Name: Perles base essai Multiplex pour l’analyse des profils de Cytokine de larme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Découvrez le profilage des cytokines dans les larmes humaines par essai multiplex à base de billes. Cette méthode permet d'analyser plusieurs analytes avec de petits volumes d'échantillon pour l'ophtalmologie.

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Le travail de recherche a été appuyé par la subvention du Centre de Tan Tock Seng Hospital personnalisé semences financement programme 2015 ; Singapour Eye Research Institut pilote Grant et Tan Tock Seng Hospital Pitch pour fonds de subvention.

les protocoles utilisés dans cette étude ont été approuvées par la Commission de révision institutionnelle de Tan Tock Seng Hospital, Singapour.
 1. analyse de Cytokine déchirer <ol><li>Collection de larmes : <ol><li>demander l’objet s’asseoir confortablement sur un fauteuil d’examen et de placer sa tête contre l’appui-tête.</li>
		<li>Poser la question à chercher, ouvrir les bandes de Schirmer (en filtre Whatman no 41) et placez délicatement l’extrémité arrondie de la bande sur le cul-de-sac inférieur de le œil et instruire le sujet à fermer les yeux pendant 5 min. Alors qu’elles ramassaient les larmes prennent particulièrement soin de minimiser le contact avec la surface oculaire. 30</li> <li>demander l’objet pour ouvrir ses yeux pour enlever la bande et le placer dans un tube de microtubes stériles de 1,5 mL. Transférer immédiatement le tube pour le laboratoire ou les conserver à-80 o C jusqu’au test pour le profilage de la cytokine.</li>
	</ol></li> <li>Élution d’échantillon de larme de languette d’écoulement : <ol><li>couper la languette de flux sur une longueur de 0,5 cm (pour normaliser la quantité de larmes à tester) et le placer dans un tube de microtubes stériles de 1,5 mL.</li>
		<li>Ajouter 30 µL de tampon de dosage et incuber à température ambiante pendant 5 min, suivi par centrifugation du tube à 14 000 x g pendant 1 min.</li>
		<li>Transvaser le surnageant dans un autre tube de microtubes de 1,5 mL et jetez la bandelette. Placer l’échantillon contenant le tube sur la glace et utiliser l’exemple de larme éluées immédiatement pour le profilage de la cytokine.</li>
	</ol></li> <li>Préparation des réactifs : Remarque : les analytes de quarante un à tester dans chaque échantillon de dosage multiplex perle basé sont interleukine (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, il-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, p70 de IL-12, IL-13, IL-15, IL-17 a, interféron alpha (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-gamma-inducible protein 10 (IP-10, CXCL10), dérivé de macrophage chemokine (MDC), protéine inflammatoire macrophage (MIP)-1α et MIP-1β, monocyte protéine chimiotactique (MCP) -1, MCP-3, le facteur de nécrose tumorale-alpha (TNF-α), TNF-β, croissance régulée oncogène (GRO), alpha de facteur de croissance de tumeur (TGF-α), facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), facteur de croissance épidermique (EGF), fibroblastes facteur de croissance (FGF) -2, plaquettes dérivées de facteur de croissance (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, facteur stimulant les colonies de granulocytes (G-CSF), facteur de stimulation des colonies de granulocytes et macrophages (GM-CSF), éotaxine, fractalkine, soluble CD40 ligand (sCD40L), Fms-like ligand de tyrosine kinase 3 (Flt - 3L) et réglé lors de l’activation, lymphocytes normaux exprimée et sécrétée protéine (RANTES).
	<ol><li>Mettre les flacons de solution (50 X) anticorps perle à température ambiante (20-25 o C) et vortex les flacons pendant 1 min.</li>
		<li>Compter le nombre de puits nécessaires pour le dosage et calculer la quantité d’anticorps total perle cocktail solution (25 µL / puits) et chaque anticorps perle (50 X) requis pour le test.</li>
		<li>Préparer la solution cocktail en ajoutant le montant calculé de chaque anticorps perle solution et le remplissage jusqu’au volume final souhaité en ajoutant le montant restant de perle diluant. S’assurer que la concentration finale de chaque anticorps dans le cocktail est 1 X. Préparez toujours au moins 20 % volume supplémentaire de cocktail solution en cas d’erreur de pipettage. 
