Name: Enquêter sur von Willebrand facteur physiopathologie en utilisant un modèle de chambre d’écoulement de von Willebrand Factor-plaquettes String Formation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Apprenez à quantifier la formation de chaînes VWF-plaquettes sous contrainte de cisaillement dans une chambre d'écoulement in vitro. Cette méthode permet d'étudier la libération du facteur von Willebrand et son interaction avec les plaquettes en conditions contrôlées.

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Alison Michels est un destinataire de Frederick Banting et Charles Best Canada Bourse d’études supérieures de l’instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). Laura L. Swystun a reçu une bourse des IRSC. David Lillicrap est le récipiendaire d’une Chaire de recherche du Canada en hémostase moléculaire. Cette étude a été financée en partie par une subvention (MOP-97849) de fonctionnement des IRSC.

Ces études ont été approuvées par University, au Canada Research Ethics Board de la Reine.
1. endothélial Stimulation
<ol><li>
Collagène-manteau une plaque 6 puits culture de tissus.
	<ol>
<li>24h à l’avance, manteau une plaque 6 puits tissue culture à 37 ° C avec 1 mL de collagène de la mémoire tampon (50 µg/mL rat queue du collagène de type 1 avec l’acide acétique glacial 0,02 M).</li>
		<li>Laver les puits deux fois avec 2 mL de Hank Balanced Salt Solution (HBSS). NOTE : Plaques peuvent être enveloppés dans du papier d’aluminium et stockés dans un sac plastique hermétique à 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Graine de cellules endothéliales à une densité de 1 x 106 cellules / puits dans 2 mL de croissance moyenne contenant 10 % bovine sérum fœtal (SVF). Incuber les cellules pendant 24 h à 37 ° C (5 % CO2). NOTE : Ici, cellules endothéliales excroissance sanguines (BOECs) entre 5 et 15 passages ont été utilisés. BOECs ont été isolés chez des volontaires sains avec une séquence VWF type sauvage en utilisant une méthode référencée dans Starke al. 22 d’une manière semblable à celle déjà décrite par JoVE23.</li>
	<li>Retirez le support après 24h et laver les cellules avec HBSS.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de milieu sans sérum (milieu de croissance essentielle minimale sans FBS) contenant phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA ; 100 nM), l’histone (UH) et HK ou HR (tous à 25 µg/mL) aux cellules pendant 2 h à 37 ° C (5 % CO2). NOTE : Cette concentration de l’histone reposait sur les précédents rapports de cytotoxicité in vitro de Xu et al. 24 et Abrams et al. 25 utilisé 50 µg/mL.</li>
	<li>Recueillir le milieu après 2 h et conserver à-20 ° C jusqu'à l’analyse.</li>
</ol>2. VWF Quantification par Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
<ol><li>Enduire une microplaque avec 100 µL de revêtement tampon (dipotassique chlorure de sodium de phosphate de sodium et 145 mM 10 mM, pH 7,2) contenant 10 µg/mL polyclonaux anti-VWF anticorps durant la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Laver les plaques trois fois avec 250 µL de tampon de lavage (10 mM phosphate dibasique de sodium, chlorure de sodium 500 mM et 0,1 % Tween 20, pH 7,2).</li>
	<li>Diluer les échantillons moyens 1:2 et 1:4 avec tampon de lavage et l’utilisation de plasma normal de référence pour une courbe d’étalonnage, partant d’un 01:10 dilution.</li>
	<li>Plaque de 100 µL de sérums dilués et normes pour la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Laver les plaques trois fois avec 250 µL de tampon de lavage.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de dilué anti-VWF, anticorps de détection HRP conjugué (1,1 µg/µL de tampon de lavage) sur la plaque et incuber pendant 1 heure à température ambiante.</li>
	<li>Laver la plaque et incuber pendant 10 min avec le réactif de dichlorhydrate (DPO) de O-phénylènediamine, selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Arrêter la réaction avec 100 µL de 1 M H2SO4 et lire la plaque à 492 nm.</li>
</ol>3. phase solide Histone-VWF essai de liaison
<ol><li>Enduire une microplaque histones dilués à 0,5 % sodium Désoxycholate 50 mM tampon carbonate (pH 9,6) à 10 µg/mL pendant une nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Laver les plaques trois fois avec 250 µL de PBS additionné de 0,1 % Tween 20, incubation pendant 10 min entre les lavages.</li>
