Name: Mesurer les profils biomoléculaire DSC avec des Ligands Thermolabile de caractériser rapidement pliage et reliure Interactions (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Découvrez la caractérisation rapide du repliement et des interactions de liaison biomoléculaires par calorimétrie différentielle à balayage avec des ligands thermolabiles. Cette méthode permet d'extraire efficacement les paramètres thermodynamiques essentiels pour la biocalorimétrie et la conception de médicaments.

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R. W. H. V était soutenue par les Sciences naturelles de McGill et le programme de formation de génie conseil recherche du Canada (CRSNG) en Bionanomachines. A. K. M. et P. E. J. appuyés par des subventions du CRSNG 327028-09 (A. K. M) et 238562 (E. J.).

1. préparation de l’échantillon
<ol><li>Purifier la biomolécule désiré13. Remarque : Ce protocole utilise acheté cocaïne-liaison ADN aptamère MN4 après avoir échangé contre 2 M NaCl, trois fois suivie de trois cycles de l’eau déminéralisée en utilisant un filtre centrifuge avec une membrane de limite de poids moléculaire 3 kDa.</li>
	<li>Synthétiser et purifier ou acheter le ligand thermolabile désiré13. NOTE : MN4 lie la cocaïne ligand thermolabile. MN4 lie également la quinine, qui est utilisée comme contrôle négatif pour la thermolabilité de ligand à ces températures expérimentales.</li>
	<li>Préparer les mémoires tampons pour dialyse de la biomolécule purifiée et dissolution des ligands (tampon de NaCl phosphate de sodium et 140 mM 20 mM, pH 7,4, MN4 et les ligands utilisés ici).</li>
	<li>Dialyser la biomolécule contre au moins 2 L de mémoire tampon, utilisez un tuyau de dialyse avec 0,5 - 1,0 coupure kDa.</li>
	<li>Filtrer sur un filtre de 0,2 µm qui a été soigneusement équilibré avec un tampon la dernière mémoire tampon (dénommée tampon de travail).</li>
	<li>Peser la masse désirée des ligands et dissoudre dans le tampon de travail filtrée. Si la concentration de ligand désirée besoin de masses qui sont trop petites pour peser avec précision, faire une solution concentrée de ligand (10 x par exemple). Remarque : Il est essentiel que toutes les expériences de DSC utilisent le même tampon de travail pour l’échantillon et ligand, c'est-à-direne jamais effectuer une expérience où le ligand est dissous dans un lot différent de tampon de travail que la biomolécule car cela provoquerait le tampon artefacts de décalage dans les données.</li>
	<li>Filtrer la solution mère de biomolécules à travers un filtre de 0,2 µm qui a été soigneusement équilibré avec tampon de travail.</li>
	<li>Déterminer la concentration de la biomolécule par mesures d’absorbance (260 nm pour les acides nucléiques comme MN4 et 280 nm pour les protéines).</li>
	<li>Stocker la biomolécule préparé et le ligand dans un réfrigérateur de 4 ° C (convient pour MN4 et les ligands utilisés ici), ou à -20 ou -80 ° C si la biomolécule et ligands tolèrent gel et longue durée de stockage est nécessaire. Degas, les solutions tampon, biomolécule et ligand dans un dessus de table dégazeur (voir Table des matières) avant le chargement dans le DSC. NOTE : Dégazage contribue à prévenir la formation de bulles dans le DSC aux températures plus élevées. Bulles de causent des artefacts de signal qui obscurcissent DSC pic formes et lignes de base.</li>
</ol>2. DSC préparation
<ol><li>Dévisser la poignée de la pression de la DSC (voir Table des matières).</li>
	<li>Exécuter des tubes de silicium de la mémoire tampon de travail et l’attacher à la bride avant (métal ouverture) du capillaire de référence.</li>
	<li>Créer un pont entre les capillaires référence et exemple en connectant la bride référence arrière à la bride de l’échantillon avant.</li>
	<li>Fixez un morceau de tube de silicone à la bride arrière échantillon qui s’exécute dans une fiole de déchets avec une ligne de vide attachée.</li>
	<li>Tourner sur la ligne du vide pour vider le DSC avec 200 mL de tampon de travail.</li>
	<li>Charger le capillaire de référence de la DSC avec tampon de travail. Fixer environ 3-5 cm, les segments du tube de silicone sur les brides capillaire de référence.</li>