		NOTE : À titre d’exemple, pour un dosage de 96 puits préparer 3000 µL de solution cocktail d’anticorps perle. La quantité nécessaire de chaque solution de perle anticorps = 3000/stock concentration de chaque solution de perle d’anticorps ; 3000/50 = 60 µL de chaque solution de perle d’anticorps <ol><li>ajouter 60 µL de chacune des solutions perle 41 anticorps (60 X 41 = 2460 µL) en cocktail bouteille et 540 µL de solution de diluant de perle s’ajoute le mélange de perle d’anticorps à faire 3000 µL de finale solution de travail (X 1).</li>
			<li>Avant toute utilisation, mélanger la solution cocktail perle correctement. Après le test de stocker le volume restant à 2-8 o C pendant 30 jours.</li>
		</ol></li> <li>Préparer les contrôles de qualité (QC) en ajoutant 250 µL désionisée eau aux stocks QC 1et 2 QC.</li>
		<li>Mélanger correctement de coucher les bouteilles plusieurs fois et vortex pendant 10 s. transfert la solution à correctement étiqueté polypropylène microtubes à centrifuger et stocker le reste de la solution à-20 ° C, qui peut être utilisé jusqu'à 30 jours.</li>
		<li>Préparation du tampon de lavage en ajoutant 30 mL 10 X 270 mL d’eau désionisée solution tampon de lavage et bien mélanger (avant dilution, porter le tampon de X 10 à température ambiante et dissoudre tous les précipités de sels en mélangeant). Stocker le tampon de lavage inutilisés (1 X) à 2-8 ° C, qui peut être utilisé jusqu'à 30 jours.</li>
		<li>Préparer le stock standard de cytokine humaine (10 000 pg/mL de tous les analytes) en ajoutant 250 µL désionisée eau le flacon en stock. Mélangez bien en inversant plusieurs fois et vortex le flacon pour 10 s. laissez-le reposer pendant 10 min et transférer la solution mère à correctement étiqueté polypropylène microtubes à centrifuger. Après l’essai, ranger le reste de la solution à-20 ° C, qui peut être utilisé jusqu'à 30 jours.</li>
		<li>Préparer les étalons de travail humain cytokine par dilutions successives 5 fois (50 µL - &#62; 200 µL) avec tampon pour obtenir 2000, 400, 80, 16 et 3,2 pg/mL.</li>
		<li>Après une préparation standard, utiliser les normes de travail dans les 60 min et utilisez le tampon blanc/fond (-pg/mL).</li>
	</ol></li> <li>Cytokine profilage de perle basé essai multiplex : <ol><li>ramener tous les réactifs à température ambiante puis vortexer pendant 5-10 secondes avant de les ajouter à la Microplaque 96 puits. Si le lacrymogènes éluées échantillons sont conservés à -80 o C avant le test, décongeler les extraits de larme congelés sur la glace et centrifuger à 1000 X g pendant 5 min.</li>
		<li>Préparer une feuille de travail de dosage dans une configuration verticale pour étalons de cytokines humaines [0 (vide), 3.2, 16, 80, 400, 2 000 et 10 000 pg/mL], QC1, QC2 et échantillons.</li>
		<li>Ajouter 200 µL de 1 X tampon de lavage à chaque puits de la plaque, fermez-le hermétiquement avec film adhésif et gardez-le sur un agitateur de plaque à température ambiante (20-25 o C) pendant environ 10 minutes</li>
		<li>Décanter le tampon de lavage X 1 en inversant la plaque et tapez-le sur serviettes absorbantes plusieurs fois pour enlever toute la quantité résiduelle de tampon de lavage dans les puits.</li>
		<li>Ajouter 25 µL de chaque travail humain cytokine standard, QC1, QC2, vierge (tampon) et d’échantillons dans les puits appropriés.</li>
		<li>Ajouter 25 µL de tampon dans chaque puits.</li>
		<li>Ajouter 25 µL de 1 X anticorps perle cocktail solution dans chaque puits. Comme la solution de perle d’anticorps est sensible à la lumière, la flasque avec film adhésif et couvrez-la de papier d’aluminium pour protéger de la lumière pendant le test.</li>