	<li>Bloquer la plaque avec 200 µL de PBS additionné de 0,1 % Tween 20 et 1 % albumine sérique bovine (BSA) pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Répétez l’étape 3.2.</li>
	<li>Diluer en série des dérivés du plasma humain du VWF/facteur VIII complexe de 200 mU/mL à 25 mU/mL dans un tampon salin (phosphate dibasique de sodium, 10 mM 500 mM chlorure de sodium et 0,1 % Tween 20, pH 7,2). Ajouter 100 µL de la plaque pendant 2 h à température ambiante.</li>
	<li>Répétez l’étape 3.2.</li>
	<li>Détecter la liaison du VWF à histone immobilisé à l’aide de 100 µL d’une solution contenant un PBS-0.1% Tween 20 et 1 : 1 000 lapin anticorps de polyclonal anti-VWF conjugué à la HRP pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Répétez l’étape 3.2.</li>
	<li>Incuber la plaque pendant 30 min avec 100 µL de réactif de la PPO et arrêter la réaction avec 100 µL de 1 M H2SO4. Mesurer la densité optique à 492 nm.</li>
</ol>4. ensemencement des cellules endothéliales sur flux Chambers
<ol><li>Charger 0,5 mL de tampon de collagène-revêtement (décrit à l’étape 2.1) dans une seringue de 1 mL Luer lock.</li>
	<li>Torsader l’extrémité du raccord Luer-lock de la seringue sur le réservoir d’une coulée de chambre.</li>
	<li>Appuyez lentement sur le piston jusqu'à ce que la voie entière est recouvert et chaque réservoir est plein. Répétez pour chaque voie et incuber la chambre à 37 ° C pendant 24 h.</li>
	<li>Aspirer le tampon de collagène-revêtement avec une pipette de 200 μl. Charger une autre seringue 1 ml HBSS et appuyez sur le piston lentement se laver chaque couloir de la chambre de flux. Aspirer le lavage avec une pipette de 200 μL à l’extrémité opposée de la chambre de flux. Répéter deux fois.</li>
	<li>Pipetter environ 100 µL d’une solution de cellules endothéliales (BOEC) 3 x 106 cellules/mL dans le milieu de croissance avec 10 % FBS dans la voie d’une chambre à flux. Remarque : La densité de semis de cellules endothéliales dépasse la capacité de la chambre. Il s’agit d’assurer une couverture maximale de canal ; les cellules non adhérentes sont supprimés à l’étape de lavage ultérieures.</li>
	<li>Incuber la chambre à 37 ° C pendant 24 h. changement du milieu toutes les 8-12 h à l’aide de seringues Luer-lock (comme au point 4.4). S’assurer qu’il n’y a pas de bulles visibles dans les ruelles.</li>
</ol>5. isoler les plaquettes de sang total humain
<ol><li>Dans une armoire avec une aiguille de 30 G de sécurité biologique, ajouter 300 µL de tampon d’acide-citrate dextrose (citrate trisodique 85 mM, 111 mM D-glucose et 71 mM, acide citrique, pH 4,5) à un vacutainer de collecte de sang sans additif 3 mL.</li>
	<li>Collecter le sang de volontaires en bonne santé (aucune anti-plaquettaire et non-stéroïdiens anti-inflammatoires non stéroïdiens pendant sept jours) par ponction veineuse (trois tubes de 3 mL de chaque), suite à un protocole semblable à celui publié par Bernardo et al.26.</li>
	<li>Jeter le premier tube, car les dommages de tissu initial associé à la ponction veineuse peuvent provoquer l’activation plaquettaire spontanée.</li>
	<li>Retourner doucement la Vacutainer trois fois pour mélanger le sang avec l’anticoagulant.</li>
	<li>Centrifuger le Vacutainer à 150 g pendant 15 min à 24 ° C (température ambiante).</li>
	<li>Retirer lentement le plasma riche en plaquettes (surnageant) avec une pipette dans une armoire de sécurité biologique et soigneusement le transférer dans un tube conique de 15 mL. Transférer le volume riche en plaquettes de chaque vacutainer dans un tube conique unique afin d’éviter les éventuel Croix-activation. NOTE : Isolement plaquettaire doit être effectuée sous une hotte pour prévenir la contamination bactérienne et plaquettes artificielles potentiels et/ou l’activation endothéliale de sécurité biologique.</li>
	<li>Centrifuger les tubes coniques à 900 x g pendant 10 min à 24 ° C (température ambiante) pour granuler les plaquettes.</li>
	<li>Pipette et jeter le surnageant pauvre en plaquettes.</li>