	<li>Insérer une pointe de pipette de 1 mL en tube de silicium de la bride arrière. Faire 0,8 mL de tampon de travail avec une pipette et enfiler l’embout de la pipette avec un tampon en tubes de silicone de la bride de référence avant.</li>
	<li>Appuyez doucement sur le piston de la pipette vers le bas pour passer le tampon de travail à travers le tube de silicone avant dans le capillaire de référence et vers le haut de la bride arrière fixée de pipette. Enfoncer le piston de la pipette jusqu'à ce que le niveau de tampon de travail arrive juste au dessus du tube de silicone avant, puis relâchez le piston de la pipette jusqu'à ce que le niveau de tampon de travail atteint juste au-dessus de la tubulure de silicium arrière.<ol>
<li>Répéter en passant le tampon de travail en arrière pour purger le volume dans le capillaire de référence de bulles. Remarque : 10 passes de la solution en arrière sont généralement suffisants pour éliminer toutes les bulles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Boucher l’embout de la pipette arrière avec le pouce et tirez doucement sur l’arrière de la pipette et la pipette avant de leur retirer les brides de référence avec le tube de silicone attaché.</li>
	<li>Charger le capillaire de l’échantillon avec le tampon de travail tout comme aux étapes de 2,6 à 2,9. Placer un capuchon en plastique noir sur la référence arrière et dégustez les brides, laissant les brides front découvert.</li>
	<li>Fixer la poignée de pression.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel DSC (voir Table des matières) et pressuriser l’instrument en cliquant sur la flèche en haut de l’interface haut rouge une fois le relevé courant stabilisé ; la puissance de la DSC est indiquée dans une zone en haut à droite de l’interface ainsi que la température de l’instrument et la lecture de la pression. NOTE : Moniteur le pouvoir lire comme le DSC est sous pression. Changements dans l’alimentation de plus de ~ 10 µW indiquent la formation de bulles dans les capillaires, ce qui peut causer des artefacts dans les données. Les solutions doivent être enlevées et dégazées supplémentaire avant de continuer.</li>
	<li>Equilibrer le DSC avec tampon de travail en effectuant un balayage avant et arrière. Dans l’onglet « Méthode expérimentale » sur le côté gauche de l’écran, vérifiez que l’option « Analyse » est sélectionnée pour exécuter le DSC en mode d’analyse de la température. Remarque : Les paramètres expérimentaux sont la température analyse gamme, vitesse de balayage, les temps d’équilibrage de basse et haute température et nombre d’analyses.<ol>
<li>Dans l’encart « Paramètres de température » sous l’onglet « Méthode expérimentale », cliquez sur le bouton pour « Chauffage ». Saisissez 1 à 100 ° C pour les températures expérimentales inférieures et supérieures, 1 ° C/min pour la vitesse de balayage et 60 s pour la période de l’équilibration.</li>
		<li>Cliquez sur le bouton « Ajouter la série » sous le champ d’entrée pour la période de l’équilibration. Entrez 2 dans le champ « Étapes pour ajouter » dans la fenêtre pop-up (pour un chauffage et un refroidissement scan) et cochez la case « chauffage/refroidissement alternatif ». Cliquez sur « OK » ; les scans ajoutés apparaissent dans la partie inférieure de l’interface. Vérifiez que les paramètres pour chaque analyse sont comme désiré.</li>
		<li>Lancer le test en cliquant sur le bouton vert « jouer » en haut de l’interface. Naviguez jusqu’au dossier désiré et saisir un nom de fichier pour l’enregistrement de l’expérience dans la fenêtre pop-up. Afficher la progression de l’expérience en cliquant sur l’onglet « Données » à droite de l’onglet « Expérimenter la méthode ».</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. collecte de Ligand Thermolabile DSC Datasets
Remarque : La procédure minimale se compose de cinq expériences : expériences de référence avec et sans ligand de tampon (utilisé pour la soustraction de référence, voir la Discussion), expérimente la biomolécule gratuit, la biomolécule ligand lié, l’échantillon et la biomolécule ligand lié avec une plus longue période d’équilibration de haute température.
