Name: Analyse automatisée dun essai de préférence chimiosensible basée sur la population à base de nématodes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Découvrez l'analyse automatisée des préférences chimiosensorielles chez Caenorhabditis elegans à l'aide d'un système d'acquisition vidéo multi-caméras. Cette méthode permet d'étudier la neurobiologie des nématodes avec une analyse comportementale standardisée et reproductible.

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Certaines souches ont été fournies par le Centre de génétique de Caenorhabditis (CGC), qui est financé par le Bureau des programmes d&#39;infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440). Ce travail est soutenu par l&#39;Institut médical Howard Hughes, avec lequel PWS est un enquêteur.

<ol><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314, 1-340 (1986).</li>
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<li>Ezcurra, M., Tanizawa, Y., Swoboda, P., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+sensitizes+C.+elegans+avoidance+behaviours+through+acute+dopamine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Food sensitizes C. elegans avoidance behaviours through acute dopamine signalling.</a> EMBO J. 30 (6), 1110-1122 (2011).</li>
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<li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+TRPV+channel+proteins+defines+their+sensory+functions+and+subcellular+localization+in+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons.</a> Neuron. 35 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+alternative+behavioral+states+by+serotonin+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 21 (1), 203-214 (1998).</li>
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<li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parallel+worm+tracker%3A+A+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The parallel worm tracker: A platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PLoS One. 3 (5), e2208(2008).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Une étape critique dans le protocole est de s&#39;assurer que les plaques de dosage ont un niveau de sécheresse constant pendant les différents jours expérimentaux. Différents niveaux de dessèchement entraîneront différents taux de diffusion de la solution dans la gélose et, par conséquent, des variations dans les résultats comportementaux. Ainsi, les plaques de dosage devraient toujours être fraîches l&#39;après-midi avant les expériences. Le nombre de vers testés par dosage devrait également être réglé pour faciliter la comparaison entre les traitements. Pour référence, un ver de type sauvage établit 4-10 oeufs / h en moyenne donnant 360 vers par analyse si le protocole de synchronisation de ver ci-dessus est suivi 17 . Si certaines souches mutantes sont endommagées par les œufs, choisissez plus de vers adulte gravide pour la ponte pour atteindre le nombre cible de progéniture. Une autre étape importante dans le protocole est de gérer les vers doucement pendant le processus de lavage et le passage du ver. Les vers sont sensibles aux stimuli mécaniques, qui provoquent des réponses au stress<html> S inversions et inhibition de la ponte 18 . En outre, il faut prendre soin de définir le ROI avec précision et de déterminer la valeur constante de seuil optimale pour des conditions d&#39;éclairage spécifiques avant de procéder à l&#39;analyse vidéo. Il est également recommandé que les processus d&#39;étalonnage et de seuillage soient répétés si une longue période de temps s&#39;est écoulée depuis la dernière expérience. Une limitation de cette méthode est qu&#39;il n&#39;est pas approprié pour le dosage de petites populations de vis sans fin. Cependant, si les contrôles appropriés pour déterminer l&#39;influence de la présence de nourriture sur le comportement sensoriel sont effectués, l&#39;utilisation de nourriture pour restreindre l&#39;emplacement exploratoire spatial des vers, comme dans le test de rétention est également possible avec cette configuration. En outre, cette méthode n&#39;est pas destinée à étudier la navigation par gradient de stimulation en raison de la proximité et de petites quantités de gouttes de contrôle et de solution expérimentale utilisées. E_content &quot;&gt; À l&#39;avenir, le logiciel de programmation qui permet le suivi des absences multiples et l&#39;extraction des fonctionnalités à un seul défaut peut être intégré dans ce système 19 , 20. L&#39; enregistrement de paramètres de comportement subtiles du comportement de ver unique comme les vitesses d&#39;inversion et l&#39;amplitude des courbes corporelles fournira Une image plus détaillée du comportement chimiosensoriel d&#39;un ver individuel dans le contexte d&#39;un dosage basé sur la population. Le dosage peut également être modifié pour étudier l&#39;habituation par des trous de forage à travers le ROI à l&#39;aide d&#39;aiguilles de seringues avec la taille appropriée et remplissant les trous avec de l&#39;agar Avec le composé expérimental ou le tampon de contrôle. Cela assurera une concentration superficielle plus constante du composé sur une période de temps d&#39;enregistrement plus longue, comme cela est nécessaire pendant les études d&#39;habitude. Une autre application possible de cette méthode est de mener des études de comportement comparatives chez différentes espèces de nématodes. De plus, la chambre de comportementPeut être modifié de multiples façons d&#39;étudier les réponses comportementales aux stimuli multimodaux. Pour les applications opto-génétiques, des tableaux LED à haute intensité peuvent être attachés à côté de la monture de la caméra pour activer sélectivement les neurones d&#39;intérêt pendant l&#39;essai. Les éléments de chauffage, les systèmes de refroidissement et les capteurs de température peuvent également être ajoutés à la configuration pour étudier les effets de la température sur les comportements sensoriels. En outre, des systèmes de distribution d&#39;odeurs peuvent être installés à l&#39;intérieur de la chambre pour étudier les interactions entre les modalités odéronégatives et chimiosensorielles.

