La morphologie de poils absorbants d’Arabidopsis semis dans une bicouche Microfluidic plateforme d’imagerie

L’objectif global de cette méthode de culture à espacement microfluidique est de faire pousser des plantes directement à partir de graines dans un environnement structuré qui peut également être utilisé pour un traitement contrôlé et une imagerie à haute résolution des racines des plantules. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie végétale, telles que la façon dont la croissance des racines des plantes réagit aux signaux physiques et chimiques à plusieurs échelles de longueur. Le principal avantage de cette plate-forme est que les réparations sont confinées à une seule plaine, ce qui rend impossible de les traiter et de les imager sans perdre la mise au point optique.

Aujourd’hui, je serai assistée par le Dr Sahar Hasim, professeure agrégée de recherche à l’Université du Tennessee. Pour commencer, versez un rapport PDMS/agent de durcissement de 10:1 sur une plaquette maîtresse préfabriquée et sélénisée. Dégazez le PDMS dans une chambre à vide, puis durcissez le polymère dans un four à 70 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, utilisez un scalpel pour couper les dispositifs PDMS et décollez-les du maître. Ensuite, utilisez une biopsie de 1,5 millilitre pour perforer l’entrée de la graine à un angle de 45 degrés, afin d’encourager la croissance des racines dans le canal principal. Utilisez également le même poinçon pour dégager les entrées de traitement.

Utilisez du ruban adhésif pour enlever tous les débris de l’appareil et placez-le côté design vers le bas sur une glissière de couvercle en verre. Une fois assemblés, autoclavez les appareils. Placez les graines d’Arabidopsis thaliana dans un tube à microfuge et ajoutez un mélange d’eau de Javel et de détergent pour stériliser les graines.

Ensuite, lavez les graines quatre fois avec de l’eau stérile. Ensuite, stratifiez les graines en les réfrigérant dans le tube de microfuge pendant la nuit ou conservez-les jusqu’à une semaine à quatre degrés Celsius. Avant d’utiliser les dispositifs stériles, placez-les dans une chambre de dégazage sous vide, afin d’éliminer l’air du PDMS perméable aux gaz et des canaux fluidiques.

Cela améliorera le remplissage ultérieur des appareils. Retirez les dispositifs de la chambre à vide et immergez-les immédiatement dans une boîte de Pétri remplie de milieu liquide à base de plantes, à un pH de 5,7. À l’aide d’une pipette, aspirez le liquide à travers les entrées pour remplir l’appareil.

Assurez-vous qu’aucune bulle d’air ne reste à l’intérieur des canaux en les inspectant visuellement avant de les transférer dans des boîtes de Pétri individuelles fraîches et sèches. Ensuite, versez de la gélose chaude autour de l’appareil jusqu’à ce que le niveau de gélose soit presque aligné avec le haut de l’appareil. Dans un environnement stérile, utilisez une petite pipette et transférez une graine stérilisée à l’entrée de chaque appareil.

Ensuite, couvrez chaque boîte de Pétri d’un film de cire et placez-les dans une chambre de croissance à cycle sombre et clair à température ambiante. Orientez la boîte de Pétri dans la chambre de croissance à température ambiante, verticalement, afin que la gravité encourage les racines à pousser à travers le canal. Au moment souhaité et au stade de développement de la plantule, utilisez une pipette pour ajouter une quantité prescrite du traitement expérimental à chacun des huit ports latéraux des appareils.

Lorsque vous avez terminé, refermez les boîtes de Pétri avec un film de cire. Ensuite, remettez-les dans la chambre de croissance. Ajustez le grossissement d’un microscope à fond clair inversé, entre 4x et 20x.

Placez l’ensemble de la boîte de Pétri contenant l’appareil et la plantule sous le microscope pour une imagerie en fond clair ou à contraste interférentiel différentiel. Optimisez les conditions d’éclairage en ajustant les temps d’exposition, la luminosité de la lampe, l’ouverture et la polarité de la lumière afin d’élucider les caractéristiques morphologiques qui vous intéressent. Ensuite, conduisez la scène jusqu’à la zone souhaitée de la racine et concentrez-vous sur la racine ou les cheveux de la racine qui vous intéressent.