<ol><li>Exécuter des expériences de référence pour la soustraction de la base de l’échantillon de données. Recharger le DSC avec tampon de travail dans les deux vaisseaux capillaires et recueillir des scans multiples avant et arrière sur une plage de température appropriée au 1 ° C min-1 avec un dessus (haute température) temps d’équilibrage de 120 s.<ol>
<li>Supprimer les prΘcΘdentes de l’équilibration du tampon de la partie inférieure de l’interface en sélectionnant chacun individuellement, puis en cliquant sur le X rouge au milieu à droite de l’interface. Ajouter les nouveaux scans en cliquant sur le bouton « Ajouter Series », saisissant 20 dans le domaine des « Étapes pour ajouter » et en cochant la case « autre chauffage/refroidissement ». Cliquez sur OK et lancer l’expérience en cliquant sur le bouton vert play comme ci-dessus.</li>
		<li>Répétez les étapes 3.1 - 3.1.1 avec tampon de travail contenant la concentration désirée du ligand dans les deux vaisseaux capillaires pour obtenir la référence expérimente pour le ligand (recueillir deux expériences distinctes à l’aide de 120 s et 600 s haute température équilibration fois respectivement, à utiliser dans l’acquisition de la constante de vitesse pour la conversion de ligand thermolabiles). Remarque : La vitesse de balayage utilisée ici s’assure que la biomolécule dans des expériences ultérieures est à l’équilibre thermique dans les scans avant et arrière (voir Discussion). Analyse taux < 0,1-0,2 ° C min-1 conduisent à des thermogrammes bruyants et ne sont pas applicables dans les expériences de DSC. Les températures ne doivent dépasser de bien en dessous de la température de fusion de la biomolécule gratuit bien au-delà de la température de fusion du ligand saturé biomolécule (~ 20-80 ° C pour MN4). Vérifier la reproductibilité de l’analyse (par exemple, l’avant 10 et 10 scans inverses pour 20 total est suffisant).</li>
		<li>Si vous utilisez plusieurs ligands (comme la cocaïne et la quinine), rincer la DSC avec 200 mL de tampon de travail (répétition de l’étape 2.5) entre les exécutions afin de retirer les capillaires de ligand et de prévenir la contamination croisée. Remarque : Il est utile de réaliser une expérience réitérée sur la biomolécule libre après une course de ligand lié afin de vérifier si le ligand précédent est fortement adsorbé dans les parois capillaires et n’est pas supprimé correctement avec vidage de la mémoire tampon. Si les thermogrammes pour la biomolécule libre semblent être déplacé vers une plus grande ampleur et de la température de dénaturation élevée après la liaison ligand expérience, il est probable que le ligand précédent est encore présent dans le calorimètre après le rinçage. Supprimer le ligand adsorbé en incubant les capillaires avec 20 % Contrad-70 pendant 1 h à 60 ° C avec les bouchons en plastique et la poignée de pression. Dans le logiciel de DSC, passer du mode expérimental aux « Isotherme » sous l’onglet méthode expérimentale choisir 3 600 s pour la durée et 60 ° C pour la température isotherme, avec zéro est entré pour le temps d’équilibrage. Cliquez sur « Ajouter à la méthode expérimentale ». L’expérience isotherme apparaît dans la partie inférieure de l’écran. Après l’achèvement, rincer l’instrument à l’eau de 2 L eau désionisée et répétez l’étape 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exécuter des expériences modèles utilisant cette DSC chargement procédure et paramètres expérimentaux comme la référence scanne. Pour l’ensemble de données biomolécule libre, faire en sorte que le capillaire de référence contient le tampon de travail tandis que le capillaire de l’échantillon contient la biomolécule libre à la concentration voulue dans un tampon de travail.<ol>