Les animaux à fourrage doivent intégrer les intrants à partir de multiples modalités sensorielles et choisir des stratégies comportementales appropriées afin de naviguer avec succès dans leur environnement. Comprendre comment les entrées sensorielles externes sont reçues et transduites en information neurale pour guider la sélection d&#39;action est un objectif central dans le domaine de la neurobiologie. Le nématode génétiquement traitable, C. elegans , est un organisme modèle attrayant dans lequel étudier les mécanismes neuronaux sous-jacents à la biologie sensorielle et l&#39;intégration multimodale. Bien que C. elegans ait seulement 302 neurones, il peut détecter et discriminer entre une grande variété de stimuli environnementaux, y compris les composés solubles, les odeurs volatiles et la température ambiante 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . leLe nématode C. elegans s&#39;appuie fortement sur son appareil chimiosensible pour localiser les sources de nourriture et pour s&#39;alourdir des menaces potentielles. Ainsi, les tests comportementaux conçus pour filtrer les réponses des C. elegans de type sauvage et mutant aux stimuli chimiques jouent un rôle crucial dans la dissection des mécanismes génétiques, cellulaires et neuronaux qui sous-tendent les capacités sensorielles remarquables de C. elegans . Pour analyser la réponse aux composés solubles, on a décrit trois types d&#39;essais: le test de chute, le dosage de chimiotaxie et le dosage de rétention. Dans le test de chute, une petite goutte du composé est placée à la queue d&#39;un ver mobile et la décision du ver pour inverser ou avancer une fois que le liquide atteint l&#39;appareil sensoriel antérieur est marquée 4 . Le test de chute nécessite peu de préparation expérimentale et est utile lorsque la taille de l&#39;échantillon de vers est faible, comme dans le cas des vers à laser. Cependant, comme un seul verPeut être testé à la fois et l&#39;expérimentateur doit être présent pendant toute la durée de l&#39;essai, le test de chute peut prendre beaucoup de temps. Le test de chute est également vulnérable aux variations de la livraison de la goutte entre chaque ver dans un échantillon, ce qui peut influencer les résultats globaux du dosage. Une autre limitation du test de chute est qu&#39;il ne peut être utilisé que pour analyser la réponse du ver à des composés aversifs car il n&#39;est pas possible de discriminer entre un effet attractif ou neutre du composé à partir du mouvement vers l&#39;avant du vers. Le dosage de la chimiotaxis pour les composés solubles implique généralement la division d&#39;une plaque de gélose en quatre quadrants, la solution expérimentale étant mélangée dans l&#39;agar de deux quadrants opposés et la solution témoin mélangée dans les deux autres quadrants 8 , 9 . Au début de l&#39;analyse, une goutte de tampon contenant des vers est placée au centre de la plaque et le nombre de vers dans<html> Chaque quadrant est marqué à différents moments. Le dosage de la chimiotaxie fournit une plus grande puissance statistique par rapport au test de chute, car un grand nombre de vers sont testés dans chaque essai. Cependant, une limitation de cette méthode est que la préparation des plaques de dosage de chimiotaxis nécessite de grandes quantités du composé expérimental. Cela rendra difficile la réalisation d&#39;écrans de comportement à grande échelle si un processus de purification complexe avec