	<li>Laver le culot soigneusement avec 1 mL de tampon (CGS) de glucose-citrate de sodium (pH 7.0 120 mM chlorure de sodium, citrate de sodium de 13 mM et 30 mM D-glucose). NOTE : Les plaquettes paraîtra dans les formations de type feu follet quand le tampon de la CGS est ajouté et le culot est resuspendu doucement. Dans les échantillons contaminés par l’activation des plaquettes, les plaquettes ne seront pas facilement remettre en suspension et apparaîtront grumeleux.</li>
	<li>Une fois entièrement remises en suspension, centrifuger les échantillons à 900 x g pendant 10 min à 24 ° C (température ambiante).</li>
	<li>Retirer le tampon de lavage CGS et Resuspendre le culot dans 3 mL de tampon de Tyrode (chlorure de sodium 138 mM, 5,5 mM D-glucose, 12 mM bicarbonate de sodium, chlorure de potassium de 2,9 mM et 0,36 mM phosphate dibasique de sodium, pH 7,4). Assurer la complète remise en suspension des plaquettes et, si les agrégations sont observées, jeter l’échantillon.</li>
	<li>Ajouter 1,5 µL d’une solution mère de DiOC6 (dissoudre 57,25 mg dans 5 mL de méthanol) de 20 mM dans chaque tube conique de 3 mL de plaquettes lavées pour une concentration finale de 1 µM. Remarque : DIOC6 est un colorant fluorescent mitochondrial vert, utilisé dans cette expérience aux plaquettes de l’étiquette.</li>
	<li>Aliquote 1 mL de la solution des plaquettes lavées à trois tubes de microcentrifuge de 1,5 mL. Remarque : Le volume plaquettaire requis pour cette expérience est calculé selon la taille de la chambre de flux, la contrainte de cisaillement souhaitée et la durée de l’expérience (étape 6.5). Ce protocole peut être réglé que les conditions changent pour s’assurer qu’il n’y a assez de volume pour l’écoulement du fluide.</li>
	<li>Utiliser des plaquettes lavées après 2 h d’isolement.</li>
</ol>6. débit appareil Assemblée
<ol><li>Fixez un morceau de 70 cm de tuyau (diamètre intérieur de 1,6 mm) à un connecteur Luer de coude mâle à une extrémité et un adaptateur de verrouillage Luer femelle à l’autre de silicone stérile.</li>
	<li>Branchez l’adaptateur de verrouillage Luer femelle attachée au tuyau à une seringue de 20 mL.</li>
	<li>Répétez les étapes 6.1 et 6.2 deux fois pour générer les trois raccords de seringue-conduite identiques.</li>
	<li>
Un pousse-seringue permet de générer des flux de fluide. Entrez les paramètres suivants dans le pousse-seringue : diamètre intérieur de la seringue et le débit. Remarque : Une seringue de 20 mL a un diamètre intérieur de 19,55 mm. Le débit est calculé sur la taux de cisaillement désiré/cisaillement et les dimensions de la chambre de flux. Pour la chambre de flux utilisée dans la présente étude, pour atteindre 1 dyn/cm2 (observées à faible cisaillement veineux), il faut un débit de 9,37 µL/min. En raison de preuves liant les histones de la thrombose veineuse profonde, un cisaillement veineux modéré de 4,45 dynes/cm2 est sélectionné. Cela repose aussi sur l’hypothèse que la mémoire tampon a une viscosité semblable à l’eau. Le débit est alors égal à 41,7 µL/min. équations permettant de calculer que le débit pour différentes dimensions de chambre de flux peut être trouvé à :<ol>
<li>Mettre la pompe de retirer le liquide à l’aide de l’option de bouton sur le pousse-seringue.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Charger les trois seringues attachés à un tube sur le pousse-seringue et serrez les crochets entourant les seringues et les plongeurs.</li>
	<li>Attacher un coude mâle Luer aux deux extrémités d’un deuxième morceau de 20 cm de tube silicone stérile.</li>
	<li>Connecter un coude Luer à une aiguille de calibre 18 émoussée.</li>
	<li>Répéter deux fois, créant trois systèmes d’admission identique pour les trois voies de la chambre de flux. Remarque : Le tube de silicone et les Luers peuvent être lavés avec 10 % de Javel suivie de l’eau distillée avant des réutiliser. Il n’est pas recommandé de réutiliser les chambres de l’écoulement.</li>
</ol>7. microscope paramètres
<ol><li>Utiliser un microscope de disque rotatif équipé d’un stade entièrement automatisé. Réaliser un éclairage avec le lancement d’un laser qui fournit 405, 458, 491, 543 et lignes de laser 633 nm. Capturer toutes les images avec un objectif 20 X. Ajuster tous les paramètres avec le logiciel d’analyse (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).</li>
