Name: Numérisation Retroviral: Mapping des sites dintégration MLV pour définir des régions réglementaires spécifiques à une cellule (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Découvrez le mapping des sites d'intégration rétroviraux MLV pour identifier les régions réglementaires spécifiques aux cellules humaines. Cette méthode optimise les stratégies de thérapie génique.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du Conseil européen de la recherche (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), du Ministère italien de l&#39;éducation, des universités et de la recherche (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), le ministère italien de la Santé (Jeunes chercheurs appelle 2011 GR-2011-02352026) et la Fondation Imagine Institute (Paris, France).

1. Transduction MLV des cellules humaines <ol><li> Isoler les cellules cibles et les transduire avec un vecteur retroviral dérivé de mLV hébergeant le gène rapporteur eGFP et pseudotypé avec le virus de la stomatite vésiculaire G (VSV-G) ou la glycoprotéine de l&#39;enveloppe amphotrope 16 . <ol><li> Gardez les cellules transduites par défaut comme un contrôle négatif pour les analyses suivantes. Puisque les vecteurs rétroviraux à base de mLV peuvent transduire efficacement les cellules en division, culturez la population de cellules cibles dans des conditions qui stimulent la division cellulaire. Les conditions de transduction doivent être spécifiquement optimisées pour chaque type de cellule étudié. La croissance cellulaire et les conditions de transduction pour les progéniteurs hématopoïétiques humains, les lymphocytes T et les cellules épidermiques sont décrites dans les références 7, 14, 15 et 17. </li></ol></li><li> 48 h après la transduction, ré-endiguer 100 000 cellules dans 300 μL de solution salée tamponnée au phosphate (PBS) contenant 2% de sérum bovin fœtal et mesurer l&#39;expression de l&#39;eGFP par fFaible analyse cytométrique (laser d&#39;excitation de 488 nm). Utiliser des cellules transduites simulées comme témoins négatifs. Pour une récupération optimale du site d&#39;intégration, purifiez les cellules GFP + par le tri de cellules activées par fluorescence (FACS). </li><li> Recueillir 0,5 à 5 millions de cellules pour la préparation d&#39;ADN génomique. Une période de culture plus longue (&gt; 7 jours) est préférée pour diluer le provirus non intégré et nécessaire lors de l&#39;analyse de la descendance à long terme de cellules souches de bonne foi (voir la section de discussion et la référence 15 ). Les granulés cellulaires peuvent être congelés instantanément et stockés à -80 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. </li></ol> 2. Amplification des sites d&#39;intégration mLV par PCR par médiateur (LM-PCR) <ol><li> Préparation de l&#39;ADN génomique (ADN gDNA) <ol><li> Extraire gDNA en utilisant un kit d&#39;extraction d&#39;ADN à base de colonne et suivre le protocole pour les cellules cultivées, selon les instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Digestion enzymatique de restrictionsur <ol><li> Mettre en place 4 digestion par enzyme de restriction par échantillon dans des tubes de 1,5 mL. Digérer 0,1 à 1 μg d&#39;ADNg dans chaque tube en ajoutant 1 μL de Tru9I (10U) et 1 μL de tampon M dans un volume final de 10 μL. Incuber les réactions à 65 ° C pendant 6 h ou pendant la nuit. </li><li> Ajouter à chaque réaction 1 μl de PstI (10U), 1 μL de tampon H et 8 μL d&#39;eau. Incuber les réactions à 37 ° C pendant 6 h ou pendant la nuit. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu&#39;à l&#39;utilisation. </li></ol></li><li> Ligature des ligands <ol><li> Préparer une solution mère linker Tru9I à 100 μM dans un tube de 1,5 ml en mélangeant les oligonucleotides de brin plus de fil et linker moins à une concentration de 100 μM. Mettez le tube dans une eau réglée à 100 ° C et laissez-le refroidir à température ambiante. La solution mère linker Tru9I peut être stockée à -20 ° C jusqu&#39;à son utilisation. </li><li> Mettre en place 8 réactions de ligature de linker dans des tubes de 1,5 mL. Pour chaque réaction, ajoutez le composant suivantS à 10 μL de digestion enzymatique de restriction: 1,4 μL de 10X T4 DNA Ligase Reaction buffer, 1 μL de 10 μM de liaison Tru9I, 1 μL (2 000 U) d&#39;ADN ligase T4 et 0,6 μL d&#39;eau. Incuber à 16 ° C pendant 3 à 6 h. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu&#39;à l&#39;utilisation. </li></ol></li><li> Première PCR <ol><li> Mettre en place 48 réactions PCR (6 réactions de chaque tube de ligature) dans des tubes de 0,2 ml. Pour chaque PCR, ajouter les réactifs suivants à 2 μL de réaction de ligature: 5 μL de tampon de PCR 10X, 2 μL de sulfate de magnésium 50 mM, 1 μL de mélange de désoxynucléotide 10 mM (dNTP), 1 μL d&#39;amorce de liaison 10 μM 1 ΜL d&#39;amorce LTR 10 μM mLV-3 &#39;, 0,3 μL (1,5 U) de Taq DNA Polymerase et 37,7 μl d&#39;eau. Les séquences d&#39;amorces sont fournies dans le tableau 1. </li><li> Effectuer la réaction de PCR dans un thermocycleur avec couvercle chauffé, comme suit: 95 ° C pendant 2 min; 25 cycles de 95 ° C pendant 15 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 1 min; 72 °; C pendant 5 min; Maintenez à 4 ° C. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu&#39;à l&#39;utilisation. </li></ol></li><li> Deuxième PCR <ol><li> Mettre en place 48 réactions PCR (1 de chaque tube &quot;première PCR&quot;) dans des tubes de 0,2 ml. Pour chaque PCR, ajouter les composants suivants à 2 μl de la première réaction de PCR: 5 μL de tampon de PCR 10X, 2 μL de sulfate de magnésium 50 mM, 1 μl de mélange de dNTP 10 mM, 1 μL d&#39;amorce imbriquée liant 10 μM, 1 ΜL d&#39;amorce imbriquée LTR de 10 μM mLV-3 &#39;, 0,3 μl de Taq DNA Polymerase (1,5 U) et 37,7 μL d&#39;eau. Utilisez des amorces imbriquées conçues pour la stratégie de séquençage massif spécifique choisie: (i) amorce imbriquée et amorce imbriquée LTR de mLV-3 compatible avec la plate-forme Illumina; (Ii) l&#39;amorce imbriquée et l&#39;amorce imbriquée LTR de mLV-3 &#39;compatible avec la plate-forme Roche. Les séquences d&#39;amorces sont listées dans le tableau 1 . </li><li> Effectuer la réaction de PCR dans un thermocycleur avec couvercle chauffé, comme suit: 95 ° C pendant 2 min; 25Cycles de 95 ° C pendant 15 s, 58 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 1 min; 72 ° C pendant 5 min; Maintenez à 4 ° C. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu&#39;à l&#39;utilisation. </li><li> Associez les 48 réactions de PCR imbriquées dans un tube de 15 mL (volume final de ~ 2,4 mL). Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu&#39;à l&#39;utilisation. </li></ol></li><li> Déterminer la présence et la taille des produits LM-PCR par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. <ol><li> Ajouter 4 μL de tampon de chargement à 20 μL de produits LM-PCR et charger l&#39;échantillon sur un gel d&#39;agarose à 1%, avec une échelle d&#39;ADN de 100 pb. Faire fonctionner le gel à 5 ​​V / cm pendant 30 à 60 min et visualiser les produits de PCR par coloration au bromure d&#39;éthidium. </li><li> Effectuer une réaction LM-PCR à partir de l&#39;échantillon transduit comme un contrôle négatif. </li></ol></li><li> Précipiter les amplicons en ajoutant 0,1 volume de solution d&#39;acétate de sodium (3 M, pH 5,2) et 2,5 volumes d&#39;éthanol à 100%. Mélanger et congeler à -80 ° C pendant 20 min. <ol><li> Rotation à fuVitesse dans une microcentrifugeuse standard à 4 ° C pendant 20 min. Jeter le surnageant et laver la pastille à 70% d&#39;éthanol. Faire tourner à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse standard à 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Jeter le surnageant et sécher à l&#39;air la pastille. Ajouter 200 μl d&#39;eau de qualité PCR et ré-endiguer l&#39;ADN. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu&#39;à l&#39;utilisation. </li></ol></li><li> Ajouter 20 μL de tampon de chargement à 100 μL des produits LM-PCR et charger l&#39;échantillon sur un gel d&#39;agarose à 1%, conjointement avec une échelle d&#39;ADN de 100 pb. <ol><li> Faire fonctionner le gel à 5 ​​V / cm pendant 30 à 60 min et couper la partie du gel contenant des amplicons de 150 à 500 pb. </li><li> Purifier les produits LM-PCR avec un kit d&#39;extraction de gel à base de colonne et mesurer la concentration en utilisant un spectrophotomètre UV. </li></ol></li><li> Utilisez 1 μL de bibliothèque pour évaluer la longueur des produits LM-PCR à l&#39;aide d&#39;un instrument de bioanalyseur, selon les instructions du fabricant. </li><li><sTrong&gt; clonage de fusils de chasse d&#39;amplicons <ol><li> Utiliser 20 ng des produits de LM-PCR purifiés et les cloner dans le vecteur pCR2.1-TOPO, conformément aux instructions du fabricant. </li><li> Effectuer des réactions de séquençage à l&#39;aide de l&#39;amorce M13 Universal, suivie d&#39;une cartographie