des rendements limités est nécessaire pour obtenir le composé d&#39;intérêt, comme dans le cas des molécules de signalisation d&#39;ascaroside 10 . En outre, le comptage manuel des vers tout au long de l&#39;analyse est susceptible d&#39;erreurs et la perturbation des plaques pendant le processus de comptage peut affecter les résultats. Contrairement aux deux procédés susmentionnés, le dosage de retenue utilise une vision mécanique, qui minimise l&#39;erreur lors du processus de notation et réduit l&#39;interférence de l&#39;expérimentateur pendant l&#39;essai<html> &gt; 11. L&#39;analyse informatisée des enregistrements vidéo du comportement des vers peut également révéler des dynamiques comportementales plus subtiles qui seront manquées lorsque la notation est effectuée uniquement sur quelques points temporels discrets. Dans le dosage de rétention, deux points de solutions sont ajoutés sur les côtés opposés d&#39;un petit patch alimentaire bactérien circulaire, suivi du placement d&#39;un petit nombre de vers dans le milieu du patch alimentaire. Le comportement des vers est ensuite enregistré, analysé, et une valeur d&#39;indice de préférence est calculée en fonction du nombre total de pixels de ver dans chaque région de solution. Bien que la présence d&#39;un patch alimentaire attrayant permet d&#39;utiliser de plus petites populations de vers dans chaque essai, les aliments ont déjà montré qu&#39;ils sensibilisent les agents de répulsion aux répulsifs solubles 12 . En outre, les vers affichent une réponse photophobe à la lumière à courte longueur d&#39;onde et l&#39;utilisation de sources lumineuses au microscope qui émettent de la lumière blanche dans l&#39;installation de l&#39;enregistrement du comportement peut affecter le comportementS = &quot;xref&quot;&gt; 13. Le but de la méthode décrite dans cet article est d&#39;enregistrer et d&#39;analyser la préférence de C. elegans pour les composés solubles en utilisant un dosage basé sur la population. À cette fin, la méthode actuelle intègre et améliore les aspects des trois méthodes décrites précédemment. Il permet de tester de grandes populations de vers et ne nécessite que de petites quantités de la solution expérimentale à utiliser dans chaque essai. En outre, l&#39;analyse est effectuée dans une chambre de comportement fermée personnalisée avec rétro-éclairage à infrarouge pour minimiser les effets de la lumière à courte longueur d&#39;onde sur le comportement. Chaque chambre peut également être équipée de caméras microscopiques multiples, ce qui augmente le débit expérimental sans compromettre l&#39;espace de banc. Enfin, le logiciel d&#39;analyse vidéo affiche la valeur de l&#39;indice de préférence pour chaque vidéo ainsi qu&#39;un graphique d&#39;occupation du ver accompagnant pour visualiser la dynamique du comportement de la population au fil du temps. La configuration de la chambre et unLe protocole Ssay peut être modifié pour étudier les réponses au comportement multimodal telles que l&#39;effet des odorants ou la température sur les comportements chimiosensibles. Cet article décrit la construction de la chambre de comportement et le protocole d&#39;essai. Il démontre également l&#39;utilité de cette méthode dans le dosage de la réponse de vers de type sauvage et de mutants défectueux chimiosensibles au répulsif soluble connu, ions de cuivre 4 . Enfin, le processus d&#39;analyse vidéo utilisant le logiciel fourni est détaillé.

