Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères

L’objectif de cette procédure est d’isoler et d’identifier des lignées cellulaires clonales knock-out générées par deux types d’édition du génome médiée par CRIPSR/Cas9. Une méthode détecte l’inactivation des protéines causée par l’assemblage d’extrémités non homologues tandis que l’autre détecte les perturbations génomiques générées par la réparation dirigée par homologie. Cette méthode est particulièrement utile dans le domaine de la biologie moléculaire, où la génération de lignées cellulaires avec des perturbations génétiques est un outil important pour disséquer la fonction des gènes.

Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode rapide et à débit relativement élevé qui peut être facilement exécutée à l’aide de techniques de biologie moléculaire de base. La jonction d’extrémité non homologue introduit de petites délétions ou insertions, et est évaluée par un immunotransfert de point, tandis que la réparation dirigée par homologie permet des perturbations plus grandes et plus précises, et est évaluée par PCR de colonie. Cette expérience utilise des cellules T-REx-293 cultivées dans un milieu DMEM, complétées par 10 % de FBS à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Avant la transvection, placez les cellules sur des plaques à six puits et incluez un puits pour un contrôle non transvecté. Cultivez les cellules jusqu’à environ 70 % de confluence. Transvectez les cellules avec 2,5 microgrammes de plasmide total à l’aide d’un protocole de transvection commercial.

Pour la transvection des cellules sans sélection, utilisez 2,5 microgrammes de plasmide Cas9-sgRNA. Pour la transvection des cellules avec sélection, utilisez 0,75 microgramme de Cas9-sgRNA1, 0,75 microgramme de Cas9-sgRNA2 et un microgramme de matrice de recombinaison homologue. Incuber les cellules transvectées et le témoin non transvecté à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures.

Pour les cellules transvectées avec sélection, commencez la sélection du médicament en traitant les cellules avec le médicament approprié, qui est la néomycine dans ce cas. Remettez la plaque à six puits dans l’incubateur. Observez les cellules traitées une fois par jour pour vérifier les taux de mort cellulaire, jusqu’à ce que toutes les cellules du témoin non transvecté meurent.

Pour isoler les populations clonales, faites d’abord croître les cellules à 100 % de confluence dans le puits d’origine après la sélection. Ensuite, faites des dilutions en série des cellules et comptez les cellules. Étant donné que la génération correcte de colonies monoclonales est essentielle pour obtenir une élimination complète, il faut prendre soin de déterminer la dilution correcte pour placer les cellules à la densité souhaitée.

Une fois que la dilution correcte a été déterminée, placez les cellules dans des plaques de 96 puits à une densité de 0,33 cellules par puits. L’installation de trois plaques de 96 puits est un bon point de départ pour assurer l’isolation de plus d’un clone correct. Sur une période de deux à quatre semaines, observez les colonies jusqu’à ce qu’elles soient visibles à l’œil nu.

Ces images représentatives montrent des colonies à différents stades de croissance. Une seule cellule au siège, des cellules au cinquième jour et une colonie bien établie au 10e jour. À l’aide d’une pointe de pipette stérile, prélevez les colonies visibles avec soin et précision, et réinstallez-les dans de nouveaux puits pour favoriser la croissance d’une monocouche.

Continuez à faire pousser les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Les candidats knock-out sans sélection sont criblés par dot immunoblot pour évaluer le produit protéique à haut débit. Après avoir cultivé des clones individuels à une confluence de 50 à 100 %, délogez la monocouche de cellules en pipetant à l’intérieur du puits.

Aliquote 90 microlitres du volume total de 100 microlitres de chaque puits dans un tube de microcentrifugation propre. Pour les besoins de cette vidéo, seuls deux échantillons seront traités. Faites tourner à 6 000 tr/min pendant cinq minutes, retirez le support et lysez la palette cellulaire dans 10 microlitres de tampon de chargement 1X SDS.

Ajoutez 90 microlitres de nouveau milieu au reste des cellules dans le puits et retournez la plaque dans l’incubateur pour continuer à propager les cellules. Pipetez un microlitre de lysat cellulaire sur une membrane de nitrocellulose sèche pour former un point. Épongez chaque échantillon deux fois sur deux membranes distinctes, créant ainsi deux modèles d’échantillons identiques.

Bloquer les membranes dans le lait à 5 % dans du TBST à température ambiante, avec balancement, pendant une heure. Après une heure, épongez les membranes avec des anticorps primaires à la dilution recommandée des anticorps primaires, et TBST plus 5 % de lait. Sur une membrane, utilisez l’anticorps primaire contre la protéine cible, ELAVL1 dans cette expérience.

Sur l’autre membrane, utilisez l’anticorps primaire pour une protéine de contrôle qui n’est pas censée changer, PUM2 est utilisé ici. Incuber à température ambiante pendant une heure. Retirez la solution d’anticorps primaire de chaque transfert, ajoutez le TBST et incubez pendant cinq minutes.