	<li>Sélectionnez les paramètres de canal (filtre d’émission : 520/35), avec une excitation à 491 nm, pour l’acquisition. Définir l’électron multipliant dispositif à couplage de charge pour un gain d’électron-multipliant de 150, avec un temps d’exposition de 200 ms, pour obtenir la plage dynamique complète. Remarque : Les plaquettes sont pourvus d’un colorant fluorescent vert, DiOC6, avec des maxima de longueur d’onde (excitation, 482 nm ; émission, 504 nm).</li>
	<li>Ajuster la puissance du laser 491 nm à 20 %.</li>
	<li>Marquer le centre de toutes les trois voies et sélectionnez 1 μm pour la gamme z et 0,5 μm pour la taille de palier. Sélectionnez le nombre de points dans le temps (i.e., durée) et le temps entre les images (c.-à-d. dans un intervalle) pour capturer une image toutes les 10 s ; Sélectionnez « 60 points dans le temps » par diapositive. Régler le microscope à capturer des images des trois voies et les enregistrer dans un dossier désigné experiment. Remarque : Parce que la chambre de flux a trois voies, le microscope devra alterner entre trois positions pour capturer les images.</li>
</ol>8. du VWF-plaquettes chaîne Formation
<ol><li>Retirer le milieu de culture de la chambre de flux (de l’étape 4) en utilisant la même technique qu’à l’étape 4.4.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de l’histamine (25 µM), PMA (100 nM), UH, HK ou HR (tous à 25 µg/mL) dilué dans un milieu sans sérum (comme dans l’étape 1.4) pour stimuler la monocouche BOEC pendant 15 min à température ambiante et ambiant O2/co2. Remarque : Bien que pas nécessaire pour la libération VWF, effectuant cette stimulation à 37 ° C s’améliorera VWF exocytose27.</li>
	<li>Veiller à ce que l’une des trois voies séparées de la chambre de flux restent non traitées comme un contrôle expérimental.</li>
	<li>Enlever le support à l’aide d’une seringue de 1 mL et remplacez-le par 100-200 µL de PBS pour laver les sécrétagogues hors de la monocouche endothéliale.</li>
	<li>Monter la chambre flow sur un support de diapositive à l’aide de clips vasculaires pour garantir la chambre en place.</li>
	<li>Attacher le Luer mâle disponible sur l’extrémité de la tubulure de 70 cm (reliée à la seringue) vers le réservoir de la chambre de flux. Répétez pour les deux autres flux chambre voies.</li>
	<li>Démarrer la pompe seringue pour enlever le lavage de PBS. Pipette PBS supplémentaires dans le réservoir de chambre de flux adverse pour s’assurer que les voies pas fonctionner à secs.</li>
	<li>Observer le système de flux pour débit équivalent à travers tous les trois voies et puis mettez en pause le pousse-seringue.</li>
	<li>Sélectionnez une zone pour capturer les images dans le milieu de chaque couloir, dans à peu près la même zone entre les expériences. Remarque : La personne qui conduisait le microscope peut être aveuglée les conditions expérimentales. Cette étape garantit que le microscope se concentre avant écoulement plaquettaire (voir étape 7).</li>
	<li>Fixez un raccord luer femelle<a> </a>à une seringue de 5 mL, puis au connecteur luer mâle libre (étape 6,8) et submerger l’aiguille mitigée dans le tube de microtubes de 1,5 mL contenant la solution de plaquettes lavées (point 5.13). Lentement, dessiner la solution de plaquettes par l’intermédiaire de la tubulure de n’assurer aucune bulle d’air au sein du système.</li>
	<li>Retirez la seringue de 5 mL et fixez le Luer mâle vers le réservoir ouvert de la chambre de flux. Répétez pour les trois voies.</li>
	<li>Redémarrer la pompe seringue et capturer des images durant l’écoulement de plaquettes utilise les paramètres de microscope et protocole de l’étape 7 pour 10 min dans l’obscurité.</li>
	<li>Après 10 min, débrancher le tuyau d’aspiration sur le réservoir de chambre de flux de la Luer et remplir le réservoir avec du PBS pour maintenir le flux au cours de la monocouche endothéliale.</li>
</ol>9. VWF-plaquettes String Quantification
Remarque : Le flux continu de PBS est nécessaire pour maintenir l’allongement de chaîne de VWF-plaquettes pour l’analyse de l’image. Cessation de l’écoulement se traduira par le VWF devenant globulaire et compromettra quantification de chaîne de VWF-plaquettaire. Il est essentiel de compléter chaque réservoir avec du PBS lors de la capture de l’image. HBSS peut remplacer PBS si le rétrécissement de la cellule ou de détachement est observée au cours de cette étape.