<table><tbody><tr><td>Extrusions de charpente en aluminium à rainures en T</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T101</td><td>Profil simple, taille 1 », plein</td></tr><tr><td>Supports</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T236</td><td>1 » de long pour extrusions à profil unique de 1 » de haut Fixations</td></tr><tr><td>compactes à alimentation en bout</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T139</td><td>1 » (simple), paquet de 4</td></tr><tr><td>supports de panneaux pleins à visser</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T251</td><td>Pour</td></tr><tr><td>embouts en plastique</td> de 1 » de haute extrusion <td>McMaster-Carr</td><td>47065T91</td> Pour 1 » d’extrusion <td>de haut</td></tr><tr><td>Feuille d’acrylique coulée optiquement transparente</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K211</td><td>3/16 » d’épaisseur, 12 » x 12</td></tr>"<tr><td>Tissu de polyester enduit de vinyle</td><td>McMaster-Carr</td><td>88505K57</td><td>0,027 » d’épaisseur, 61 » de largeur,</td></tr><tr><td>noir Œillets</td> <td>en laitonMcMaster-Carr</td><td>9604K22</td><td>Taille commerciale 0, 0,545 » diamètre extérieur</td></tr><tr><td>Rondelles en acier</td><td>McMaster-Carr</td><td>90107A029</td><td>Vis 1/4 »</td></tr><tr><td>Vis à tête arrondie</td><td>McMaster-Carr</td><td>90272A546</td><td>1/4 » - 20 filetage, 1 - 1/2 » de long</td></tr><tr><td>Rétroéclairage de fonctionnement standard</td><td>Lumières Smart Vision</td><td>Voir le fournisseur local</td><td>8 » x 8 », infrarouge 850 nm</td></tr><tr><td>IVP-C1 Pot à commande variable</td><td>Smart Vision Lights</td><td>Voir le fournisseur</td><td></td>local</tr><tr><td>T1 Power</td><td>Supply Smart Vision Lights</td><td>Voir le fournisseur</td><td></td>local</tr><tr><td>Dino lite Pro AM4113T</td><td>Dino-Lite Digital Microscope</td><td>Voir le fournisseur</td><td></td>local</tr><tr><td>MS09B microscope</td><td>Dino-Lite Digital Microscope</td><td>Voir le fournisseur local</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse automatisée d&#39;un essai de préférence chimiosensible basée sur la population à base de nématodes

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

Le nématode, le système nerveux compact de Caenorhabditis elegans de seulement 302 neurones, sous-tend un répertoire diversifié de comportements. Pour faciliter la dissection des circuits neuronaux sous-jacents à ces comportements, le développement de tests comportementaux robustes et reproductibles est nécessaire. Les études antérieures antérieures de C. elegans ont utilisé des variations d&#39;un «test de chute», d&#39;un «test de chimiotaxie» et d&#39;un «essai de rétention» pour enquêter sur la réponse de C. elegans aux composés solubles. La méthode décrite dans cet article cherche à combiner les forces complémentaires des trois essais précités. En bref, un petit cercle au milieu de chaque plaque de dosage est divisé en quatre quadrants avec le contrôle et des solutions expérimentales placées alternativement. Après l&#39;addition des vers, les plaques de dosage sont chargées dans une chambre de comportement où les caméras de microscope enregistrent les rencontres de vers avec les régions traitées. L&#39;analyse automatisée de la vidéo est ensuite effectuéeEt une valeur d&#39;indice de préférence (PI) pour chaque vidéo est générée. L&#39;acquisition vidéo et les fonctionnalités d&#39;analyse automatisée de cette méthode minimisent la participation de l&#39;expérimentateur et les erreurs associées. En outre, des quantités minimes du composé expérimental sont utilisées par dosage et la configuration multi-caméras de la chambre de comportement augmente le débit expérimental. Cette méthode est particulièrement utile pour conduire des écrans comportementaux de mutants génétiques et de nouveaux composés chimiques. Cependant, cette méthode n&#39;est pas appropriée pour étudier la migration de gradient de stimulus en raison de la proximité étroite des régions de contrôle et de solution expérimentale. Il ne devrait pas non plus être utilisé lorsque seule une petite population de vers est disponible. Bien que approprié pour analyser les réponses uniquement aux composés solubles sous sa forme actuelle, cette méthode peut être facilement modifiée pour tenir compte de l&#39;interaction sensorielle multimodale et des études optogénétiques. Ce procédé peut également être adapté pour analyser les réponses chimiosensorielles d&#39;autres espèces de nématodes. </P&gt;