De cette manière, lavez les taches trois fois avec du TBST. Ensuite, ajoutez à chaque membrane l’anticorps secondaire conjugué HRP approprié et épongez à température ambiante pendant une heure. Au bout d’une heure, lavez les membranes trois fois avec du TBST pendant cinq minutes à chaque fois.

Appliquez une solution de substrat chimiluminescent sur les transferts, en suivant les instructions du fabricant, et imagez les membranes tamponnées sur un imageur numérique à chimiluminescence. Enfin, quantifiez l’intensité des points pour les protéines cibles et de contrôle à l’aide du logiciel approprié, et analysez les résultats comme décrit dans le protocole texte. Les candidats avec le marqueur de résistance sélectionnable sont criblés par PCR de colonie.

Commencez cette procédure en dupliquant les colonies individuelles dans une nouvelle plaque de 96 puits et en les faisant croître jusqu’à une confluence de 100 % pour la préparation de lysats cellulaires. Retirez le milieu d’un ensemble de clones, remettez les cellules en suspension de chaque puits dans 30 microlitres de tampon d’extraction d’un kit de préparation d’ADN commercial et transférez-les dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 millilitre. Chauffez la solution à 96 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis laissez refroidir à température ambiante.

Ajoutez 30 microlitres de tampon de stabilisation dans chaque tube de microcentrifugation et mélangez bien. Pour identifier les lignées mutantes de type sauvage et monoalléliques ou bialléliques par PCR de colonie, concevez deux ensembles distincts d’amorces de PCR pour amplifier les régions autour des bras d’homologie en fonction de l’intégration réussie ou non de la cassette de résistance. De chaque côté, utilisez une amorce commune qui recuit à l’extérieur du bras d’homologie.

Pour tester l’allèle de type sauvage, utilisez l’amorce commune avec l’amorce appariée correspondante qui est complémentaire à la séquence endogène couvrant la région d’homologie. Pour tester la mutation souhaitée, utilisez l’amorce commune avec une autre amorce appariée, complémentaire à la cassette de résistance insérée. Pour chaque échantillon à tester, préparez un mélange réactionnel contenant les éléments suivants : 0,5 microlitre de lysat cellulaire, 1,25 microlitre de tampon KOD 10X, 0,75 microlitre de sulfate de magnésium 25 millimolaires, 1,25 microlitre de deux dNTP millimolaires, 0,375 microlitre d’amorce directe, 0,375 microlitre d’amorce inverse, 0,25 microlitre de polymérase KOD et 7,75 microlitres d’eau.

Effectuez la PCR dans les conditions suivantes : 95 degrés Celsius pendant deux minutes, suivi de 25 cycles de 95 degrés Celsius pendant 20 secondes, de température de fusion de l’amorce pendant 10 secondes et de 70 degrés Celsius pendant 20 secondes par Ko. Par la suite, visualisez les produits PCR par électrophorèse sur gel d’agarose. L’édition du génome à l’aide de la jonction d’extrémités non homologues a été effectuée pour générer des lignes d’inactivation ELAVL1 suivies d’un immunotransfert de points, sondant ELAVL1 et PUM2. Les clones qui présentaient peu de signal de contrôle ont été marqués d’un X et exclus d’une analyse plus approfondie.

Les clones présentant de faibles signaux ELAVL1 ont été testés par western blot. Les candidats confirmés sont indiqués en vert et les candidats invalidés sont indiqués en gris. Ce graphique montre les rapports entre ELAVL1 et le signal protéique de contrôle par ordre croissant.

Dans la plupart des cas, les populations clonales avec le signal ELAVL1 relatif le plus faible ont été correctement identifiées comme knock-out. Les candidats générés par la méthode de réparation dirigée par homologie ont été criblés par PCR de colonie, et les produits PCR visualisés par électrophorèse sur gel d’agarose. Des exemples de résultats sont présentés à l’aide d’amorces couvrant la jonction d’intégration en amont à l’aide d’amorces endogènes à l’intérieur et d’amorces knock-out à l’intérieur.

Les amorces ont d’abord été validées dans des cellules parentales et des cellules sélectionnées en vrac. Les résultats de 24 clones candidats individuels sont présentés avec les modèles de bande attendus pour les clones de type sauvage, knock-out et de délétion monoallélique. Les flèches noires indiquent les bons produits d’amplification, les étoiles indiquent les clones knock-out bialléliques.

Les lignées mutantes bialléliques ont été validées par western blot. L’assemblage d’extrémités non homologues utilise une seule coupe Cas9 et un criblage indépendant de la sélection, nécessitant donc peu de préparation initiale, et le criblage des clones knock-out par dot blots peut rapidement déterminer si une génération knockout a réussi. Le criblage basé sur la PCR détecte avec précision les bons candidats présentant d’importantes perturbations génomiques générées par une réparation dirigée par homologie.

Ces techniques permettent aux chercheurs en biologie moléculaire d’identifier facilement et efficacement les knock-outs, ce qui leur permet d’explorer les processus cellulaires normaux ou dysfonctionnels à l’aide de lignées cellulaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et d’identifier les lignées cellulaires clonales knock-out générées par l’édition du génome médiée par CRISPR/Cas9.