génomique des séquences résultantes, pour révéler la présence des jonctions virales-génomes (y compris l&#39;amorce imbriquée LTR de mLV-3) dans&gt; 50% des clones pour identifier les échantillons appropriés Pour un séquençage massif. Exemple de jonction du génome viral: <img alt="Jonction" src="/files/ftp_upload/55919/55919junction.jpg" /> L&#39;amorçage imbriqué LTR MLV-3 &#39;454 et l&#39;amorce imbriquée lieur 454 ( tableau 1 ) sont indiqués en gras et l&#39;extrémité 3&#39; de la LTR virale en italique. La séquence génomique humaine est mise en évidence en texte rouge (chr10: 6439408-6439509, hg19). </li></ol></li></ol> 3. Séquençage massif des sites d&#39;intégration mLV REMARQUE: produit LM-PCRLes ucts peuvent être séquencés à l&#39;aide de plates-formes commerciales (en choisissant la paire d&#39;amorces imbriquées appropriée dans la deuxième réaction de PCR, voir la sous-section 2.5.1). Pour le séquençage par la plate-forme pyrosequencing Roche GS-FLX, reportez-vous aux documents précédents 7 , 14 , 15 . Dans cette section, un protocole nouvellement optimisé pour la plate-forme de séquençage Illumina est décrit. <ol><li> Préparation de la bibliothèque <ol><li> Mettre en place 1 réaction de PCR d&#39;indexation par échantillon dans des tubes de 0,2 ml. Pour chaque PCR, ajouter les réactifs suivants à 5 μL (150-170 ng) de produit LM-PCR purifié: 5 μL d&#39;Primer Index 1, 5 μL d&#39;Index Primer 2, 25 μL de 2X Master Mix et 10 μL de PCR- Eau de qualité. Utilisez une combinaison d&#39;index différente pour chaque échantillon. </li><li> Effectuer des réactions de PCR dans un thermocycleur avec couvercle chauffé, comme suit: 95 ° C pendant 3 min; 8 cycles de 95 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s; 72 ° C pendant 5 mdans; Maintenez à 4 ° C. </li><li> Purifier les produits de PCR en utilisant un protocole d&#39;isolement de perles réversibles en phase solide (SPRI): dans de nouveaux tubes de 1,5 mL, ajouter 56 μL de perles à chaque échantillon et procéder conformément aux instructions du fabricant. Eluir dans 25 μL de Tris-HCl 10 mM. Les bibliothèques peuvent être stockées à -20 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. </li></ol></li><li> Vérification de la bibliothèque <ol><li> Utilisez 1 μl d&#39;échantillon pour évaluer la taille de la bibliothèque en utilisant un instrument de bioanalyseur. </li><li> Utiliser 1 μl d&#39;échantillon pour quantifier la molarité de la bibliothèque en utilisant un test de PCR en temps réel à base de fluorescence, conformément aux instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Dilution et séquençage de la bibliothèque <ol><li> Diluer les bibliothèques à 10 nM en utilisant Tris-HCl 10 mM. Pour regrouper des bibliothèques, transférez 5 μL de chaque banque diluée dans un nouveau tube de 1,5 ml puis diluez le bassin à 4 nM dans du Tris-HCl 10 mM. </li><li> Mélanger 5 μL de pool dilué avec 5 μL de NaOH 0,2 N dans un nouveau 1,5 mL, vortex brièvement, centrifuger et incuber pendant 5 min à température ambiante pour dénaturer les bibliothèques. </li><li> Mettez des tubes sur de la glace et ajoutez 990 μl de tampon d&#39;hybridation pré-refroidi (HT1). Aliquoter 300 μL de pool dénaturé dans un nouveau tube de 1,5 ml et ajouter 300 μL de HT1 pré-refroidi pour obtenir un pool de bibliothèque finale de 10 pM. </li><li> En parallèle, mélanger 2 μL de la banque de contrôle PhiX (10 nM) avec 3 μL de Tris-HCl 10 mM dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 5 μL de NaOH 0,2 N, vortex brièvement, centrifuger et incuber pendant 5 min à température ambiante pour dénaturer le PhiX dilué. Mettre le tube sur de la glace et ajouter 990 μl de HT1 pré-refroidi. </li><li> Aliquoter 300 μL de PhiX dénaturé dans un nouveau tube de 1,5 ml et ajouter 300 μL de HT1 pré-refroidi pour obtenir un PhiX final de 10 pM. </li><li> Dans un nouveau tube de 1,5 ml, mélanger 510 μL de pool de bibliothèque dénaturé avec 90 μL de bibliothèque PhiX dénaturée, obtenant ainsi un pool final de 10 pM avec 15% de contrôle PhiX. </li><li> Pipeter ces 600 μl d&#39;échantillonVolume dans le réservoir Load Sample de la cartouche de réactif de séquençage décongelée et procédez immédiatement pour effectuer une exécution de 150 cycles à lecture unique. REMARQUE: Les réactifs critiques et les séquences d&#39;amorces requises pour ce protocole sont listées dans le tableau 1 . </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+enhancers%3A+from+properties+to+genome-wide+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions.</a> Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-enhancers+in+the+control+of+cell+identity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Super-enhancers in the control of cell identity and disease.</a> Cell. 155 (4), 934-947 (2013).</li>
