Analyse automatisée d'un essai de préférence chimiosensible basée sur la population à base de nématodes

L’objectif global de cette configuration et de ce protocole d’enregistrement du comportement est de quantifier la préférence chimiosensorielle de C Elegans pour les composés solubles à l’aide d’un système d’acquisition vidéo multi-caméras, suivi d’une analyse vidéo automatisée. Cette méthode peut faciliter la recherche en neurobiologie de C Elegans en permettant une analyse comportementale plus rapide et plus standardisée des mutants génétiques. Le principal avantage de cette technique est que plusieurs répétitions peuvent être analysées simultanément dans des conditions identiques tout en surveillant la dynamique temporelle de la réponse de la population de nématodes aux signaux solubles.

Christopher Cronin, un scientifique de ce laboratoire, fera la démonstration de l’assemblage de la chambre de comportement. Pour commencer, préparez les housses en tissu, les barres de montage de caméra, les supports d’angle, les barres d’extrusion et l’ensemble de montage de caméra comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. En commençant par les barres d’extrémité fixées à la barre centrale, fixez le support de caméra et les étuis à l’ensemble de support de caméra.

Ensuite, assemblez le cadre de la chambre de comportement. Commencez par fixer quatre barres d’aluminium extrudé d’un pied à une feuille de polyester carrée. Faites glisser une barre sur les deux écrous en T de l’omni de la feuille de tissu, en centrant la barre sur la largeur du tissu.

Serrez les attaches pour fixer la feuille de tissu à chaque barre. Étalez la feuille de polyester carrée sur le plan de travail avec les quatre barres d’aluminium fixées sur le dessus. Ensuite, glissez huit supports d’angle sur les surfaces supérieures des quatre barres d’aluminium, un à chaque extrémité de chaque barre.

Positionnez les supports d’angle sur les barres avec les pieds verticaux du support au ras de l’extrémité des barres et fixez-les en place en serrant les vis dans les écrous en T. À chaque coin, placez une extrusion d’aluminium d’un pied à la verticale, en glissant l’extrusion sur les écrous en T des deux pieds de support d’angle. Ensuite, fixez la barre verticale aux barres horizontales en serrant les attaches, joignant ainsi les deux barres horizontales adjacentes.

Faites glisser les écrous en T desserrés de l’ensemble de support d’appareil photo en forme de H dans les montants du cadre. Laissez le H glisser jusqu’en bas pour reposer sur les supports d’angle à chaque coin du cadre. Fixez l’ensemble de support de caméra en place en serrant les quatre vis du support d’angle.

Ensuite, utilisez les quatre dernières barres d’aluminium d’extrusion d’un pied pour assembler la couche inférieure de la chambre. Positionnez les supports d’angle avec les pieds des supports au ras de l’extrémité de la barre et serrez les vis pour le fixer en place. Ensuite, glissez les barres entre les montants du cadre avec les écrous en T desserrés dans les canaux verticaux.

Positionnez la barre de manière à ce que les bords supérieurs de leurs supports d’angle soient à un pouce en dessous de l’extrémité ouverte des montants et fixez-la en place en serrant les vis du support d’angle. Ensuite, faites glisser les écrous en T des quatre feuilles de polyester rectangulaires dans les canaux des barres d’extrusion verticales pour couvrir les côtés de la chambre et serrez les fixations pour les fixer en place. Sélectionnez un côté comme porte d’accès à l’intérieur de la chambre et retirez les deux vis et les écrous en T sur la couche inférieure de la chambre.

Placez un capuchon en plastique à l’extrémité supérieure de chaque coin pour servir de pieds pour le cadre terminé. Retournez le cadre à l’endroit et insérez deux supports de panneau par diapositive à l’intérieur de la couche d’espace du cadre, puis tournez-les pour les fixer en place. Ensuite, placez un morceau d’acrylique transparent de 12 x 12 pouces sur les supports de panneaux pour fournir une scène pour les plaques de test.

Enfin, positionnez la caméra et le gabarit de scène comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. La veille de l’expérience, placez 28 plaques vides de 35 millimètres en piles de cinq ou moins sur une surface plane. Remplissez chaque plaque de dosage avec cinq millilitres de gélose de milieu de croissance des nématodes et laissez les plaques de dosage sécher à la verticale, sans couvercle, toute la nuit à température ambiante.

Le jour de l’expérience, allumez le rétroéclairage, démarrez l’ordinateur et lancez le logiciel de capture vidéo de la caméra du microscope. Connectez la caméra du microscope à l’ordinateur et cliquez sur la vignette numérotée de la caméra en haut de la fenêtre du logiciel pour afficher le flux en direct de la caméra. Pour régler les paramètres d’enregistrement vidéo, déroulez le menu du format vidéo dans le coin supérieur gauche du flux de la caméra, puis sélectionnez MJPG 1280x1024.