		<li>Incuber la plaque à 4 o C pendant la nuit sur un agitateur.</li>
		<li>Placer la plaque sur la grille de la plaque d’une machine à laver automatique de plaques magnétiques. Laisser reposer pendant 1 min régler les billes magnétiques au fond du puits et aspirer le contenu bien. Ajouter 200 µL de tampon de lavage / puits et laisser reposer pendant 1 min et puis aspirer le contenu bien. Répéter le lavage une fois de plus (pour le lavage de la plaque, suivre le fabricant du kit &#39; instructions de s).</li>
		<li>Ajouter 25 µL de solution de détection des anticorps dans chaque bien, sceller la plaque, couvrez-la de papier d’aluminium et laisser incuber à température ambiante pendant 60 min sur un agitateur.</li>
		<li>Ajouter 25 µL de Streptavidisolution n-phycoérythrine dans chaque puits, sceller la plaque, couvrez-la de papier d’aluminium et laisser incuber à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur.</li>
		<li>Placer la plaque sur une rondelle plaque magnétique. Laissez-la reposer pendant 1 min et puis aspirer le contenu bien. Ajouter 200 µL de tampon de lavage par puits. Laissez-la reposer pendant 1 min et puis aspirer le contenu bien. Répéter le lavage.</li>
		<li>Ajouter 150 µL de liquide de gaine pour chaque bien et placer la plaque sur un agitateur pendant 5 min à température ambiante pour remettre en suspension les perles anticorps.</li>
		<li>Lire la plaque immédiatement à l’aide du talon basé lecteur de plaques d’essai multiplex et d’analyser les concentrations de cytokines à l’aide d’un algorithme de lissage 5 paramètres. Un diagramme de flux du profilage de cytokine de larme est illustré à la Figure 1.</li>
	</ol></li> <li>Lecture de la plaque d’essai (instrument mis en place) et l’analyse des données : <ol><li>Switch sur la pastille basé lecteur essai multiplex et chaud avant le laser pendant 30 min.</li>
		<li>Lancer le logiciel d’essai multiplex perle basé. En vertu de la &#39; Maintenance automatisée &#39; onglet, sélectionnez le &#39; Etalonnage-vérification &#39; option. Vortex chaque réactif flacon des perles d’étalonnage et de vérification pour 30 s. déposer 5 gouttes de chaque réactif dans les puits désignés. Remplir les réservoirs désignés d’éthanol 70 % et de l’eau désionisée.</li>
		<li>Créer un nouveau protocole <ol><li>ouvrir la &#39; protocoles &#39; page puis la &#39; protocoles &#39; onglet &#34; créer un nouveau ProtocolŔ le &#39; paramètres &#39; onglet s’ouvrira.</li>
			<li>Dans le &#39; nom &#39;, tapez le nom du protocole.</li>
			<li>Tapez une description dans la zone à droite de la &#39; nom &#39; boîte.</li>
			<li>Dans la &#39; Version &#39;, tapez la version du protocole.</li>
			<li>Dans la &#39; fabricant &#39;, tapez les informations du fabricant pour le protocole.</li>
			<li>Définir les paramètres dans le &#39; réglages d’Acquisition &#39; section comme suit. La valeur &#39; Volume &#39; : 100 µL, &#39; Timeout &#39; : 60 s ; &#39; DD Gating &#39; : 8 000 à 15 000 ; &#39; Reporter Gain &#39; : PMT Standard ; &#39; Type de perles &#39; : billes magnétiques.</li>
			<li>Définir les paramètres dans le &#39; paramètres d’analyse &#39;, l’article en sélectionnant &#39; Quantitative &#39; comme le type d’analyse. La valeur &#39; nombre des normes &#39; : 6 ; &#39; Nombre de contrôles &#39; : 0 ; Cochez la &#39; signifie de réplique &#39; boîte ; 
			Cochez la &#39; analyser les résultats tout en acquérant des échantillons &#39; boîte.</li>