<li>Cattoglio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-definition+mapping+of+retroviral+integration+sites+identifies+active+regulatory+elements+in+human+multipotent+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors.</a> Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).</li>
<li>Biasco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+profile+of+retroviral+vector+in+gene+therapy+treated+patients+is+cell-specific+according+to+gene+expression+and+chromatin+conformation+of+target+cell%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell.</a> EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).</li>
<li>De Ravin, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers+are+major+targets+for+murine+leukemia+virus+vector+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration.</a> J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).</li>
<li>LaFave, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mLV+integration+site+selection+is+driven+by+strong+enhancers+and+active+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters.</a> Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).</li>
<li>Gupta, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromo-+and+extraterminal+domain+chromatin+regulators+serve+as+cofactors+for+murine+leukemia+virus+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration.</a> J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BET+proteins+promote+efficient+murine+leukemia+virus+integration+at+transcription+start+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).</li>
<li>De Rijck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BET+family+of+proteins+targets+moloney+murine+leukemia+virus+integration+near+transcription+start+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites.</a> Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).</li>
<li>Romano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional%2C+epigenetic+and+retroviral+signatures+identify+regulatory+regions+involved+in+hematopoietic+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment.</a> Sci Rep. 6, 24724(2016).</li>
<li>Cavazza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Transcriptional+and+Epigenetic+Regulation+of+Human+Epidermal+Keratinocyte+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation.</a> Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).</li>
<li>Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+helper-free+amphotropic+retroviruses+that+transduce+a+dominant-acting%2C+methotrexate-resistant+dihydrofolate+reductase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene.</a> Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).</li>
<li>Cattoglio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-definition+mapping+of+retroviral+integration+sites+defines+the+fate+of+allogeneic+T+cells+after+donor+lymphocyte+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion.</a> PLoS One. 5 (12), e15688(2010).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+in+patients+with+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Biffi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+benefits+metachromatic+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy.</a> Science. 341 (6148), 1233158(2013).</li>
<li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li>
<li>Gillet, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+genomic+environment+of+the+provirus+determines+the+abundance+of+HTLV-1-infected+T-cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones.</a> Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Ici, nous avons décrit un protocole pour la cartographie génomique des sites d&#39;intégration de mLV, un rétrovirus qui cible les régions de chromatine, marquées épigénétiquement en tant que promoteurs et amplificateurs actifs. Les étapes critiques et / ou les limitations du protocole comprennent: (i) la transduction de mLV de la population de cellules cibles; (Ii) l&#39;amplification des jonctions virus-hôte par LM-PCR; (Iii) récupération d&#39;une fraction élevée des sites d&#39;intégration. Les vecteurs rétroviraux ...