Ensuite, déroulez le menu des dossiers à côté du menu du format vidéo et sélectionnez un dossier dans lequel enregistrer les fichiers vidéo. Cliquez sur l’icône d’exposition automatique dans le coin supérieur droit du flux de l’appareil photo et désactivez l’exposition automatique. Ensuite, cliquez sur l’icône LED immédiatement à droite de l’icône d’exposition automatique pour désactiver les LED intégrées de la caméra de microscope.

Cliquez sur l’icône des paramètres adjacents et sélectionnez, monochrome. Maximisez le contraste et ajustez la luminosité. Alignez un modèle de placement de solution sur le modèle d’alignement de plaque de scène et cliquez sur l’icône d’enregistrement vidéo timelapse sur le côté gauche du flux de la caméra.

Entrez cinq secondes pour la durée et une seconde pour l’intervalle afin d’enregistrer une vidéo d’étalonnage de cinq secondes à raison d’une image par seconde. À l’aide d’une pipette en verre de cinq millilitres, ajoutez 1,2 millilitre de tampon de milieu de croissance des nématodes à une plaque de vers synchronisés et agitez doucement la plaque pour déplacer les vers dans le tampon. Pipetez le tampon de la plaque et distribuez les vers dans le tampon dans un tube de micro-centrifugation propre.

Laissez reposer les tubes pendant une à deux minutes pour permettre aux vers de se déposer au fond. Ensuite, utilisez une pointe de pipette en plastique pour retirer autant de tampon de lavage que possible des tubes sans déranger la pastille de vers agrégés au fond des tubes. Remplissez le tube avec un millilitre de tampon de milieu de croissance des nématodes propre et répétez la procédure de lavage deux fois de plus.

Ensuite, collez un modèle de placement de solution sur la platine d’un microscope de dissection. Ensuite, placez une bande de ruban adhésif double face de chaque côté d’un gabarit d’alignement de plaque. Alignez le périmètre de la plaque de dosage avec le cercle sur le gabarit d’alignement de la plaque et appuyez jusqu’à ce que le gabarit adhère au bas de la plaque.

Ensuite, alignez les marqueurs des membres du modèle de plaque de test avec les marqueurs des membres du modèle de placement de la solution sur le microscope de dissection. Ensuite, à l’aide d’une pipette P2, placez un microlitre de tampon M13, chacun dans les quadrants un et quatre. À l’aide d’une nouvelle pointe, placez un microlitre de solution CuCl2 de 10 millimolaires chacun dans les quadrants deux et trois.

À l’aide d’une pipette pasteur en verre, transférez les vers lavés sur les plaques de dosage une fois que les gouttes de solution ont été complètement absorbées dans la gélose. Placez une goutte de vers sur les zones au-dessus et en dessous des régions circulaires traitées. Pliez le mouchoir quatre fois et utilisez le bord émoussé pour absorber l’excès de tampon de lavage sur les plaques de dosage.

Disposez immédiatement les plaques de test sous les caméras du microscope dans la chambre comportementale en alignant les numéros des coins du modèle. Attendez deux à trois minutes pour permettre aux vers de s’acclimater aux plaques de dosage. Ensuite, cliquez sur l’icône d’enregistrement vidéo timelapse sur le côté gauche du flux de la caméra et entrez 10 minutes pour la durée et une seconde pour l’intervalle d’enregistrement d’une vidéo de 10 minutes d’une image par seconde.

Enfin, cliquez sur démarrer, pour démarrer l’enregistrement vidéo. Pour chaque image vidéo, la fonction d’indice de préférence comptabilise le nombre de pixels du ver dans chaque région d’intérêt et calcule le pourcentage d’un pixel sur le nombre total de pixels dans la région d’intérêt. Les valeurs de l’indice de préférence obtenues pour différents appariements de génotypes et de traitements sont indiquées ici.

Une valeur d’indice de préférence positive indique une attirance pour le traitement tandis qu’une valeur d’indice de préférence négative indique une répulsion. Un indice de préférence de 0,02 est obtenu lorsque la solution tampon M13 a été placée à la fois dans les régions de contrôle et expérimentales d’intérêt, démontrant qu’il n’y a pas de biais spatial. Ce graphique montre également que les vers N2 ont fortement évité les ions cuivre, ce qui a donné un indice de préférence de 0,67.

De plus, les mutants osm-3, qui sont défectueux dans la formation de cilles sensoriels, et les mutants ocr-2 qui sont défectueux dans les réponses nociceptives médiées par ASH ont montré une diminution de l’évitement et même une légère attraction pour les ions cuivre. Lors de l’essai de ce protocole, il est important de travailler rapidement, mais aussi en douceur et de manière cohérente. La configuration d’enregistrement et le protocole de test peuvent être facilement adaptés pour caractériser les réponses comportementales basées sur la population qui découlent des interactions entre différentes variétés sensorielles de C Elegans.