<ol><li>En commençant par la première voie, capturer des 10 images par lame sans chevauchement à l’aide d’une lentille d’objectif 20 X vers le milieu de la diapositive. Répétez cette procédure pour chaque voie. Remarque : Les zones entourant les réservoirs doivent être évitées en raison de la contrainte de cisaillement turbulente.</li>
	<li>À l’aide de logiciels de traitement d’image, régler la luminosité en cliquant sur « Image », « Adjust » et « Luminosité/contraste. » Faites glisser la barre de défilement jusqu'à ce que les plaquettes adhérentes peuvent être consultés suffisamment bien pour la quantification.</li>
	<li>Enregistrer une chaîne de VWF-plaquettes lorsque trois ou plusieurs plaquettes alignées sont observés dans l’image. Compter toutes les ficelles du VWF-plaquettes dans une image. Répétez pour tous les 10 images et la moyenne pour l’expérience. Remarque : La personne qui effectue la quantification peut être aveuglée les conditions expérimentales. Il n’est pas nécessaire de colorer conjointement de VWF, comme cela a été confirmé par des études indépendantes8,28,29.</li>
	<li>Réitérer l’expérience au moins trois fois pour évaluer chaque sécrétagogue.</li>
</ol>

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Alors que la pertinence physiologique de VWF-plaquettes cordes reste controversé en raison de leur dissolution rapide en présence de la protéase clivant de VWF ADAMTS13, ils servent de modèle quantifiables in vitro du recrutement de plaquettes de VWF vers un site au qui un thrombus peut former en présence de localisé des augmentations histone niveaux5. En outre, dans les pathologies dénuées d’ADAMTS13 telle activité comme le purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT) - ou dans des micr...

La thrombose est des principales causes de mortalité dans le monde1 et peut se développer en réponse todysregulated plaquettaire d’activation et de thrombine génération dans les deux artères veinsand. Des niveaux de plasma de VWF sont un régulateur clé de coagulation du sang, auquel cas les niveaux bas (< 50 %) causer le trouble de la coagulation dite von Willebrand disease (maladie de von Willebrand)2 et niveaux élevés (> 150 %) sont associés à un risque accru de veineux3 et thrombose artérielle4 .
VWF est une glycoprotéine multimère synthétisée par les cellules endothéliales et les mégacaryocytes et stockées dans les granules α plaquettaire et WPBs, respectivement. Après provocation hémostatique, VWF peut être libéré de WPBs endothéliales pour attacher des plaquettes circulantes des cellules endothéliales activées5 ou collagène exposée sur le mur de navire6. Ancrage du VWF aux cellules endothéliales s’est avéré être médiée par la P-sélectine7 et intégrine αvβ38. La libération subséquente de plaquettes granules α magasins pouvez encore accroître les concentrations de VWF localisées pour stabiliser les interactions plaquettes plaquettes pour la formation de bouchon plaquettaire, l’échafaudage nécessaire pour la propagation de la cascade de coagulation et de la fibrine dépôts. L’activité de liaison plaquettaire du VWF est régie par sa structure multimériques, avec multimères de poids moléculaire élevé possédant une plus grande activité hémostatique9,10. En circulation, le VWF agit également comme un support pour le facteur VIII de coagulation.
Fluide de cisaillement est un régulateur essentiel de la physiologie VWF. En l’absence de contrainte de cisaillement, VWF existe sous une forme globulaire, dissimulant des domaines de liaison pour la glycoprotéine plaquettaire Ib adhérence11. Lorsque la contrainte de cisaillement est présente, le site de clivage pour une métalloprotéase, un disintegrin et métalloprotéase avec motif thrombospondine (ADAMTS13), est exposé. ADAMTS13 Clive chaînes VWF nues et décorés en plaquettes pour réguler la taille des multimères, réduisant ainsi son activité hémostatique12.
VWF est une protéine de phase aiguë, et de nombreux stimuli, notamment hypoxie13infection14et des cytokines pro-inflammatoires, auraient dû être divulgués à la médiation de sortie VWF des cellules endothéliales. Semblable à d’autres agents inflammatoires, histones extracellulaires ont également montrés pour induire la libération systémique de VWF souris15,16 et l’activation des plaquettes in vitro17,18, 19. cela a été montré à dépendre de sous-type d’histone, que les différences en lysine et teneur en arginine peut influencer la fonction15. Notre étude vise à établir une chambre à flux modèle pour étudier l’influence des riches en lysine (HK) et riches en arginine sous-types d’histone (HR) et sécrétagogues sur des rejets VWF endothéliales et des plaquettes en temps réel de capture, éventuels événements précoces l’inflammation induite par la thrombose.