L&#39;identité cellulaire est déterminée par l&#39;expression d&#39;ensembles spécifiques de gènes. Le rôle des éléments cis-régulateurs, tels que les promoteurs et les amplificateurs, est crucial pour l&#39;activation de programmes de transcription spécifiques au type cellulaire. Ces régions réglementaires sont caractérisées par des caractéristiques spécifiques de la chromatine, telles que les modifications particulières des histones, les facteurs de transcription et la liaison des co-facteurs, et l&#39;accessibilité à la chromatine, qui ont été largement utilisés pour leur identification à l&#39;échelle du génome dans plusieurs types de cellules 1 , 2 , 3 . En particulier, le profil génomique de l&#39;acétylation de l&#39;histone H3 lysine 27 (H3K27ac) est couramment utilisé pour définir des promoteurs actifs, des amplificateurs et des super-amplificateurs 4 , 5 , 6 . Le virus de la leucémie murine Moloney (MLV) est un retrovirus gamma largement utilisé pour le gèneTransfert dans des cellules de mammifères. Après avoir infecté une cellule cible, le génome d&#39;ARN rétroviral est rétro-transcrit dans une molécule d&#39;ADN double brin qui se lie aux protéines virales et cellulaires pour assembler le complexe de pré-intégration (PIC). La PIC entre dans le noyau et lie la chromatine de la cellule hôte. Ici, l&#39;intégrase virale, un composant clé PIC, sert à faciliter l&#39;intégration de l&#39;ADN proviral dans le génome de la cellule hôte. L&#39;intégration de mLV dans l&#39;ADN génomique n&#39;est pas aléatoire, mais se produit dans des éléments actifs régulateurs cis, tels que des promoteurs et des amplificateurs, de manière spécifique aux cellules 7 , 8 , 9 , 10 . Ce profil d&#39;intégration particulier est médié par une interaction directe entre l&#39;intégrase de mLV et les protéines de domaine de bromodomane cellulaire et de domaine extraterminal (BET) 11 , 12 , 13 . Les protéines BET (BRD2, BRD3 etBRD4) agissent comme un pont entre la chromatine de l&#39;hôte et la PIC de mLV: à travers leurs bromodomains, ils reconnaissent des régions régulatrices cis cisées, fortement acceptées, tandis que le domaine extraterminal interagit avec l&#39;intégrase de mLV 11 , 12 , 13 . Ici, nous décrivons le balayage rétroviral, un nouvel outil pour mapper les régions actives cis-régulatrices en fonction des propriétés d&#39;intégration de mLV. Brièvement, les cellules sont transduites avec un vecteur rétroviral dérivé de mLV exprimant le gène rapporteur de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP). Après l&#39;extraction de l&#39;ADN génomique, les jonctions entre la répétition terminale de 3 &#39;(LTR) du vecteur mLV et l&#39;ADN génomique sont amplifiées par une PCR médiatisée (LM-PCR) et séquencées massivement. Les sites d&#39;intégration mLV sont mappés au génome humain et les régions génomiques hautement ciblées par mLV sont définies comme des grappes de sites d&#39;intégration mLV. Analyse rétroviraleA été utilisé pour définir des éléments régulateurs actifs spécifiques de cellules dans plusieurs cellules primaires humaines 14 , 15 . Les grappes de mLV ont été co-mappées avec des promoteurs et des amplificateurs définis de manière épigénétique, dont la plupart abritaient des marques d&#39;histones actives, telles que H3K27ac, et étaient spécifiques de cellules. Le balayage rétroviral permet l&#39;identification à l&#39;échelle du génome des éléments de régulation de l&#39;ADN dans les populations de cellules prospectivement purifiées 7 , 14 ainsi que dans les populations de cellules rétrospectivement définies, telles que les cellules souches de kératinocytes, qui ne présentent pas de marqueurs efficaces pour l&#39;isolement prospectif 15 .