La figure 3A montre les valeurs d&#39;indice de préférence obtenues pour différents types de génotypes et d&#39;appariements de traitement. Une valeur d&#39;indice de préférence de 1 indique une forte attraction pour la solution placée dans le ROI expérimental alors qu&#39;une valeur d&#39;indice de préférence de -1 indique une forte répulsion. Un indice de préférence de 0,02 a été obtenu lorsque la solution tampon M13 a été placée à la fois dans les ROI de contrôle et expérimental, ce qui démontre qu&#39;il n&#39;y a pas de biais spatial vers un ROI. Les vers N2 ont fortement évité les ions de cuivre, ce qui donne un indice de préférence de -0,67, ce qui confirme les constatations antérieures selon lesquelles les ions de cuivre sont fortement répulsifs ( film supplémentaire 1 ) 4 . Les mutants osm-3 , qui ne présentent pas une formation adéquate des segments distal des cils sensoriels, ont montré une diminution significative de l&#39;élimination des ions de cuivre (PI = -0,19) 15 . Ocr-2 mutants, qui sont les<html> Dans de nombreuses réponses nociceptives médiées par ASH, y compris l&#39;évitement du cuivre, présentent également une diminution significative de l&#39;évitement et même une légère attraction pour les ions de cuivre (PI = 0,19) ( film supplémentaire 2 ) 16 . La figure 3B montre des parcelles représentatives d&#39;occupation des vers, qui indiquent la densité des vers dans le contrôle par rapport aux ROI expérimentaux dans le temps dans chaque vidéo. Plus la couleur de la zone de traçage est sombre, plus le nombre de pixels de ver dans le ROI est grand. Le tracé d&#39;occupation pour les vers N2 traités avec le contrôle tampon M13 montre que le nombre de vers dans les deux ROI reste similaire tout au long de l&#39;essai. Cependant, le parcours d&#39;occupation pour les vers N2 traités avec des ions de cuivre indique que les vers répandent fortement et systématiquement le ROI expérimental tout au long de l&#39;analyse. Gimg &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1: Représentation photographique et schématique de la conception de la chambre de comportement. ( A ) Vue de face de la configuration de la chambre de comportement (gauche) et de la représentation schématique correspondante du cadre de la chambre (à droite). Les feuilles de polyester opaques enferment la chambre sur toutes les faces sauf la face inférieure, ce qui permet de passer la lumière à partir du panneau de contre-jour infrarouge. Les nombres 1, 2 et 3 correspondent aux couches d&#39;extrusion dans (B). ( B ) Schéma de la vue de dessus des couches d&#39;extrusion comprenant le cadre de chambre de comportement. Cela comprend la couche supérieure (1), la couche d&#39;assemblage de la caméra du milieu (2) et la couche du niveau inférieur (3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig2.jpg"/&gt; Figure 2: Modélisation de la solution et modèles d&#39;alignement des plaques. ( A ) Le modèle de solution-placement comporte quatre marqueurs d&#39;alignement de quadrants et de nombres. La solution de contrôle est placée dans les quadrants supérieur gauche et inférieur droit tandis que la solution expérimentale est placée dans les quadrants supérieur droit et inférieur gauche. ( B ) Le modèle d&#39;alignement de plaque ne comporte que des marqueurs d&#39;alignement de nombres pour minimiser l&#39;occlusion des vers dans le champ de vision lors de l&#39;enregistrement et de l&#39;analyse vidéo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig3.jpg" /> Figure 3: Exemple de données recueillies à l&#39;aide de cet essai. ( A ) Valeurs de l&#39;indice de préférence (PI) pour N2 de type sauvage et C. elegans mutant </e<html> M&gt; en réponse au tampon M13 et à 10 mM de CuCl 2 . Les vers N2 n&#39;ont pas montré de préférence entre le contrôle et les ROI expérimentaux lorsque la solution de contrôle M13 a été placée dans les deux ROI mais a fortement évité le ROI expérimental lorsque des ions de cuivre ont été placés (PI = 0,02 et -0,67, respectivement). Les mutants osm-3 (p802) et les mutants ocr-2 (ak47) ont