Numérisation Retroviral: Mapping des sites d'intégration MLV pour définir des régions réglementaires spécifiques à une cellule

L'objectif général de cette procédure est de cartographier les sites d'intégration de vecteurs rétroviraux dérivés du virus de la leucémie murine afin de définir les régions régulatrices spécifiques aux cellules. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les études de thérapie génique et de régulation génique, telles que l'endroit où le vecteur s'intègre dans le génome humain et quels éléments régulateurs peuvent être activement utilisés via un sous-type particulier. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en observant que, dans les études de thérapie génique, les vecteurs MLV s'intègrent dans des promoteurs et des enhancers actifs et spécifiques à un sous-type.

Commencez par transduire les cellules cibles avec un vecteur rétroviral dérivé du MLV portant le gène rapporteur EGFP et pseudotypé avec la glycoprotéine d'enveloppe VSV-G ou amphrotropique. Les cellules transduites de manière factice servent de contrôle négatif. 48 heures après la transduction, centrifugez les échantillons, puis resuspendez 100 000 cellules dans 300 microlitres de PBS contenant deux pour cent de sérum de veau fœtal.

Ensuite, mesurer l'expression d'EGFP par analyse en cytométrie de flux. Récolter 0,5 à cinq millions d'autres cellules transduites pour la préparation de l'ADN génomique et la digestion ultérieure par enzyme de restriction. Préparer quatre digestions par enzyme de restriction par échantillon dans des tubes de 1,5 millilitre.

Digérez de 0,1 à un microgramme d'ADN génomique dans chaque tube. Ajoutez 10 unités de TRU91 et un microlitre de tampon M par échantillon, pour un volume final de 10 microlitres. Distribuez deux microlitres du mélange dans les tubes de digestion.

Puis incuber les réactions à 65 degrés Celsius pendant six heures ou toute la nuit. Après l'incubation, ajouter 40 microlitres d'eau dans un tube de 1,5 millilitre. Dans le même tube, ajouter 10 unités de PST1 et un microlitre de tampon H par échantillon.

Dispenser 10 microlitres du mélange de réaction de digestion dans les tubes de digestion. Incuber les réactions à 37 degrés Celsius pendant six heures ou toute la nuit. Le lendemain, préparer huit réactions de ligation d'adaptateurs dans des tubes de 1,5 millilitre.

Pour chaque réaction, ajouter le mélange réactionnel de ligase à 10 microlitres d'ADN génomique digéré. Incuber à 16 degrés Celsius pendant trois à six heures. Pour la PCR du premier tour, préparer 48 réactions de PCR dans des tubes de 0,2 millilitre.

Pour chaque PCR, ajouter le mélange réactionnel contenant l'amorce linker et l'amorce MLV3 prime LTR à deux microlitres de la réaction de ligation. Placer les échantillons dans un thermocycleur muni d'un couvercle chauffant. Régler les paramètres de cyclage et effectuer la première étape de réaction PCR.

Pour la PCR du deuxième tour, préparez le mélange de réaction contenant l'amorce interne du linker et l'amorce interne du LTR 3' de MLV. Ensuite, ajoutez deux microlitres du produit de PCR du premier tour comme matrice. Puis, effectuez la réaction de PCR du deuxième tour afin de générer les produits finaux de PCR LN.

Après la PCR du deuxième cycle, rassemblez les 48 réactions de PCR LM imbriquées dans un tube de 15 millilitres. Ajoutez ensuite 20 microlitres de tampon de charge à 100 microlitres du produit PCR LM regroupé et précipité. Chargez ensuite l'échantillon sur un gel d'agarose à un pour cent, en parallèle avec l'échelle d'ADN de 100 paires de bases.

Faites migrer le gel à cinq volts par centimètre pendant 30 à 60 minutes une fois les bandes résolues, puis découpez la partie du gel contenant les amplicons de 500 à 150 paires de bases. Après purification du produit de PCR LM à l’aide d’un kit d’extraction sur colonne, mesurez la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV avant de passer à la préparation de la banque. Évaluez également la longueur des produits de PCR LM à l’aide d’un bioanalyseur, conformément aux instructions du fabricant.