<table><tbody><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>ThermoScientific</td><td>10010031</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>ThermoScientific</td><td>16000044</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Tubes de 0,2 ml</td><td>fournisseur général de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml fournisseur</td><td></td><td></td><td>général de laboratoire</td></tr><tr><td>QIAGEN QIAmp Mini Kit d’ADN&nbsp ;</td><td>QIAGEN</td><td>51306</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase&nbsp ;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Tampon de réaction</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Linker Plus Strand oligonucléotide</td><td>fournisseur</td><td></td> général <td>de laboratoire 5'-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3' &nbsp ; (Degré de purification : SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Linker Minus Strand oligonucléotide</td><td>fournisseur</td><td></td> général <td>de laboratoire 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (Degré de purification : SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Tru9I</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11464825001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer M</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417983001</td><td></td></tr><tr><td>PstI&nbsp ;</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>10798991001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer H</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417991001</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td>ou l’équivalent</td></tr><tr>Approvisionnement en<td>eau de qualité PCR</td><td>Fournisseur général de laboratoire Thermocycleur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>à 96 puits (avec couvercle chauffant)</td><td>Fournisseur</td><td></td><td></td>général</tr><tr><td>de laboratoire Linker Amorce</td><td>Fournisseur</td><td></td> général <td>de laboratoire 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (Grade de purification : grade PCR)</td></tr><tr><td>MLV-3' LTR amorce</td><td>générale labo fournisseur</td><td></td><td>5'-GACTTGTGGTCGCTGTTCCTTGG-3' (Grade de purification : grade PCR)</td></tr><tr><td>linker amorce imbriquée 454</td> fournisseur <td></td><td>de laboratoire général</td><td>5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Grade de purification : SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>MLV-3' LTR amorce imbriquée 454</td> fournisseur <td></td><td>de laboratoire général</td><td>5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCTCTCTGAGTGATTGACTACC](Grade de purification : SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>amorce imbriquée linker Illumina</td><td>fournisseur</td><td></td> de laboratoire général <td>5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCGCTTAAGGGAC](Degré de purification : SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>MLV-3' Amorce imbriquée LTR Illumina</td><td>fournisseur</td><td></td> général <td>de laboratoire 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCTCTCTGAGTGATTGACTACC](Degré de purification : SDS-PAGE)Solution d’acétate de</td></tr> <tr><td>sodium (3M) pH 5.2</td><td>fournisseur</td><td></td><td></td>général</tr><tr><td>de laboratoire Éthanol (absolu) pour la biologie moléculaire</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Topo TA Kit de clonage (avec vecteur pCR2.1-TOPO)</td><td>Invitrogen</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction</td> Kit <td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Échelle d’ADN 100 pb</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Tampon de chargement 6x</td><td>ThermoScientific</td><td>R0611</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-Vis NanoDrop 2000</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Kit d’index</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001 ou FC-131-1002</td><td></td></tr><tr><td>2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix&nbsp ;</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Support magnétique Dynal pour tubes de 2 ml</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 60 ml kit</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl 10 mM, pH 8,5</td><td>fournisseur</td><td></td><td></td>de laboratoire général</tr><tr><td>Agilent 2200 Système TapeStation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2964AA</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Réactifs D1000</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5583</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>KAPA Library Quantification Kit pour plateformes Illumina (ABI Prism)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4835</td><td></td></tr><tr><td>ABI Prism 7900HT Système de PCR rapide en temps réel</td><td>Applied Biosystems</td><td>4329003</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 1.0 N, moléculaire </td> fournisseur <td></td><td></td><td>de laboratoire général</td> de qualité biologique</tr><tr><td>HT1 (tampon d’hybridation)</td><td>Illumina&nbsp ;</td><td>Fourni dans le kit</td><td></td>de réactifs</tr><tr><td>MiSeq Kit de réactifs MiSeq v3 (150 cycles)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>Système MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

numérisation retroviral: mapping des sites d&#39;intégration mlv pour définir des régions réglementaires spécifiques à une cellule

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Les vecteurs rétroviraux à base de virus de la leucémie murine Moloney (MLV) s&#39;intègrent principalement dans les agents améliorant et promoteurs acétylés. Pour cette raison, les sites d&#39;intégration mLV peuvent être utilisés comme marqueurs fonctionnels des éléments réglementaires actifs. Ici, nous présentons un outil de balayage rétroviral, qui permet l&#39;identification du génome des amplificateurs et des promoteurs spécifiques de cellules. En bref, la population de cellules cibles est transduit avec un vecteur dérivé de mLV et l&#39;ADN génomique est digéré avec une enzyme de restriction souvent coupante. Après ligature de fragments génomiques avec un lieur d&#39;ADN compatible, la réaction en chaîne par polymérase (LM-PCR) médiée par un lieur permet l&#39;amplification des jonctions génome virus-hôte. Un séquençage massif des amplicons est utilisé pour définir le profil d&#39;intégration de mLV en fonction du génome. Enfin, des grappes d&#39;intégrations récurrentes sont définies pour identifier les régions réglementaires spécifiques aux cellules, responsables de l&#39;activation des programmes de transcription spécifiques aux cellules. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; L&#39;outil de balayage rétroviral permet l&#39;identification à l&#39;échelle du génome de promoteurs et d&#39;amplificateurs spécifiques de cellules dans des populations de cellules cibles prospectivement isolées. Notamment, le balayage rétroviral représente une technique instrumentale pour l&#39;identification rétrospective de populations rares ( p. Ex. Cellules souches somatiques) qui manquent de marqueurs robustes pour l&#39;isolement prospectif.