<li>Pour les expériences de ligand lié, assurez-vous que le ligand est dans le tampon de travail dans le capillaire de référence, et la biomolécule plus ligand est en travail tampon non contrôlé dans le capillaire de l’échantillon. Vider le système entre les ajouts de différents ligands comme au point 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer une expérience supplémentaire avec la biomolécule lié au ligand thermolabile où la période de l’équilibration de haute température est augmentée à 600 s et tous les autres paramètres expérimentaux sont les mêmes que l’étape 3.2.1. Remarque : La durée de la période d’équilibration haute température pour l’expérience de la deuxième liaison ligand est simplement choisie pour s’assurer que le ligand est appauvri plus rapidement que l’expérience de temps court de l’équilibration. Si le ligand lié aux pics de la première experiment décomposition lentement en fonction du numéro d’analyse (par exemple, les différences entre les sommets successifs sont ≤ 0,5 ° C), estimer les augmentations de 10 à 20 fois dans la période d’équilibration haute température afin de adéquatement appauvrissent le ligand au cours de la seconde expérience. Le calcul exact de la constante de vitesse pour la conversion de ligand exige que la seconde expérience ait plus rapide épuisement du ligand par rapport à la première. Les concentrations du ligand extraites de l’analyse globale des deux expériences seront similaires et donc inutilisable si l’épuisement de ligand n’est pas suffisamment accéléré dans la seconde expérience.</li>
</ol>4. traitement des données
<ol><li>Ouvert le DSC expérimenter les fichiers dans le logiciel d’analyse de données DSC (voir Table des matières) et exportez les données de puissance brute comme des feuilles de calcul.</li>
	<li>Importer les feuilles de calcul contenant les données de puissance brute dans le logiciel pour montage des données.</li>
	<li>Référence soustraire les exemples de données en soustrayant les données pouvoir tampon de la liberté et de la biomolécule ligand lié aux expériences. Remarque : Pour l’expérience de ligand thermolabile, la concentration de ligand initial diminue avec chaque scan. Il est donc idéal pour soustraire le scan de la mémoire tampon 1 de l’analyse de l’échantillon 1 et ainsi de suite. Nous avons trouvé que les scans de tampon avec la cocaïne ne changent pas sensiblement tant que la conversion de ligand produit et un balayage de mémoire tampon unique thermolabile ligand peut donc servir à soustraire toutes les données de liaison ligand thermolabiles.</li>
	<li>Convertir les exemples soustraite à la base de données de puissance capacité calorifique. Remarque : La conversion nécessite de volume spécifique partiel de la biomolécule, qui peut être estimée14,15,16. L’équation de conversion d’énergie capacité calorifique a été décrit précédemment17.</li>
</ol>5. analyse
<ol><li>Dans le monde fit l’équilibration court temps thermolabile capacité calorifique de ligand lié aux dataset avec un ensemble unique de base, la concentration de ligand, pliage et liaison de paramètres, comme décrit plus haut4ligands.</li>
	<li>Répétez que le global s’adapter pour le dataset de temps d’équilibration long afin de calculer la constante de vitesse pour la conversion de ligand thermolabiles comme décrit plus haut4.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Modifications et dépannage
Les détails de l’analyse du montage global utilisé dans la Figure 1 et Figure 2 ont été décrites précédemment4. Ici, nous exposons les aspects pratiques de la scène et analyse des expériences de liaison DSC avec des ligands thermolabiles. Notez qu’une ligne de base de DSC obtenues pour le ligand thermolabile seul est soustraite de ligand + biomolécule dataset, annulant...

Calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est une méthode puissante pour quantifiant liaison biomoléculaire et pliage des interactions1,2,3. Les points forts de DSC incluent sa capacité d’élucider contraignant et pliage des mécanismes et à céder les paramètres thermodynamiques correspondantes2,3. En outre, DSC peut être effectuée en solution dans des conditions physiologiques près et ne nécessite pas de marquage de la biomolécule ou ligands, par exemple, avec des fluorophores, spin-étiquettes ou isotopes nucléaires4. L’instrument balaye de température, mesure de la quantité de chaleur nécessaire pour dénaturer la biomolécule en présence et en absence de ligand. Les thermogrammes qui en résultent sont utilisées pour extraire les paramètres thermodynamiques qui régissent le ligand binding et processus de pliage. Les informations fournies par DSC ou d’autres techniques thermodynamiques sont essentielles pour guider la conception des médicaments ciblant des biomolécules1,5,6,7,8. Cependant, l’analyse répétée à des températures élevées (~ 60-100 ° C) peut s’avérer problématique. Par exemple, de nombreux composés pharmaceutiquement importants subissent une transposition ou décomposition après exposition à des températures élevées9,10,11, c'est-à-dire, ils sont thermolabiles. Examen de liaison généralement les interactions par DSC exige des scans multiples avant et arrière afin de vérifier la reproductibilité de la thermogramme pour analyses thermodynamiques12. Conversion thermique d’un ligand initiale à une forme secondaire présentant des caractéristiques de liaison modifiée entraîne des différences marquées dans la forme et la position des thermogrammes successifs, car la concentration de ligand initial diminue avec chaque scan tout en le produits de conversion thermique s’accumulent. Ces ensembles de données ne se prêtent pas aux analyses traditionnelles.
Nous avons récemment mis au point une méthode de lissage global datasets thermolabile ligand DSC qui cède l’ensemble complet des paramètres thermodynamiques qui régissent le pliage biomoléculaire et contraignant les interactions d’une seule expérience de ligand lié cité la thermogramme requise pour la biomolécule gratuit4. L’analyse réduit le temps expérimental et les échantillons requis par ~ 10 fois par rapport aux approches DSC standard. Nous avons représenté pour ligand conversion thermique en supposant que cela se passe pendant la phase de haute température de chaque balayage où le thermogramme ne dépend pas de la concentration de ligand. Par conséquent, la concentration de ligand est une constante dans la portion de la thermogramme qui est utilisé pour extraire des paramètres thermodynamiques. En outre, nous avons démontré comment la constante de vitesse pour la conversion thermique ligand peut être obtenue en effectuant une expérience supplémentaire avec une plus longue période d’équilibration de haute température. Pour les systèmes où la conversion thermique de ligand est moins dépendante de la température (c'est-à-diresurvenant de façon appréciable à toutes les températures), l’analyse peut être modifiée pour inclure des concentrations variables de ligand. Nous démontrons cette procédure pour l’ADN aptamère MN4 en présence de la cocaïne de ligand thermolabile, qui se transforme rapidement en benzoylecgonine à des températures élevées (> 60 ° C). La quinine est utilisée comme contrôle négatif pour la thermolabilité de ligand puisqu’il ne subit pas de conversion à ces températures expérimentales et lie également à MN4. Nous décrivons l’acquisition de ligand thermolabile DSC datasets et leur analyse, ce qui donne des paramètres thermodynamiques et cinétiques de la plier, une liaison et ligand des processus de conversion.