Préparez la banque en mettant en place une PCR d'indexation. Pour chaque PCR, utilisez entre 150 et 170 nanogrammes de produit de PCR LM purifié, avec une combinaison d'index différente pour chaque échantillon. Réalisez la PCR dans un thermocycleur muni d'un couvercle chauffant, comme indiqué.

Après la PCR, diluez la bibliothèque purifiée à 10 nanomolaire avec du Tris HCl 10 millimolaire. Ensuite, mélangez cinq microlitres de la banque diluée avec cinq microlitres de soude 0,2 normal dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Vortexez brièvement, centrifugez puis incubez pendant cinq minutes à température ambiante pour dénaturer les bibliothèques.

Placer les tubes du pool dénaturé sur de la glace et ajouter 990 microlitres de tampon d'hybridation HT1 prérefroidi. Ensuite, aliquoter 300 microlitres du pool dénaturé dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Puis ajouter 300 microlitres de HT1 prérefroidi pour obtenir un pool de bibliothèque final de dix picomolaire.

En parallèle, mélanger 10 nanomolaires de bibliothèque témoin fixée dans un volume de deux microlitres avec 3 microlitres de tris HCl 10 millimolaires dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter cinq microlitres de soude 0,2 newtons et vortexer brièvement. Après une courte centrifugation, incuber cinq minutes à température ambiante pour dénaturer la fixation diluée.

Après l'incubation, placez le tube sur de la glace et ajoutez 990 microlitres de HT1 pré-refroidi. Répartissez ensuite 100 microlitres de fixatif dénaturé en aliquotes dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et ajoutez 300 microlitres de HT1 pré-refroidi afin d'obtenir une concentration finale de 10 picomolaire de fixatif. Enfin, dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, mélangez 510 microlitres du pool de bibliothèque dénaturé avec 90 microlitres de la bibliothèque fixée dénaturée, obtenant ainsi un pool final de 10 picomolaire contenant 15 % de contrôle de fixatif à séquencer.

Cette image montre l'analyse de 3498, 2989 et 4103 groupes de sites d'intégration récurrents du MLV dans les cellules souches progénitrices hématopoïétiques, les progéniteurs érythroïdes et les progéniteurs myéloïdes, respectivement. Dans chaque population cellulaire, plus de 95 % des groupes de MLV se chevauchaient avec des régions régulatrices définies épigénétiquement comme étant des activateurs et des promoteurs. Les régions ciblées spécifiquement par le MLV présentaient une forte acétylation et étaient associées à l'expression spécifique de la cellule du gène ciblé.

Des exemples sont le promoteur du gène SPINK2 spécifique à HSP. La région de contrôle du locus contenant des activateurs puissants des gènes de globine bêta-like spécifiques aux érythroïdes. Les activateurs situés en amont du gène LYZ spécifique à NPP.

Des tests rapporteurs de luciférase ont validé le sous-ensemble d'enhanceurs ciblés par le MLV spécifiques aux cellules dans les EPP et les MPP. Les régions ciblées par le MLV spécifiques aux érythroïdes présentaient une activité plus élevée dans les EPP que dans les MPP, et inversement, confirmant que le MLV identifie des enhanceurs spécifiques aux cellules pouvant contrôler l'expression des gènes voisins. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maximiser la fréquence des cellules transduites afin d'obtenir une récupération optimale des sites d'intégration. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment cartographier les sites d'intégration virale en ajustant d'abord l'ADN génomique, puis en ligaturant les fragments génomiques avec un brin d'ADN intermédiaire, en amplifiant ensuite la jonction entre le génome viral et l'hôte par PCR-LM, et enfin en séquençant en profondeur la bibliothèque d'amplicons.