Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères

Le but de cette procédure est d'isoler et d'identifier des lignées cellulaires clonales présentant une délétion génique obtenues par deux types d'édition du génome médiée par CRISPR/Cas9. Une méthode détecte la perte de protéine causée par la jonction non homologue des extrémités, tandis que l'autre détecte les altérations génomiques générées par la réparation dirigée par homologie. Cette méthode est particulièrement utile dans le domaine de la biologie moléculaire, où la génération de lignées cellulaires présentant des altérations génétiques constitue un outil important pour l'analyse de la fonction des gènes.

Le principal avantage de cette technique est qu'il s'agit d'une méthode rapide et relativement haut débit qui peut être facilement réalisée à l'aide de techniques de biologie moléculaire de base. La jonction non homologue des extrémités introduit de petites délétions ou insertions, évaluées par un immunoblot en point, tandis que la réparation dirigée par homologie permet des perturbations plus importantes et plus précises, évaluées par PCR sur colonies. Cette expérience utilise des cellules T-REx-293 cultivées dans un milieu DMEM, supplémenté avec 10 % de FBS à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Avant la transfection, ensemencez les cellules dans des plaques à six puits et incluez un puit témoin non transfecté. Faites croître les cellules jusqu'à une confluence d'environ 70 %. Transfectez les cellules avec 2,5 microgrammes de plasmide total en utilisant un protocole de transfection commercial.

Pour la transfection de cellules sans sélection, utilisez 2,5 microgrammes de plasmide Cas9-sgARN. Pour la transfection de cellules avec sélection, utilisez 0,75 microgramme de Cas9-sgARN1, 0,75 microgramme de Cas9-sgARN2 et un microgramme de matrice d'homologous recombinaison. Incubez les cellules transfectées et le témoin non transfecté à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures.

Pour les cellules transfectées avec sélection, commencez la sélection par le médicament en traitant les cellules avec le produit approprié, ici la néomycine. Remettez la plaque à six puits dans l'incubateur. Observez les cellules traitées une fois par jour afin de vérifier les taux de mortalité cellulaire, jusqu'à ce que toutes les cellules du témoin non transfecté soient mortes.

Pour isoler des populations clonales, commencez par faire croître les cellules jusqu'à une confluence de 100 % dans le puits d'origine après la sélection. Ensuite, réalisez des dilutions sérielles des cellules et comptez-les. Étant donné que la génération adéquate de colonies monoclonales est essentielle pour obtenir un knockout complet, il est important de déterminer la dilution appropriée afin de semer les cellules à la densité souhaitée.

Une fois la dilution correcte déterminée, répartir les cellules dans des plaques de 96 puits à une densité de 0,33 cellule par puits. Répartir trois plaques de 96 puits constitue un bon point de départ pour s'assurer d'isoler plus d'un clone correct. Pendant une période de deux à quatre semaines, observer les colonies jusqu'à ce qu'elles deviennent visibles à l'œil nu.

Ces images représentatives montrent des colonies à différents stades de croissance. Une cellule unique au moment du semage, des cellules au jour 5 et une colonie bien établie au jour 10. À l’aide d’une pointe de pipette stérile, sélectionner délicatement et avec précision les colonies visibles, puis les resemer dans de nouveaux puits afin de favoriser une croissance en monocouche.

Poursuivre la culture des cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Les candidats au knockout sans sélection sont criblés par immunoblot en point pour évaluer le produit protéique de manière haut débit. Après avoir fait croître des clones individuels jusqu'à une confluence de 50 à 100 %, détacher la monocouche de cellules par pipetage dans le puits.

Prélevez 90 microlitres des 100 microlitres de volume total de chaque puits et transférez-les dans un tube microcentrifuge propre. Aux fins de cette vidéo, seuls deux échantillons seront traités. Faites centrifuger à 6 000 tr/min pendant cinq minutes, retirez le milieu, puis lysez le culot cellulaire dans 10 microlitres de tampon de charge SDS 1X.

Ajoutez 90 microlitres de nouveau milieu au reste des cellules dans le puits, puis replacez la plaque dans l'incubateur pour continuer la propagation des cellules. Prélèvez à la pipette un microlitre de lysat cellulaire et déposez-le sur une membrane de nitrocellulose sèche pour former un point. Effectuez deux fois le transfert de chaque échantillon sur deux membranes distinctes, en créant deux motifs identiques d'échantillons.

Incubez les membranes dans 5 % de lait dans du TBST à température ambiante, sous agitation, pendant une heure. Après une heure, incubez les membranes avec les anticorps primaires à la dilution recommandée d'anticorps primaire, dans du TBST contenant 5 % de lait. Sur une membrane, utilisez l'anticorps primaire dirigé contre la protéine cible, ELAVL1 dans cette expérience.

Sur l'autre membrane, utilisez l'anticorps primaire dirigé contre une protéine de contrôle dont l'expression n'est pas censée varier ; ici, PUM2 est utilisé. Incubez une heure à température ambiante. Retirez la solution d'anticorps primaire de chaque immunotransfert, ajoutez du TBST et incubez pendant cinq minutes.