<table><tbody><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Eau déioinisée pour la biologie moléculaire</td><td>Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0,2 micron filtres à seringue stériles</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Filtres centrifuges 3 kDa</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Tube de dialyse Coupure 0,5-1,0 kDa</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>Tube en silicone</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>Capuchons à bride en plastique DSC TA</td><td>Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>Aptamère d’ADN MN4</td><td>Technologies d’ADN intégrées</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>Cocaïne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>Quinine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>NanoDSC-III microcalorimètre</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr> <tr><td>DSCRun logiciel</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel NanoAnalyze</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr> <tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

mesurer les profils biomoléculaire dsc avec des ligands thermolabile de caractériser rapidement pliage et reliure interactions

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est une technique puissante pour quantifier les paramètres thermodynamiques régissant biomoléculaire pliage et les interactions de liaison. Cette information est essentielle dans la conception de nouveaux composés pharmaceutiques. Cependant, de nombreux ligands pharmaceutiquement pertinentes sont chimiquement instables aux températures élevées utilisées dans les analyses de DSC. Ainsi, mesurer les interactions de liaison est difficile parce que les concentrations de ligands et de produits thermiquement converties sont en constante évolution au sein de la cellule du calorimètre. Nous présentons ici un protocole utilisant des ligands thermolabiles et DSC pour obtenir rapidement des informations thermodynamiques et cinétiques sur le pliage, une liaison et ligand procédés de conversion. Nous avons appliqué notre méthode à l’ADN aptamère MN4 qui se lie à la cocaïne de ligand thermolabile. À l’aide d’une nouvelle analyse de montage global qui tient compte de la conversion de ligand thermolabile, l’ensemble complet de pliage et de liaison des paramètres sont prélevés sur une paire d’expériences de DSC. En outre, nous montrons que la constante de vitesse de conversion thermolabile ligand peut être obtenue avec un seul dataset supplémentaire de DSC. Les lignes directrices pour identifier et analyser les données provenant de plusieurs scénarios plus complexes sont présentés, y compris l’agrégation irréversible de la biomolécule pliage lent, liaison lente et rapide épuisement du ligand thermolabile.

Des données représentatives pour le ligand thermolabile DSC sont indiquées à la Figure 1. La position et la hauteur du pic de ligand lié aux thermolabile successivement se déplace vers le bas vers celui de la biomolécule indépendant comme le ligand thermolabile est épuisé avec chaque scan (Figure 1 a). Le profil de dénaturation libre est utilisé comme référence pour le point de terminaison de la conversion de ligand thermolabile ...

Nous présentons un protocole pour la caractérisation rapide des biomoléculaire pliage et contraignant les interactions avec les ligands thermolabiles utilisant la calorimétrie différentielle à balayage.

Mesurer les profils biomoléculaire DSC avec des Ligands Thermolabile de caractériser rapidement pliage et reliure Interactions

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

L'objectif général de cette méthodologie est d'extraire les paramètres thermodynamiques régissant le repliement des biomolécules et les interactions de liaison par calorimétrie de balayage différentiel, ou DSC, à l'aide d'un ligand thermolabile en aussi peu que deux expériences. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biocalorimétrie et de la conception de médicaments, telles que quelles sont les ordres de grandeur relatifs des paramètres thermodynamiques régissant les interactions entre les biomolécules et les inhibiteurs fortement liants ? Le principal avantage de cette technique est qu'une titration complète du ligand est réalisée en une seule expérience, permettant une extraction rapide des paramètres thermodynamiques par analyse globale par ajustement.Pour commencer, préparez des tampons pour la dialyse de la biomolécule purifiée dans une solution de ligands. Effectuez la dialyse de la biomolécule contre au moins un litre de tampon en utilisant un tube de dialyse avec une limite de coupure de 0,5 à 1,7 kilodalton. L'étape la plus importante pour obtenir des données DSC de haute qualité est la dialyse de la biomolécule ligand contre le tampon souhaité.Cela garantit qu'il n'y a pas d'artéfacts dus à un désaccord de tampon dans les données de DSC. Filtrer le tampon final, appelé tampon de travail, à l'aide d'un filtre de 0,2 micron qui a été soigneusement équilibré avec le tampon. Peser les masses souhaitées des ligands et les dissoudre dans le tampon de travail filtré.Si les concentrations de ligand souhaitées nécessitent des masses trop faibles pour être pesées avec précision, préparez une solution mère concentrée de ligand. Filtrez la solution mère de biomolécule à travers un filtre de 0,2 micron ayant été soigneusement équilibré avec le tampon de travail. Ensuite, déterminez la concentration de la biomolécule par des mesures d'absorbance.Conserver la biomolécule et le ligand préparés dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius ou à moins 20 ou moins 80 degrés Celsius si la biomolécule et les ligands tolèrent la congélation et si un entreposage à long terme est nécessaire. Débarrasser le tampon des bulles d'air en utilisant un dégazeur de table, ainsi que les solutions de biomolécule et de ligand, avant de les charger dans le calorimètre différentiel à balayage, ou DSC. Démonter la poignée de pression du DSC.Ensuite, faites passer un tube en silicone depuis le tampon de travail et fixez-le au flasque avant du capillaire de référence. Créez un pont entre les capillaires de référence et d'échantillon en reliant le flasque arrière de référence au flasque avant simple. Puis, fixez un morceau de tube en silicone au flasque arrière de l'échantillon, qui mène à un flacon de déchets équipé d'une ligne sous vide.Activez la ligne de vide pour rincer le DSC avec 200 millilitres de tampon de travail. Commencez par fixer des sections de tubing en silicone d'environ trois à cinq centimètres aux brides du capillaire de référence. Ensuite, insérez une pointe de pipette d'un millilitre dans le tubing en silicone de la bride arrière.Prélevez 0,8 millilitre de tampon de travail à l’aide d’une pipette et insérez la pointe de pipette contenant le tampon dans le tube en silicone de la bride de référence avant. Appuyez doucement sur le piston de la pipette pour faire circuler le tampon de travail à travers le tube en silicone avant, puis dans le capillaire de référence et remonter jusqu’à la pointe de pipette fixée à la bride arrière. Enfoncez le piston de la pipette jusqu’à ce que le niveau du tampon de travail atteigne légèrement au-dessus du tube en silicone avant, puis relâchez le piston de la pipette jusqu’à ce que le niveau du tampon de travail atteigne légèrement au-dessus du tube en silicone arrière.Continuez à faire passer le tampon de travail de part et d'autre dans le capillaire de référence pour éliminer les bulles présentes dans le volume. Ensuite, bouchez l'embout arrière de la pipette avec l'index et tirez doucement vers le haut sur l'embout arrière de la pipette et sur la pipette avant afin de les retirer des brides de référence tout en laissant le tube en silicone en place. Chargez le capillaire d'échantillon avec le tampon de travail comme précédemment.Placer un capuchon en plastique noir sur les brides de l'échantillon de référence arrière en laissant les brides avant découvertes. Fixer la poignée de pression au DSC, puis ouvrir le logiciel du DSC et pressuriser l'instrument en cliquant sur la flèche rouge vers le haut située en haut de l'interface, une fois que la lecture de puissance s'est stabilisée. La puissance du DSC est indiquée dans une boîte située en haut à droite de l'interface, accompagnée de la température de l'instrument et de la lecture de pression.Équilibrez le DSC avec le tampon de travail en effectuant une analyse directe et inverse dans l'onglet méthode expérimentale situé sur le côté gauche de l'écran. Assurez-vous que l'option de balayage est sélectionnée pour exécuter le DSC et le mode de balayage en température. Dans l'encart des paramètres de température sous l'onglet méthode expérimentale, cliquez sur le bouton de chauffage.Saisissez 1 et 100 degrés Celsius comme températures expérimentales inférieure et supérieure, un degré Celsius par minute comme vitesse de balayage et 60 secondes comme période d'équilibration. Cliquez sur le bouton AddSeries sous le champ de saisie de la période d'équilibration. Saisissez deux dans le champ « étapes à ajouter » dans la fenêtre contextuelle et cochez la