Flux de travail de la procédure de balayage rétroviral Le flux de travail de la procédure de balayage rétroviral est schématisé à la figure 1 . La population de cellules cibles est purifiée et transduit avec un vecteur rétroviral dérivé de mLV exprimant un gène rapporteur d&#39;eGFP. Le transgène est flanqué par les deux répétitions terminales longues identiques (LTR 5 &#39;et 3&#39;), assurant la sy...

Nous décrivons ici un protocole pour la cartographie génomique des sites d&#39;intégration des vecteurs rétroviraux à base de virus de la leucémie murine Moloney dans les cellules humaines.

Numérisation Retroviral: Mapping des sites d&#39;intégration MLV pour définir des régions réglementaires spécifiques à une cellule

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

L'objectif général de cette procédure est de cartographier les sites d'intégration de vecteurs rétroviraux dérivés du virus de la leucémie murine afin de définir les régions régulatrices spécifiques aux cellules. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les études de thérapie génique et de régulation génique, telles que l'endroit où le vecteur s'intègre dans le génome humain et quels éléments régulateurs peuvent être activement utilisés via un sous-type particulier. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en observant que, dans les études de thérapie génique, les vecteurs MLV s'intègrent dans des promoteurs et des enhancers actifs et spécifiques à un sous-type.Commencez par transduire les cellules cibles avec un vecteur rétroviral dérivé du MLV portant le gène rapporteur EGFP et pseudotypé avec la glycoprotéine d'enveloppe VSV-G ou amphrotropique. Les cellules transduites de manière factice servent de contrôle négatif. 48 heures après la transduction, centrifugez les échantillons, puis resuspendez 100 000 cellules dans 300 microlitres de PBS contenant deux pour cent de sérum de veau fœtal.Ensuite, mesurer l'expression d'EGFP par analyse en cytométrie de flux. Récolter 0,5 à cinq millions d'autres cellules transduites pour la préparation de l'ADN génomique et la digestion ultérieure par enzyme de restriction. Préparer quatre digestions par enzyme de restriction par échantillon dans des tubes de 1,5 millilitre.Digérez de 0,1 à un microgramme d'ADN génomique dans chaque tube. Ajoutez 10 unités de TRU91 et un microlitre de tampon M par échantillon, pour un volume final de 10 microlitres. Distribuez deux microlitres du mélange dans les tubes de digestion.Puis incuber les réactions à 65 degrés Celsius pendant six heures ou toute la nuit. Après l'incubation, ajouter 40 microlitres d'eau dans un tube de 1,5 millilitre. Dans le même tube, ajouter 10 unités de PST1 et un microlitre de tampon H par échantillon.Dispenser 10 microlitres du mélange de réaction de digestion dans les tubes de digestion. Incuber les réactions à 37 degrés Celsius pendant six heures ou toute la nuit. Le lendemain, préparer huit réactions de ligation d'adaptateurs dans des tubes de 1,5 millilitre.Pour chaque réaction, ajouter le mélange réactionnel de ligase à 10 microlitres d'ADN génomique digéré. Incuber à 16 degrés Celsius pendant trois à six heures. Pour la PCR du premier tour, préparer 48 réactions de PCR dans des tubes de 0,2 millilitre.Pour chaque PCR, ajouter le mélange réactionnel contenant l'amorce linker et l'amorce MLV3 prime LTR à deux microlitres de la réaction de ligation. Placer les échantillons dans un thermocycleur muni d'un couvercle chauffant. Régler les paramètres de cyclage et effectuer la première étape de réaction PCR.Pour la PCR du deuxième tour, préparez le mélange de réaction contenant l'amorce interne du linker et l'amorce interne du LTR 3' de MLV. Ensuite, ajoutez deux microlitres du produit de PCR du premier tour comme matrice. Puis, effectuez la réaction de PCR du deuxième tour afin de générer les produits finaux de PCR LN.Après la PCR du deuxième cycle, rassemblez les 48 réactions de PCR LM imbriquées dans un tube de 15 millilitres. Ajoutez ensuite 20 microlitres de tampon de charge à 100 microlitres du produit PCR LM regroupé et précipité. Chargez ensuite l'échantillon sur un gel d'agarose à un pour cent, en parallèle avec l'échelle d'ADN de 100 paires de bases.Faites migrer le gel à cinq volts par centimètre pendant 30 à 60 minutes une fois les bandes