Acquérez un seul point temporel ou une série chronologique d’images pour visualiser la croissance des poils racinaires. Pour la série chronologique, imagez les poils racinaires en croissance une fois par minute. Pour visualiser la croissance de la racine principale, acquérez une image toutes les 30 minutes.

Une fois terminé, remettez la boîte de Pétri et les plants dans la chambre de croissance, en position verticale. Une fois que le semis a poussé pendant le temps souhaité, utilisez une paire de pinces pour retirer la lamelle et le dispositif de la gélose. Ensuite, mouillez un mouchoir de laboratoire avec de l’éthanol et utilisez-le pour nettoyer le bas de la lamelle.

Appliquez l’huile appropriée sur un objectif à immersion dans l’huile 63x et placez la lamelle sur la platine du microscope. Ensuite, montez le niveau pour contacter le média d’immersion sur l’objectif. Optimisez les conditions d’éclairage, en ajustant les temps d’exposition, la luminosité de la lampe, l’ouverture et la polarité de la lumière.

Ensuite, conduisez la scène jusqu’à la zone souhaitée de la racine et concentrez-vous sur les poils racinaires d’intérêt. Pour quantifier la croissance des poils racinaires au fil du temps, configurez le logiciel pour qu’il acquière une image par minute, à l’endroit d’intérêt. Afin de visualiser l’autofluorescence des plantes ou les marqueurs de fluorescence, minimisez le temps d’exposition à la fluorescence, tout en conservant un signal fluorescent identifiable.

Acquérez des images des organites aussi rapidement que le temps d’exposition le permet. Une fois que le semis a poussé pendant la durée souhaitée, retirez l’appareil et la lamelle de la boîte de Pétri. Retournez l’appareil et décollez délicatement la lamelle de recouvrement afin que la racine reste dans le canal PDMS.

Placez le dispositif PDMS sur un substrat plat réfléchissant, tel qu’un microrevêtement en or, puis montez le dispositif sur le support d’échantillon AFM, racine vers le haut. Après avoir fixé une fixation de puits de liquide sur le dessus de l’appareil PDMS, remplissez-le d’eau pour garder les racines hydratées pendant l’imagerie. Une fois que l’éprouvette a été chargée dans l’AFM, ajustez la commande z à l’épaisseur du dispositif PDMS et entraînez le porte-à-faux vers la région d’intérêt sur la racine.

À l’aide d’une caméra pour vous guider, alignez le laser avec la pointe du cantilever et utilisez l’imagerie en mode contact pour exercer une force minimale sur la racine pendant le balayage. Abaissez lentement le mécanisme de balayage jusqu’à ce que le cantilever entre juste en contact avec l’échantillon. Ensuite, ajustez la taille de balayage pour la région souhaitée et choisissez une vitesse de balayage d’une ligne par seconde avec 256 points de tension par ligne.

Enfin, obtenez le scan. Les dispositifs microfluidiques PDMS à deux couches décrits ici ont un canal central de 200 micromètres de haut pour la racine principale d’Arabidopsis et deux chambres latérales de 20 micromètres de haut, pour confiner les poils racinaires à croissance latérale. Cela garantit que les poils racinaires sont sur le même plan d’imagerie, que la racine principale.

Au sein de la plateforme microfluidique, les poils racinaires peuvent être quantifiés au niveau cellulaire, en termes de longueur, de densité et d’angularité de leur croissance à partir de la racine. L’un des principaux avantages de l’utilisation d’une plate-forme microfluidique est la possibilité d’ajouter uniformément des concentrations précises de traitements chimiques aux organismes. Ici, un semis est imagé avant et après l’ajout de billes de polystyrène carboxylé fluorescent

L’ajout de ce traitement abiotique, n’a pas perturbé l’orientation du foyer optique des poils racinaires des plantules. À l’aide de marqueurs fluorescents, un écoulement cytoplasmique peut être observé dans un poil racinaire. Le mouvement de ces trois organites est capturé dans ce graphique de distribution cumulative.

En plus de l’imagerie optique, cette plateforme permet également l’imagerie AFM et MEB, grâce à sa capacité à être démontée, sans perturber la racine. Après cette procédure, d’autres méthodes, y compris l’imagerie chimique, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que à quoi ressemblent les profils chimiques autour de la racine.