Cette méthodologie de chambre de flux récapitule en vivo interactions entre collagène sous-endothélial, cellules endothéliales, du VWF et plaquettes dans un système in vitro qui est visuel, reproductible et quantifiables. Il permet l’évaluation en temps réel de tous les aspects de la voie qui régule les interactions du VWF-plaquettes, dont la sécrétion WPB, l’activation plaquettaire et protéolyse VWF. Études de VWF dans des conditions contrôlées de cisaillement ont été utilisés pour évaluer les mutations VWD qui nuisent communiqué de VWF et plaquettes-liaison fonction20, WPB physiologie21et clivage VWF par ADAMTS135. Nous utilisons cette méthode pour quantifier la formation de chaîne de VWF-plaquettes suite à un stimulus inflammatoire : histones extracellulaires.

<table><tbody><tr><td>Histones non fractionnées veau-thymus (UH)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>HLY</td><td>Reconstitué en milieu sérum réduit (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>Histostones riches en lysine veau-thymus (HK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5505</td><td>Reconstitués en milieu sérum réduit (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>Histones riches en arginine veau-thymus (HR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4830</td><td>Reconstitués en milieu sérum réduit (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>Reconstitué dans DMSO (20 mM)</td></tr><tr><td>Histamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125-1G</td><td>Reconstitué dans l’eau (50 mg/mL)</td></tr><tr><td>3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td><td>Invitrogen</td><td>D273</td><td>Reconstitué dans du méthanol (20 mM)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-revêtement VWF de lapin</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>Pour VWF ELISA</td></tr><tr><td>Anticorps de détection anti-VWF de lapin, HRP conjugué</td><td>DAKO</td><td>P0026</td><td>Pour le test ELISA VWF et le test de liaison histone-VWF</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp à fond plat 96 puits</td><td>eBioscience</td><td>44-2404-21</td><td>Pour le test de liaison histone-VWF</td></tr><tr><td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>3855</td><td>Pour VWF ELISA</td></tr><tr><td>Humate-P</td><td>CSL Behring</td><td>N/A</td><td>Plasma humain dérivé du plasma Facteur de von Willebrand/facteur VIII</td></tr><tr><td>Plasma de référence normal</td><td>Precision BioLogic</td><td>CCNRP-05</td><td>Pour VWF ELISA Courbe standard</td></tr><tr><td>O-Phénylènediamine dichlorhydrate (OPD)</td><td>réactif Sigma-Aldrich</td><td>P8287</td><td>Produit équivalent disponible auprès de ThermoFisher Scientific (Numéro de catalogue : 34006)</td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Pour la culture et la mise en culture initiale ensemencement de BOEC</td></tr><tr><td>Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Collagène à queue de rat de type 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I Milieu sérique réduit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Pour les stimulations de cellules endothéliales</td></tr><tr><td>METAMORPH Microscopie Logiciel d’automatisation et d’analyse d’images</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de prélèvement sanguin BD Vacutainer, sans additif</td><td>BD Biosciences</td><td>366703</td><td></td></tr><tr><td>&micro ;-Slide III 0.1 (chambres d’écoulement)</td><td>Ibidi</td><td></td><td>Ce produit n’est plus fabriqué. Nous vous suggérons d’utiliser la diapositive VI 0.1 (#80661) ou 0.4 (# 80601) et de recalculer le débit et le volume plaquettaire nécessaires pour maintenir une contrainte de cisaillement de 4,45 dyn/cm2 Tube en</td></tr><tr><td>silicone 1,6 mm ID : 5 m, stérilisé</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur Luer Lock Femelle : polypropylène naturel, stérilisé</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur Luer coudé mâle : polypropylène blanc, stérilisé</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 18G émoussée</td><td>BD Biosciences</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>Seringues de 20 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Pousse-seringue</td><td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Quorum WaveFX- 4X1 microscope à disque rotatif</td><td>Quorum Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de traitement d’image</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

enquêter sur von willebrand facteur physiopathologie en utilisant un modèle de chambre d’écoulement de von willebrand factor-plaquettes string formation

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Le facteur von Willebrand (VWF) est un facteur de coagulation de glycoprotéine multimère qui intervient dans l’adhésion des plaquettes et agrégation sur les sites des lésions endothéliales et qui transporte le facteur VIII dans la circulation. VWF est synthétisé par les cellules endothéliales et est libéré soit constitutivement dans le plasma ou est stocké dans des organites spécialisés, appelés corps de Weibel-Palade (WPBs), à la demande de libération en réponse au défi hémostatique. Procoagulant et pro-inflammatoires des stimuli peuvent induire rapidement l’exocytose WPB et libération VWF. La majorité du VWF libéré par les cellules endothéliales circule dans le plasma ; Toutefois, une proportion de VWF est ancrée à la surface des cellules endothéliales. Dans des conditions de cisaillement physiologique, endothéliales ancrées VWF peut lier aux plaquettes, formant une chaîne de VWF-plaquettaire qui peut-être représenter le nidus de la formation du thrombus. Un système de chambre de flux permet d’observer visuellement la libération de VWF des cellules endothéliales et les plaquettes ultérieures capturer de manière reproductible et adaptée à la physiopathologie de la formation du thrombus par l’intermédiaire du VWF. En utilisant cette méthode, les cellules endothéliales sont cultivés dans une chambre à flux et sont stimulés par la suite avec les sécrétagogues induire l’exocytose WPB. Plaquettes lavées sont ensuite perfusés sur l’endothélium activé. Les plaquettes sont activés et par la suite se lient à des chaînes de VWF allongées dans le sens d’écoulement du fluide. Utilisant des histones extracellulaires comme un stimulus procoagulant et pro-inflammatoires, nous avons observé de formation de chaîne de VWF-plaquettes accrue sur les cellules endothéliales histone traités par rapport aux cellules endothéliales non traitées. Ce protocole décrit une évaluation quantitative et visuelle en temps réel de l’activation des interactions de VWF-plaquettes dans des modèles de thrombose et hémostase.