			<li>Clic &#34; NextŔ la &#39; Analytes &#39; onglet s’ouvre, cliquez sur les analytes désirés (ID de billes) dans la grille numérotée analyte.</li>
			<li>Click et le type de l’analyte correspondant le nom dans le &#39; nom &#39; colonne à droite de la grille de l’analyte (analytes &#39; noms et leurs détails de région perle correspondants ont été mentionnés dans le tableau 1).</li>
			<li>Cliquez sur et tapez l’unité de mesure (c'est-à-dire pg/mL) dans le &#39; unités &#39; case à gauche de la &#39; appliquer tout &#39; bouton. Puis cliquez sur &#34; appliquer tout &#34;.</li>
			<li>Cliquez sur et tapez le talon souhaité compter pour chaque analyte (c.-à-d. 50) dans le &#39; comte &#39; boîte. Cliquez sur &#34; s’appliquent à tous les &#34;.</li>
			<li>Clic &#34; NextŔ ouvre l’onglet disposition de la plaque. Mettre en évidence les puits pour les normes et sélectionnez &#34; 2 &#34; moins comte de répliquer et cliquez sur le &#34; S &#34; bouton Standard. Répétez cette étape pour l’arrière-plan &#34; B &#34; et échantillons &#34; U &#34; puits.</li>
			<li>Cliquez &#34; sauver &#34;.</li>
		</ol></li> <li>Créer de nouveaux Lots de normes/contrôle <ol><li>ouvert le &#39; protocoles &#39; page et puis le &#39; normes &#38; contrôles &#39; onglet &#34; créer de nouveaux Lots Standard/contrôle &#34;.</li>
			<li>Ouvert le &#39; sélectionner le protocole &#39; boîte. Sélectionnez le protocole qui a été créé à l’étape 1.5.3.</li>
			<li>-Clés dans la dénonciation des normes en conséquence : numéro du kit Std/Ctrl, nom kit Std/Ctrl, expiration et fabricant.</li>
			<li>Clé à la valeur de la norme plus élevée pour chaque analyte (c'est-à-dire 10000 pg/mL). Saisissez 5 en vertu de la dilution et cliquez sur &#34; appliquer tout &#34; pour générer automatiquement les concentrations prévues pour le reste des normes.</li>
			<li>Cliquez &#34; sauver &#34;.</li>
		</ol></li> <li>Créer un nouveau lot d’un protocole existant <ol><li>ouvert le &#39; lots &#39; page et cliquez sur &#34; créer un onglet nouveau lot à partir d’un protocole existant &#34;.</li>
			<li>Tapez le nom de la feuille dans le &#39; nom de la feuille &#39; zone, puis tapez une description du lot dans la &#39; Description facultative entrer &#39; boîte.</li>
			<li>Cliquez sur le protocole généré précédemment (à l’étape 1.5.3).</li>
			<li>Clic &#34; NextŔ l’onglet suivant qui s’ouvre est la &#39; MST &#38; baguettes &#39; onglet Afficher les détails des normes de test et sélectionnez &#34; prochain &#34;.</li>
			<li>Sur la &#39; schéma &#39; onglet, assigner des commandes bien pour ce lot et cliquez sur &#34; enregistrer &#34; pour enregistrer les informations de traitement par lots à le &#39; en attente de traitement par lots &#39; liste.</li>
			<li>Charger la plaque dans le lecteur de plaques d’essai multiplex perle basé, secouez-la pendant 5 min et exécuter le lot dans la liste de commandes en attente. Les données acquises seront enregistrées dans le format de fichier .csv.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Analyse <ol><li>convertir le fichier .csv généré à partir du logiciel d’essai multiplex perle basé au format de fichier (fichier de données de résultats) .rbx en utilisant le logiciel de conversion de rbx. Lancez le logiciel de conversion, sélectionnez le fichier .csv sous xPONENT sélectionner fichier (s) et cliquez sur le &#34; générer &#34; bouton ; le fichier .rbx sera sauvegardé dans le dossier de sortie sélectionné.</li>
		<li>Lancer le logiciel d’analyse et ouvrez le fichier .rbx.</li>
		<li>Optimiser les courbes d’étalonnage à l’aide de l’ajustement de la courbe 4PL/5PL.