case Alternance Chauffage/Refroidissement.Cliquez sur OK. Les analyses ajoutées apparaissent dans la partie inférieure de l'interface. Vérifiez que les paramètres de chaque analyse sont conformes aux attentes. Démarrez l'expérience en cliquant sur le bouton vert de lecture en haut de l'interface.Accédez à la fenêtre souhaitée et saisissez un nom de fichier pour enregistrer l'expérience dans la fenêtre contextuelle. Visualisez l'avancement de l'expérience en cliquant sur l'onglet données situé à droite de l'onglet de méthode d'expérience. Exécutez des expériences de référence pour une soustraction de la ligne de base des données de l'échantillon en rechargeant le DSC avec du tampon de travail dans les deux capillaires.Effectuez plusieurs balayages directs et inverses sur une plage de températures appropriée à raison d’un degré Celsius par minute, avec un temps d’équilibration à la montée de 120 secondes. Supprimez les balayages d’équilibration du tampon précédents de la partie inférieure de l’interface en les sélectionnant individuellement et en cliquant sur la croix rouge située au milieu à droite de l’interface. Ajoutez les nouveaux balayages en cliquant sur le bouton AddSeries, en entrant 20 dans le champ correspondant au nombre d’étapes à ajouter, puis en cochant la case Alternate Heating/Cooling.Ensuite, cliquez sur OK et lancez l'expérience en cliquant sur le bouton de lecture vert, comme précédemment. Répétez ces étapes avec le tampon de travail contenant la concentration souhaitée de ligand dans les deux capillaires afin d'obtenir les expériences de référence pour le ligand. Effectuez deux expériences distinctes qui seront utilisées pour déterminer la constante de vitesse de la conversion thermolabile.Pour le jeu de données du biomolécule libre, assurez-vous que la capillarité de référence contient le tampon de travail tandis que la capillarité d'échantillon contient le biomolécule libre à la concentration souhaitée dans le tampon de travail. Ensuite, effectuez les expériences sur l'échantillon en utilisant la même procédure de chargement DSC et les mêmes paramètres expérimentaux que ceux utilisés pour les analyses de référence. Pour les expériences avec ligand lié, assurez-vous que le ligand est présent dans le tampon de travail de la capillarité de référence, et que le biomolécule plus le ligand sont dans le tampon de travail de la capillarité d'échantillon.Procédez au rinçage du système entre l'ajout de différents ligands comme précédemment. Réalisez une expérience supplémentaire avec la biomolécule liée au ligand thermolabile, en augmentant la période d'équilibre à haute température à 600 secondes, tous les autres paramètres expérimentaux restant identiques à ceux utilisés auparavant. Passez ensuite au traitement et à l'analyse des données comme décrit dans le protocole textuel.La position et la hauteur du pic correspondant au ligand thermolabile lié se déplacent successivement vers celles de la molécule non liée à mesure que le ligand thermolabile est épuisé au cours de chaque balayage. Le profil de maturation 3D est utilisé comme référence pour déterminer le point final de la conversion du ligand thermolabile. L'augmentation de la durée d'équilibration à haute température entraîne des réductions plus marquées de la concentration du ligand thermolabile à chaque balayage, par rapport au jeu de données obtenu avec une période d'équilibration courte.À l'aide des paramètres de concentration issus de l'ajustement global optimisé pour les deux jeux de données, on peut calculer la constante de vitesse de conversion du ligand à la température élevée d'équilibre. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 72 heures si elle est effectuée correctement. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de se rappeler de dégazer également le ligand biomoléculaire et de purger les capillaires de DSC des bulles à l'aide de la pipette de chargement afin d'éviter les artefacts de données.Après avoir visionné cette vidéo et lu l'article, vous devriez bien comprendre comment réaliser des expériences de DSC sur des biomolécules ainsi que la mise en œuvre d'analyses par ajustement global afin d'extraire rapidement les paramètres thermodynamiques régissant les interactions de repliement et de liaison. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur les interactions de repliement et de liaison à l'équilibre, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme les biomolécules présentant des cinétiques lentes de repliement et/ou de liaison à un ligand.

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