montré une diminution significative de l&#39;évitement des ions de cuivre par rapport à N2 (PI = -0,1 et 0,2, respectivement). N = 6 analyses pour chaque couple génotype-traitement,&gt; 360 vers par analyse, les barres d&#39;erreur indiquent ± 1 SEM, *** p &lt;0,001, ANOVA unidirectionnelle suivie d&#39;un test post-hoc Tukey Honestly Distributor (HSD). ( B ) Les parcelles d&#39;occupation de vers visuelles représentatives pour les vers N2 avec tampon M13 dans les ROI (en haut) et les vers N2 avec tampon M13 dans le ROI de contrôle et les ions de cuivre dans le ROI expérimental (en bas). L&#39;échelle de couleurs sous chaque parcelle d&#39;occupation représente le nombre de pixels sans fin.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Film supplémentaire 1: Réponse comportementale des vers N2 à 10 mM de chlorure de cuivre. Les vers sont attirés par les quadrants de contrôle avec le tampon M13 (supérieur gauche et inférieur droit) mais évitent fortement les quadrants contenant des ions de cuivre dissous dans le tampon M13 (en haut à droite et en bas à gauche). La vidéo a été enregistrée à 1 image par seconde et a accéléré 15x. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_Video_1.mp4">Cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a> Film supplémentaire 2: Réponse comportementale de ocr-2 (ak47) vers à 10 mM de chlorure de cuivre. Les vers se déplacent à peu près dans les deux rangs de contrôle avec le tampon M13 (supérieur gauche et inférieur droit) et le quadrantS contenant des ions de cuivre dissous dans le tampon M13 (en haut à droite et en bas à gauche) tout au long de la durée d&#39;enregistrement. Les mutants présentent une légère préférence pour les quadrants contenant des ions de cuivre au début de l&#39;enregistrement. La vidéo a été enregistrée à 1 image par seconde et a accéléré 15x. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_video_2.mp4">Cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a> Fichier supplémentaire: Modèles de placement de solution et d&#39;alignement de plaques. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/JoVE_template.pptx">Cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Nous présentons une configuration et un protocole d&#39;enregistrement du comportement qui permettent une analyse automatisée du nématode, la préférence de Caenorhabditis elegans pour les composés solubles dans un dosage basé sur la population. Cet article décrit la construction d&#39;une chambre de comportement, du protocole d&#39;analyse comportementale et de l&#39;utilisation d&#39;un logiciel d&#39;analyse vidéo.

Analyse automatisée d&#39;un essai de préférence chimiosensible basée sur la population à base de nématodes

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

L'objectif général de ce dispositif d'enregistrement comportemental et de ce protocole est de quantifier la préférence chimiosensorielle, au niveau de la population, de C. elegans pour des composés solubles à l'aide d'un système d'acquisition vidéo multiprise de vue, suivi d'une analyse automatisée des vidéos. Cette méthode peut faciliter la recherche en neurobiologie de C. elegans en permettant une analyse comportementale plus rapide et plus standardisée des mutants génétiques. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'analyser simultanément plusieurs réplicats dans des conditions identiques, tout en surveillant la dynamique temporelle de la réponse de la population de nématodes à des signaux solubles.La démonstration du montage de la chambre de comportement sera effectuée par Christopher Cronin, chercheur permanent de ce laboratoire. Commencez par préparer les housses en tissu, les barres de fixation de la caméra, les supports d'angle, les barres d'extrusion et l'ensemble de fixation de la caméra, comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. En partant des barres d'extrémité fixées à la barre centrale, attachez le support de caméra et les étuis à l'ensemble de fixation de la caméra.Ensuite, assemblez le cadre de la chambre comportementale. Commencez par fixer quatre barres en aluminium d'extrusion d'un pied à une feuille carrée de polyester. Faites glisser une barre sur les deux écrous en T de l'omni de la feuille de tissu, en centrant la barre selon la largeur du tissu.Serrer