		<ol><li>Sélectionnez ce qui suit dans la &#39; courbe Standard &#39; onglet : &#39; régression Type &#39; : &#39; Logistic-5PLƆ &#39; axe Transformation &#39; : &#39; log - tique Ɔ linéaire (y) le &#39; afficher les lignes de gamme Conc &#39; boîte ; cochez la &#39; Show inconnu Échantillons &#39; boîte ; Cochez la &#39; montrer des échantillons de contrôle &#39; boîte ; Cochez la &#39; appliquer à travers tous les analytes &#39; boîte ; Cochez la &#39; afficher le rapport après optimisation &#39; boîte.</li>
			<li>Cliquez sur le &#34; Optimize &#34; bouton pour auto-optimisation.</li>
		</ol></li> <li>L’identité de l’échantillon sous l’étiquette &#39; entrez échantillon Info &#39; Tab</li>
		<li>Obtenir les concentrations observées dans les &#39; rapport Table &#39; onglet et cliquez sur &#34; Exporter rapport table &#34; pour générer les données dans un fichier de feuille de calcul pour une analyse ultérieure.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer. Aucun intérêt financier ou les conflits d’intérêts.

Cytokines sont de petites protéines sécrétées cellulaires et puissants immunomodulateurs, régulation des réponses immunitaires. 32 les profils d’expression des cytokines divers échantillons sont associés à diverses pathologies de le œil et les études sur les cytokines profils aident à comprendre les mécanismes de la pathogenèse de la maladie, de déterminer l’état de santé oculaire, la larme gravité de la maladie, le diagnostic et la progression. 2 , <sup class="x...

Larmes sont produites par la glande lacrymale et les glandes accessoires et enduire la surface externe de le œil. Film lacrymal est constitué d’une couche de lipides externe et une couche interne aqueuse contenant des protéines solubles, mucines et membrane liée mucines. Larmes prévenir les invasions microbiennes, fournissent des nutriments et fourniront une lubrification à la surface oculaire. Larmes agissent comme interface entre l’air et le tissu pour le transport de l’oxygène à la cornée. 1 film lacrymal est composé de protéines, des glucides, des lipides et des électrolytes. L’association entre les protéines de déchirure avec les maladies systémiques et oculaires comme le glaucome, maladie de sécheresse oculaire, conjonctivite vernal, mellitus de diabète, le cancer et l’Orbitopathie associé à la glande thyroïde a été identifiée dans plusieurs études. 2 , 3 , 4 échantillons lacrymal peuvent être recueillis par microcapillaire tubes ou écoulement lacrymal bandes (bandes Schirmer). En outre, test de la Schirmer est une procédure standard suivie dans la cornée et les cliniques de chirurgie réfractive, dont les résultats peuvent servir pour les tests d’analyse de cytokine. Prélèvement d’échantillons non invasifs, accessibilité du bio-spécimen et l’association de la composition de la déchirure avec diverses conditions physiologiques et pathologiques faire déchirer le film une source potentielle de biomarqueurs pour plusieurs maladies oculaires et systémiques. 4 , 5 , 6
Larme de cytokines joue un rôle important dans l’étude de la santé oculaire de surface et des inflammations des diverses maladies oculaires. 7 des concentrations anormales de plusieurs cytokines dans les échantillons de le lacrymogènes ont été signalées à être associée à la maladie de l’oeil sec, kératoconjonctivite vernal (VKC), kératoconjonctivite atopique (AKC), la conjonctivite allergique saisonnière et uvéite. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 larme protéines peuvent être analysées par les méthodes traditionnelles comme la spectrométrie de masse, western blot et dosages immuno-enzymatiques (ELISA). 