’étui. Ce mouvement soulèvera l’extrémité intérieure de la nymphe, permettant à la tête et au thorax de rester dans une position préférentielle pour être collés à l’étape suivante. Prenez une nouvelle lame avec du ruban adhésif double face et retournez-la sur la nymphe.

Appuyez ensuite légèrement pour faire adhérer la chrysalide au ruban adhésif et glissez doucement la diapositive afin de retirer la chrysalide du reste des étuis. Inversez la lame du microscope. La chrysalide sera coincée sur le côté dorsal au niveau de la tête ou du thorax.

Pour une utilisation en immunohistochimie, couvrez toute la chrysalide nue avec 4 % de paraformaldéhyde. Après 10 minutes d’affixation, à l’aide de ciseaux, faites une petite incision au niveau de la région de la charnière de l’aile ou à proximité de celle-ci. Laisser l’affixatif atteindre l’épithélium de l’aile.

Puis, après cinq minutes, déchirez avec une pince les bords de la cuticule, élargissant le trou et permettant la libération de l’épithélium de l’aile du sac cuticulaire. Une fois que le tissu de l’aile est libéré, laissez-le dans la solution de paraformaldéhyde jusqu’à la fin des 30 minutes de fixation. La méthode de dissection décrite dans cette vidéo peut être utilisée pour préparer des échantillons de haute qualité d’ailes de nymphe de drosophile à différents stades de développement pour de nombreux types de techniques.

Le protocole pourrait être mis en œuvre pour disséquer une ou plusieurs chrysalides en même temps. Cela permet d’accélérer la procédure, ce qui permet d’atteindre plus facilement un grand nombre d’ailes disséquées. Pour retirer la chrysalide nue de l’étui ouvert, il est important que l’extrémité postérieure soit suffisamment petite.

Bien qu’il soit possible d’enlever une rangée de quatre ou cinq nymphes nues en même temps, ce n’est pas un point pertinent, étant capable d’enlever celles qui restent attachées à leur étui par étapes successives à l’aide d’un seul ruban adhésif double face. Voici une image confocale d’une aile APF de 24 à 30 heures. La coloration montre l’expression de la protéine patchée, le récepteur canonique du hérisson, les noyaux et les filaments d’actine.

Un processus de dissection similaire pourrait être utilisé pour obtenir des échantillons d’ailes plus grands afin d’isoler l’ARNm. Cet ARNm peut être utilisé pour synthétiser l’ADNc qui peut être utilisé dans les réactions PCR. Nous montrons ici les produits obtenus pour détecter l’expression du patché et de l’actine.

Le protocole offre une méthode simple pour obtenir des échantillons d’ailes de nymphes qui conservent la morphologie familière de l’aile. À partir de ces préparations, il est possible d’obtenir des empilements d’images qui pourraient être projetées sous forme d’images 2D ou 3D pour étudier la distribution et/ou l’enrichissement des protéines lors de la différenciation de l’aile. Un protocole similaire peut être utilisé pour collecter un grand échantillon d’aile de nymphe nécessaire à la synthèse de l’ADNc, une molécule essentielle dans les réactions PCR.

Cette procédure offre une approche alternative et complémentaire aux méthodes déjà publiées pour la dissection de l’aile nymphale.