Pour évaluer directement l’effet des histones sur la libération VWF de cellules endothéliales, nous avons exposé BOECs anastomosés au milieu sans sérum contenant PMA (contrôle positif), UH, RH et HK pendant 2 h. Nous avons montré que HK a induit une augmentation de 2 fois en protéines VWF (VWF:Ag) au milieu des cellules endothéliales traitées (Figure 1). Fait intéressant, lorsque BOECs sont stimulées avec UH et RH, il a été moins VWF:Ag détectée dans le milie...

Dans cet article, nous décrivons une méthode pour évaluer endothéliales von Willebrand libération du facteur et les plaquettes suivantes de saisie sous la contrainte de cisaillement fluide en réponse à des stimuli inflammatoires à l’aide d’un système de chambre in vitro flux.

Enquêter sur von Willebrand facteur physiopathologie en utilisant un modèle de chambre d’écoulement de von Willebrand Factor-plaquettes String Formation

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

L'objectif général de cette procédure est d'observer et de quantifier la formation de chaînes de facteur de von Willebrand ou VWF-plaquettes en réponse à des sécrétagogues. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du facteur de von Willebrand et en physiopathologie des corps wavo-palliatifs. Elle nous aide également à répondre à des questions concernant les mutations qui altèrent la libération du facteur de von Willebrand et sa fonction de liaison aux plaquettes.Le principal avantage de cette technique est qu'elle reproduit les interactions in vivo entre le collagène sous-endothélial, les cellules endothéliales, le facteur de von Willebrand (VWF) et les plaquettes dans un système in vitro visuel et quantifiable. Je pense que la démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Les étapes de microscopie nécessaires pour capturer la formation de chaînes VWF-plaquettes dans plusieurs conditions simultanées en temps réel peuvent être difficiles à maîtriser par la seule lecture d'un texte.Commencez par charger 0,5 millilitre de tampon de revêtement au collagène dans une seringue de 1 millilitre à embout Luer lock. Vissez l'extrémité de la seringue sur le réservoir d'une lame de chambre d'écoulement et appuyez lentement sur le piston jusqu'à ce que toute la voie soit recouverte et que chaque réservoir soit rempli. Complétez le niveau des réservoirs afin de vous assurer qu'ils sont tous pleins.Lorsque toutes les voies ont été chargées, incuber la chambre à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le jour suivant, utiliser une pipette de 200 microlitres pour éliminer le tampon de revêtement au collagène. Rincer ensuite chaque voie avec du HBSS, en aspirant la solution saline à l’aide d’une pipette de 200 microlitres.Après avoir éliminé le troisième rinçage avec du HBSS, ajouter environ trois fois 10 à la puissance 6 cellules endothéliales issues du sang par millilitre dans 100 microlitres de milieu de croissance, supplémenté avec 10 % de FBS, dans chaque canal de la chambre à flux. Puis replacer la chambre dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures, en changeant le milieu toutes les huit à douze heures. Pour monter le dispositif de flux, fixer d’abord un raccord luer mâle coudé à une extrémité de chacun des trois morceaux de tube en silicone stérile de 70 centimètres.Et fixez un raccord femelle à verrouillage par filetage sur l'autre extrémité de chaque tube. Connectez les raccords femelles à verrouillage par filetage à des seringues individuelles de 20 millilitres et programmez la pompe à seringue. Chargez les seringues sur la pompe et fixez solidement les supports autour des seringues et des pistons.Ensuite, fixer un raccord coudé mâle luer à chaque extrémité de trois morceaux distincts de 20 centimètres de tube en silicone stérile, puis relier une aiguille émoussée de calibre 18 à l'un des deux raccords coudés luer de chacun des trois tubes. Puis, sur un microscope à disque tournant équipé d'une platine entièrement automatisée, sélectionner l'objectif 20x et régler les paramètres de canal appropriés. Pour obtenir la plage dynamique complète des données, régler le dispositif d'accumulation de charge à multiplication électronique sur un gain de multiplication électronique de 150 avec un temps d'exposition de 200 millisecondes.Régler