De cette manière, laver les membranes trois fois avec du TBST. Ensuite, ajouter à chaque membrane l'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase approprié, et incuber à température ambiante pendant une heure. Après une heure, laver les membranes trois fois avec du TBST, cinq minutes à chaque fois.

Appliquez une solution de substrat chimiluminescent sur les transferts selon les instructions du fabricant, puis imagez les membranes transférées à l’aide d’un imageur numérique de chimiluminescence. Enfin, quantifiez les intensités des points pour les protéines cibles et de contrôle à l’aide du logiciel approprié, et analysez les résultats comme décrit dans le protocole textuel. Les clones porteurs du marqueur de résistance sélectionnable sont criblés par PCR de colonies.

Commencez cette procédure en dupliquant des colonies individuelles dans une nouvelle plaque de 96 puits, puis en les cultivant jusqu'à confluence à 100 % en vue de la préparation de lysats cellulaires. Retirez le milieu d'un ensemble des clones, resuspendez les cellules de chaque puits dans 30 microlitres de tampon d'extraction provenant d'un kit commercial de préparation d'ADN, puis transférez le tout dans un tube microcentrifuge propre de 1,5 millilitre. Chauffez la solution à 96 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis laissez refroidir à température ambiante.

Ajouter 30 microlitres de tampon de stabilisation dans chaque tube de microcentrifugation et mélanger soigneusement. Pour identifier les lignées de type sauvage et les lignées mutantes monoalléliques ou bialléliques par PCR sur colonies, concevoir deux jeux distincts d'amorces PCR afin d'amplifier des régions situées autour des bras d'homologie, en fonction de l'intégration réussie ou non de la cassette de résistance. De chaque côté, utiliser une amorce commune qui s'hybride en dehors du bras d'homologie.

Pour tester l’allèle de type sauvage, utilisez l’amorce commune avec l’amorce appariée correspondante, complémentaire de la séquence endogène couvrant la région d’homologie. Pour tester la mutation souhaitée, utilisez l’amorce commune avec une autre amorce appariée, complémentaire du cassette de résistance inséré. Pour chaque échantillon à analyser, préparez un mélange de réaction contenant les éléments suivants : 0,5 microlitre de lysat cellulaire, 1,25 microlitres de tampon 10X KOD, 0,75 microlitre de sulfate de magnésium 25 millimolaire, 1,25 microlitres de dNTPs 2 millimolaires, 0,375 microlitre d’amorce avant, 0,375 microlitre d’amorce arrière, 0,25 microlitre de polymérase KOD et 7,75 microlitres d’eau.

Réaliser une PCR en utilisant les conditions suivantes : 95 °C pendant deux minutes, suivies de 25 cycles de 95 °C pendant 20 secondes, température de fusion des amorces pendant 10 secondes, et 70 °C pendant 20 secondes par KB. Ensuite, visualiser les produits de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose. Un édition du génome par jonction non homologue des extrémités a été réalisée afin de générer des lignées invalidées pour ELAVL1, suivie d'un immunoblot en point, en détectant ELAVL1 et PUM2. Les clones présentant un signal témoin faible ont été marqués d'une croix et exclus de toute analyse ultérieure.

Les clones présentant de faibles signaux ELAVL1 ont été testés ultérieurement par immunobuvardage. Les candidats confirmés sont indiqués en vert, et les candidats invalidés sont indiqués en gris. Ce graphique montre les rapports des signaux protéiques ELAVL1 par rapport au témoin, classés par ordre croissant.

Dans la plupart des cas, les populations clonales présentant le signal relatif d'ELAVL1 le plus faible ont été correctement identifiées comme des knockouts. Les candidats générés par la méthode de réparation dirigée par homologie ont été sélectionnés par PCR sur colonies, et les produits de PCR ont été visualisés par électrophorèse sur gel d'agarose. Des résultats exemples sont présentés ici, obtenus à l'aide d'amorces chevauchant le site d'intégration en amont, combinant des amorces endogènes internes et des amorces internes de knockout.

Les amorces ont d'abord été validées dans les cellules parentales et dans les cellules sélectionnées en masse. Les résultats obtenus à partir de 24 clones candidats individuels sont présentés conjointement avec les profils de bandes attendus pour les clones de type sauvage, d'invalidation génique et de délétion monoallélique. Les flèches noires indiquent les produits d'amplification corrects, les étoiles indiquent les clones d'invalidation génique bialléliques.

Les lignées mutantes bialléliques ont été davantage validées par immunoblot. La jonction d'extrémités non homologues utilise une simple coupure Cas9 et un criblage indépendant de la sélection, nécessitant ainsi peu de préparation initiale, et le criblage des clones d'extinction par des dot blots permet de déterminer rapidement si la génération d'extinction a été réussie. Le criblage fondé sur la PCR détecte précisément les candidats corrects présentant de grandes perturbations génomiques générées par la réparation dirigée par homologie.

Ces techniques permettent aux chercheurs en biologie moléculaire d'identifier facilement et efficacement des knockouts, ce qui leur permet d'étudier des processus cellulaires normaux ou dysfonctionnels à l'aide de lignées cellulaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler et d'identifier des lignées cellulaires clonales présentant un knockout généré par édition du génome médiée par CRISPR/Cas9.