résolues, puis découpez la partie du gel contenant les amplicons de 500 à 150 paires de bases. Après purification du produit de PCR LM à l’aide d’un kit d’extraction sur colonne, mesurez la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV avant de passer à la préparation de la banque. Évaluez également la longueur des produits de PCR LM à l’aide d’un bioanalyseur, conformément aux instructions du fabricant.Préparez la banque en mettant en place une PCR d'indexation. Pour chaque PCR, utilisez entre 150 et 170 nanogrammes de produit de PCR LM purifié, avec une combinaison d'index différente pour chaque échantillon. Réalisez la PCR dans un thermocycleur muni d'un couvercle chauffant, comme indiqué.Après la PCR, diluez la bibliothèque purifiée à 10 nanomolaire avec du Tris HCl 10 millimolaire. Ensuite, mélangez cinq microlitres de la banque diluée avec cinq microlitres de soude 0,2 normal dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Vortexez brièvement, centrifugez puis incubez pendant cinq minutes à température ambiante pour dénaturer les bibliothèques.Placer les tubes du pool dénaturé sur de la glace et ajouter 990 microlitres de tampon d'hybridation HT1 prérefroidi. Ensuite, aliquoter 300 microlitres du pool dénaturé dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Puis ajouter 300 microlitres de HT1 prérefroidi pour obtenir un pool de bibliothèque final de dix picomolaire.En parallèle, mélanger 10 nanomolaires de bibliothèque témoin fixée dans un volume de deux microlitres avec 3 microlitres de tris HCl 10 millimolaires dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter cinq microlitres de soude 0,2 newtons et vortexer brièvement. Après une courte centrifugation, incuber cinq minutes à température ambiante pour dénaturer la fixation diluée.Après l'incubation, placez le tube sur de la glace et ajoutez 990 microlitres de HT1 pré-refroidi. Répartissez ensuite 100 microlitres de fixatif dénaturé en aliquotes dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et ajoutez 300 microlitres de HT1 pré-refroidi afin d'obtenir une concentration finale de 10 picomolaire de fixatif. Enfin, dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, mélangez 510 microlitres du pool de bibliothèque dénaturé avec 90 microlitres de la bibliothèque fixée dénaturée, obtenant ainsi un pool final de 10 picomolaire contenant 15 % de contrôle de fixatif à séquencer.Cette image montre l'analyse de 3498, 2989 et 4103 groupes de sites d'intégration récurrents du MLV dans les cellules souches progénitrices hématopoïétiques, les progéniteurs érythroïdes et les progéniteurs myéloïdes, respectivement. Dans chaque population cellulaire, plus de 95 % des groupes de MLV se chevauchaient avec des régions régulatrices définies épigénétiquement comme étant des activateurs et des promoteurs. Les régions ciblées spécifiquement par le MLV présentaient une forte acétylation et étaient associées à l'expression spécifique de la cellule du gène ciblé.Des exemples sont le promoteur du gène SPINK2 spécifique à HSP. La région de contrôle du locus contenant des activateurs puissants des gènes de globine bêta-like spécifiques aux érythroïdes. Les activateurs situés en amont du gène LYZ spécifique à NPP.Des tests rapporteurs de luciférase ont validé le sous-ensemble d'enhanceurs ciblés par le MLV spécifiques aux cellules dans les EPP et les MPP. Les régions ciblées par le MLV spécifiques aux érythroïdes présentaient une activité plus élevée dans les EPP que dans les MPP, et inversement, confirmant que le MLV identifie des enhanceurs spécifiques aux cellules pouvant contrôler l'expression des gènes voisins. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maximiser la fréquence des cellules transduites afin d'obtenir une récupération optimale des sites d'intégration. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment cartographier les sites d'intégration virale en ajustant d'abord l'ADN génomique, puis en ligaturant les fragments génomiques avec un brin d'ADN intermédiaire, en amplifiant ensuite la jonction entre le génome viral et l'hôte par PCR-LM, et enfin en séquençant en profondeur la bibliothèque d'amplicons.

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JoVE Journal

Genetics

Génétique

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