les fixations pour bien attacher la feuille de tissu à chaque barre. Étendre la feuille carrée en polyester sur la surface de travail, avec les quatre barres en aluminium fixées par-dessus. Ensuite, glisser huit supports d'angle sur les faces supérieures des quatre barres en aluminium, un à chaque extrémité de chaque barre.Positionner les supports d'angle sur les barres en alignant les jambes verticales des supports avec l'extrémité des barres, puis les fixer en serrant les vis dans les écrous en T. À chaque angle, placer une extrusion en aluminium d'un pied à la verticale, en glissant l'extrusion par-dessus les écrous en T situés sur les deux jambes du support d'angle. Ensuite, fixer la barre verticale aux barres horizontales en resserrant les attaches, reliant ainsi les deux barres horizontales adjacentes.Insérez les écrous à griffes libres du support de caméra en forme de H dans les montants verticaux du cadre. Laissez le H glisser complètement vers le bas afin qu’il repose sur les embouts d’angle situés à chaque coin du cadre. Fixez solidement l’ensemble du support de caméra en serrant les quatre vis des embouts d’angle.Ensuite, utilisez ces quatre barres d'aluminium profilées d'un pied pour assembler la couche inférieure de la chambre. Positionnez les embouts d'angle de manière à ce que les pattes des embouts soient alignées avec l'extrémité de la barre, puis serrez les vis pour les fixer en place. Puis, glissez les barres vers le bas entre les montants du cadre, en plaçant les écrous en T mobiles dans les rainures des montants.Positionner la barre de sorte que les bords supérieurs de leurs supports d'angle soient à un pouce sous l'extrémité ouverte des montants verticaux, puis fixer en place en resserrant les vis des supports d'angle. Ensuite, faire glisser les écrous en T des quatre feuilles rectangulaires en polyester dans les rainures des profilés extrudés verticaux afin de couvrir les côtés de la chambre, puis serrer les fixations pour les maintenir en place. Choisir un côté comme porte pour accéder à l'intérieur de la chambre et retirer les deux vis ainsi que les écrous en T situés à la couche inférieure de la chambre.Placer un capuchon en plastique sur l'extrémité supérieure de chaque coin afin de servir de pieds pour le cadre terminé. Retourner le cadre à l'endroit et insérer deux supports de panneau par lame à l'intérieur de la couche d'espace du cadre, puis les tourner pour les fixer en place. Ensuite, poser un morceau d'acrylique transparent de 12 pouces sur 12 pouces sur les supports de panneau afin de constituer une plateforme pour les plaques de dosage.Enfin, positionnez la caméra et le modèle de plateau comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. La veille de l'expérience, placez 28 plaques vides de 35 millimètres en piles de cinq ou moins sur une surface plane. Remplissez chaque plaque d'essai avec cinq millilitres de milieu de croissance pour nématodes sous forme d'agar et laissez les plaques d'essai sécher à l'air, couvercle ôté, toute la nuit à température ambiante.Le jour de l'expérience, allumez le rétroéclairage, démarrez l'ordinateur et lancez le logiciel de capture vidéo de la caméra du microscope. Connectez la caméra du microscope à l'ordinateur et cliquez sur la vignette numérotée de la caméra située en haut de la fenêtre du logiciel pour visualiser la diffusion en direct de la caméra. Pour régler les paramètres d'enregistrement vidéo, déroulez le menu de format vidéo situé dans le coin supérieur gauche de l'affichage de la caméra, puis sélectionnez MJPG 1280x1024.Ensuite, déroulez le menu du dossier situé à côté du menu du format vidéo et sélectionnez un dossier dans lequel enregistrer les fichiers vidéo. Cliquez sur l'icône d'exposition automatique située dans le coin supérieur droit du flux de la caméra et désactivez l'exposition automatique. Puis, cliquez sur l'icône LED située immédiatement à droite de l'icône d'exposition automatique pour éteindre les LED intégrées de la caméra du microscope.Cliquez sur l’icône des paramètres adjacente et sélectionnez « monochrome ». Maximisez le contraste et réglez la luminosité. Alignez un modèle de positionnement de solution sur le modèle d’alignement de la platine et cliquez sur l’icône d’enregistrement vidéo en accéléré située à