la puissance du laser de 491 nanomètres à 20 % et utiliser le logiciel du microscope pour marquer le centre des trois pistes. Définir la plage Z à 1,0 micromètre et la taille du pas à 0,5 micromètre. Enfin, choisir la durée et l'intervalle pour capturer une image toutes les 10 secondes sur 60 points temporels par lame.Pour induire la formation de chaînes VWF-plaquettes, remplacer le milieu de culture de trois voies de la chambre à écoulement par du milieu sans sérum, servant de témoin, puis ajouter le stimulateur d'intérêt dilué dans 100 microlitres de milieu sans sérum dans les voies supplémentaires. Incuber ensuite la chambre pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de la période de stimulation, rincer les trois voies avec 100 à 200 microlitres de PBS et utiliser des pinces vasculaires pour fixer la chambre à écoulement sur un support pour lame.Relier un embout mâle luer provenant de l'extrémité d'un tube de 70 centimètres à chaque réservoir de la chambre d'écoulement. Démarrer la pompe à seringue pour éliminer le lavage au PBS. Ajouter du PBS supplémentaire à l’aide d’une pipette dans le réservoir de la chambre d’écoulement opposée afin de s'assurer que les canaux ne s'assèchent pas.Une fois l'écoulement équivalent confirmé, arrêter la pompe à seringue. Fixer une seringue de 5 millilitres équipée d'un raccord femelle à verrouillage luer sur le premier raccord mâle luer libre. Plonger ensuite l'aiguille émoussée dans un tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre contenant une solution de plaquettes lavées marquées au fluorochrome.Aspirez lentement la solution de plaquettes à travers le tube pour vous assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air dans le système. Fixez le raccord mâle Luer au réservoir ouvert de la chambre d'écoulement, puis chargez les deux autres voies avec la solution de plaquettes, comme vient de l'être démontré. Vérifiez le montage du système d'écoulement afin de vous assurer que toutes les connexions sont bien sécurisées.Redémarrez la pompe à seringue et observez le flux de plaquettes pendant 10 minutes à l’obscurité. Ensuite, débranchez le raccord luer du tube d’entrée sur le réservoir de la chambre d’écoulement. Puis remplissez le réservoir avec du PBS afin de maintenir un flux doux de solution saline sur la monocouche de cellules endothéliales.Pour quantifier la formation de chaînes VWF-plaquettes, capturer 10 images par lame provenant de chaque canal sans chevauchement, à partir du milieu de la lame. Une fois toutes les images obtenues, ouvrez le logiciel de traitement d'images et cliquez sur image, ajuster, puis luminosité-contraste. Pour ajuster la luminosité de la première image, faites glisser la barre de défilement jusqu'à ce que les plaquettes adhérentes puissent être visualisées suffisamment bien pour la quantification.Ensuite, enregistrer une chaîne VWF-plaquettes lorsqu'au moins trois plaquettes alignées sont observées, puis dénombrer toutes les chaînes présentes sur l'image. Après l'initiation des conditions d'écoulement, les cellules non traitées présentent très peu de chaînes VWF-plaquettes par rapport aux cellules traitées au chlorure d'histamine ou à la PMA, qui affichent en moyenne deux à trois chaînes par champ observé.De plus, les histones, qui activent les plaquettes ainsi que les cellules endothéliales, induisent la formation de chaînes VWF-plaquettes plus nombreuses que celles observées dans les témoins non traités, ou stimulés par l'histamine ou par le PMA. Lors de la réalisation de cette procédure, maintenir les plaquettes en état de quiescence jusqu'à l'expérience sous flux en éliminant le premier tube de prélèvement sanguin, en conservant tous les réactifs à température ambiante et en utilisant une technique de pipetage douce. Des modifications peuvent être apportées à cette procédure afin d'évaluer la formation de chaînes VWF-plaquettes en présence de leucocytes, d'agents activateurs des plaquettes, ou de la dissolution des chaînes par l'enzyme de clivage ADAMTS13.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment évaluer la formation de chaînes VWF-plaquettes induite par des sécrétagogues et le modèle in vitro de chambre à écoulement.

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