Enquêter sur von Willebrand facteur physiopathologie en utilisant un modèle de chambre d’écoulement de von Willebrand Factor-plaquettes String Formation

L’objectif global de cette procédure est d’observer et de quantifier la formation du facteur de von Willebrand ou de la chaîne plaquettaire VWF en réponse aux sécrétagogues. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie des facteurs de Von Willebrand et en physiopathologie corporelle wavo-palliative. Cela nous aide également à répondre aux questions sur les mutations qui altèrent la libération du facteur de von Willebrand et la fonction de liaison plaquettaire.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle récapitule les interactions in-vivo entre le collagène sous-endothélial, les cellules endoétholiales VWF et les plaquettes dans un système in-vitro visuel et quantifiable. Je pense que la démonstration visuelle de cette méthode est vitale. Les étapes de microscopie requises pour capturer la formation de la chaîne de plaquettes VWF dans plusieurs conditions simultanées en temps réel peuvent être difficiles à maîtriser par le texte seul.

Commencez par charger 0,5 millilitre de tampon d’enrobage de collagène dans une seringue Luer Lock de 1 millilitre. Tournez l’extrémité de la seringue sur le réservoir d’une glissière de chambre d’écoulement et appuyez lentement sur le piston jusqu’à ce que toute la voie soit recouverte et que chaque réservoir soit plein. Faites le plein des réservoirs pour vous assurer qu’ils sont pleins.

Lorsque toutes les voies ont été chargées, incubez la chambre à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, utilisez une pipette de 200 microlitres pour retirer le tampon d’enrobage de collagène. Rincez ensuite chaque voie avec du HBSS, en aspirant la solution saline avec une pipette de 200 microlitres.

Une fois que le troisième cycle de HBSS a été jeté, ajoutez environ trois fois 10 à la 6e cellule endothéliale de croissance sanguine par millilitre dans 100 microlitres de milieu de croissance, complété par 10 % de FBS à chaque voie de la chambre d’écoulement. Ensuite, remettez la chambre dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures, en changeant de milieu toutes les huit à 12 heures. Pour assembler l’appareil d’écoulement, fixez d’abord un connecteur Luer coudé mâle à l’une des extrémités de chacun des trois morceaux de 70 centimètres de tube en silicone stérile.

Et fixez un adaptateur Luer Lock femelle à l’autre extrémité de chaque tube. Connectez les adaptateurs Luer Lock femelles à des seringues individuelles de 20 millilitres et programmez le pousse-seringue. Chargez les seringues sur la pompe et fixez fermement les supports autour des seringues et des pistons.

Ensuite, fixez des luers de coude mâles individuels aux deux extrémités de trois morceaux différents de 20 centimètres de tube en silicone stérile, et connectez une aiguille de calibre 18 émoussée à l’un de chacun des trois luers de coude. Ensuite, sur un microscope à disque rotatif équipé d’une platine entièrement automatisée, sélectionnez l’objectif 20x et réglez les paramètres de canal appropriés. Pour obtenir la plage complète de données dynamiques, réglez le dispositif couplé à la charge multiplicatrice d’électrons sur un gain multiplicateur d’électrons de 150 avec un temps d’exposition de 200 millisecondes.

Ajustez la puissance laser de 491 nanomètres à 20 % et utilisez le logiciel du microscope pour marquer le centre des trois voies. Réglez la plage Z sur 1,0 micromètre et la taille du pas sur 0,5 micromètre. Enfin, sélectionnez la durée et l’intervalle pour capturer une image toutes les 10 secondes à 60 points temporels par diapositive.

Pour induire la formation de chaînes plaquettaires VWF, remplacer le milieu de culture à partir de trois voies de la chambre d’écoulement, avec le milieu sans sérum seul comme contrôle, puis le stimulant d’intérêt dilué dans 100 microlitres de milieu sans sérum vers les voies supplémentaires. Ensuite, incubez la chambre pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de la période de stimulation, lavez les trois voies avec 100 à 200 microlitres de PBS et utilisez des clips vasculaires pour cartographier la chambre d’écoulement sur un support de diapositive.

Fixez un connecteur Luer mâle à partir de l’extrémité d’un morceau de tube de 70 centimètres à chaque réservoir de la chambre d’écoulement. Et démarrez le pousse-seringue pour retirer le lavage PBS. Pipetez du PBS supplémentaire dans le réservoir de la chambre d’écoulement opposée pour vous assurer que les voies ne fonctionnent pas à sec.

Une fois que le débit équivalent est confirmé, mettez le pousse-seringue en pause. Fixez une seringue de 5 millilitres avec un coupleur Luer Lock femelle au premier connecteur Luer mâle libre. Et immergez l’aiguille émoussée dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant une solution de plaquettes lavées étiquetées fluorescentes.

Lentement, aspirez la solution plaquettaire à travers le tube pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le système. Fixez le luer mâle au réservoir ouvert de la chambre d’écoulement et chargez les deux autres voies avec une solution plaquettaire, comme cela vient d’être démontré. Vérifiez la configuration du système de flux pour vous assurer que toutes les connexions sont sécurisées.

Redémarrez le pousse-seringue et imagez le flux de plaquettes pendant 10 minutes dans l’obscurité. Débranchez ensuite le Luer de la tubulure d’admission sur le réservoir de la chambre d’écoulement. Et remplissez le réservoir de PBS pour maintenir un léger écoulement salin sur la monocouche de cellules endothéliales.

Pour quantifier la formation de la chaîne de plaquettes VWF, capturez 10 images par diapositive à partir de chaque voie sans chevauchement à partir du milieu de la diapositive. Lorsque toutes les images ont été obtenues, ouvrez le logiciel de traitement d’image et cliquez sur image, ajuster et contraste de luminosité. Pour régler la luminosité de la première image, faites glisser la barre de défilement jusqu’à ce que les plaquettes adhérentes puissent être visualisées suffisamment bien pour la quantification.

Ensuite, enregistrez une chaîne de plaquettes VWF lorsque trois plaquettes alignées ou plus sont observées et comptez toutes les chaînes de l’image. Après l’initiation des conditions d’écoulement, les cellules non traitées présentent très peu de chaînes plaquettaires VWF par rapport aux cellules traitées à l’histamine ou au PMA. Qui présentent en moyenne deux à trois cordes par champ de vision.

De plus, les histones, qui activent les plaquettes ainsi que les cellules endothéliales, induisent la production de plus de chaînes plaquettaires VWF que les témoins non traités, ou stimulés par l’histamine, ou la PMA. Pendant que vous tentez cette procédure, gardez les plaquettes au repos jusqu’à l’expérience d’écoulement en jetant le premier tube de prélèvement sanguin, en maintenant tous les réactifs à température ambiante et en utilisant une technique de pipette douce. Des modifications peuvent être apportées à cette procédure pour évaluer la formation de la chaîne plaquettaire VWF en présence de leucocytes, d’agents activateurs plaquettaires ou de dissolution de la chaîne par l’atome d’enzyme de clivage TS13.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la formation de la chaîne de plaquettes VWF induite par le sécrétogogue et le modèle de chambre d’écoulement in vitro.