gauche du flux vidéo de la caméra.Saisissez cinq secondes pour la durée et une seconde pour l'intervalle afin d'enregistrer une vidéo de calibration de cinq secondes à raison d'une image par seconde. Utilisez une pipette en verre de cinq millilitres pour ajouter 1,2 millilitre de tampon de milieu de croissance de nématodes dans une boîte contenant des vers synchronisés, puis agitez doucement la boîte pour transférer les vers dans le tampon. Aspirez le tampon depuis la boîte et déposez les vers dans le tampon dans un tube micro-centrifuge propre.Laisser les tubes en repos pendant une à deux minutes afin de permettre aux vers de sédimenter au fond. Ensuite, utiliser une pipette en plastique pour éliminer autant que possible le tampon de lavage, sans perturber le culot de vers agrégés au fond des tubes. Remplir à nouveau le tube avec un millilitre de tampon propre de milieu de croissance pour nématodes et répéter la procédure de lavage deux fois supplémentaires.Ensuite, fixez avec du ruban adhésif un modèle de positionnement des solutions sur la platine d'un microscope stéréoscopique. Puis, placez une bande de ruban adhésif double face de chaque côté d'un modèle d'alignement de plaque. Alignez le périmètre de la plaque de dosage avec le cercle présent sur le modèle d'alignement de plaque et appuyez fermement jusqu'à ce que le modèle adhère au fond de la plaque.Ensuite, alignez les repères du modèle de plaque de dosage avec les repères du modèle de positionnement des solutions sur le microscope stéréo. Puis, à l’aide d’une pipette P2, déposez un microlitre de tampon M13 dans chacun des quadrants un et quatre. Utilisez une nouvelle pointe pour déposer un microlitre de solution de CuCl₂ à 10 millimolaire dans chacun des quadrants deux et trois.Utilisez une pipette Pasteur en verre pour transférer les vers lavés sur les plaques d'essai une fois que les gouttes de solution ont été complètement absorbées par l'agar. Déposez une goutte de vers sur les zones situées au-dessus et au-dessous des régions circulaires traitées. Pliez le morceau de papier essuie-tout en quatre et utilisez son bord émoussé pour absorber l'excès de tampon de lavage sur les plaques d'essai.Disposez immédiatement les plaques de dosage sous les caméras du microscope dans la chambre comportementale en alignant les numéros des coins du gabarit. Attendez deux à trois minutes pour permettre aux vers de s'acclimater aux plaques de dosage. Ensuite, cliquez sur l'icône d'enregistrement vidéo en laps de temps située sur le côté gauche du flux vidéo de la caméra et saisissez une durée de 10 minutes et un intervalle d'une seconde pour enregistrer une vidéo de 10 minutes à raison d'une image par seconde.Enfin, cliquez sur Démarrer pour commencer l'enregistrement vidéo. Pour chaque image vidéo, la fonction d'indice de préférence compte le nombre de pixels de vers dans chaque région d'intérêt et calcule le pourcentage d'un pixel par rapport au nombre total de pixels dans la région d'intérêt. Les valeurs d'indice de préférence obtenues pour différents génotypes et combinaisons de traitement sont affichées ici.Une valeur positive de l'indice de préférence indique une attraction pour le traitement, tandis qu'une valeur négative de l'indice de préférence indique une répulsion. Un indice de préférence de 0,02 est obtenu lorsque la solution tampon M13 est placée dans les régions d'intérêt contrôle et expérimentale, démontrant l'absence de biais spatial. Ce graphique montre également que les vers N2 évitaient fortement les ions cuivreux, ce qui donne un indice de préférence de 0,67.En outre, les mutants osm-3, qui présentent un défaut de formation des cils sensoriels, et les mutants ocr-2, qui sont déficients dans les réponses nociceptives médiées par les neurones ASH, montrent une diminution de l'évitement et même une légère attraction envers les ions cuivreux. Lors de la mise en œuvre de ce protocole, il est important de travailler rapidement, tout en restant précis et constant. Le dispositif d'enregistrement et le protocole de test peuvent facilement être adaptés pour caractériser les réponses comportementales au niveau de la population, résultant des interactions entre les différentes variétés sensorielles de C. elegans.

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