14 , 15 Toutefois, les limitations de ces méthodes sont une sensibilité médiocre et un plus grand volume d’échantillon requis pour l’analyse de plusieurs cytokines larme chez chaque patient. 16 , 17 épreuves multiplex perle basé ont été développés afin d’analyser plusieurs analytes dans des échantillons de mélange complexe et appliqués avec succès sur des échantillons de larme d’analyser plusieurs cytokines dans différentes maladies. 6 , 18 A combinaison de sandwich ELISA et techniques de cytométrie en flux permettent à ces tests devenir plus sensible que le test ELISA pour la quantification des analytes multiples dans un seul échantillon. 19 cette méthode peut être appliquée sur une variété d’échantillons cliniques et les surnageants de culture cellulaire et contribue à l’étude des réactions immunitaires dans plusieurs conditions physiopathologiques. 20 , 21 , 22 , 23 , 24
Il existe plusieurs études comparant multiplex perle basé dosages avec ELISA et ont signalé une corrélation entre les méthodes. Loo et coll. comparé perle basé essai multiplex avec classique ELISA pour la détection de l’adiponectine, résistine, la leptine et la ghréline dans des échantillons de sérum ou de plasma humain et a signalé une forte corrélation (r &#62; 0,9) entre les essais. 25 Dupont et coll. a signalé une forte corrélation entre les dosages multiplex perle basé et ELISA pour la détection de l’IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ et le TNF-α de la phytohémagglutinine et lipopolysaccharide stimulent le sang total recueillis auprès de femmes enceintes. 26 Pickering et coll. ont une autre forte corrélation entre essai multiplex perle basé et ELISA pour la détection d’anticorps sériques à Haemophilus influenza type b polysaccharide (r = 0,96), anatoxines de Clostridium tetani (r = 0,96) et Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). 27 Biagini et coll. a signalé une forte corrélation positive (r = 0,852) entre essai multiplex perle basé et ELISA pour la détection de Bacillus anthracis anti-PA IgG dans le sérum. 28 Wang et coll. a signalé une corrélation entre l’essai multiplex perle basé et ELISA pour la détection des biomarqueurs de la maladie d’Alzheimer amyloïde-β 42 (r = 0,77), tau totale (r = 0,94) et tau phosphorylée sur acides aminés 181 (r = 0,82) dans échantillons de liquide céphalorachidien. 29 de ces études ont démontré que l’applicabilité de perle issu des épreuves multiplex divers échantillons cliniques, exigences de volume plus petits échantillon et une corrélation avec la technique ELISA, qui rendent les épreuves multiplex perle basé à un prometteur alternative aux méthodes traditionnelles de ELISA pour la détection de plusieurs analytes dans différent type d’échantillons à des phénotypes différents de la maladie. Nous décrivons ici un protocole normalisé pour essai multiplex perle basé pour le profilage de la cytokine pour 41 analytes en larme échantillons prélevés sur des sujets en bonne santé en utilisant des bandes de Schirmer.

<table><tbody><tr><td>Panneau de billes magnétiques de cytokines / chimiokines humaines Milliplex MAP -1 kit</td><td>Merck, USA</td><td>HCYTOMAG-60K-41</td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D luminex instrument&nbsp ;</td><td>Luminex Corp, Austin, TX, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xPonent software&nbsp ;</td><td>Luminex Corp, Austin, TX, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RBXGenerator software</td><td>BIO-RAD, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Plex Manager 6.1</td><td>BIO-RAD, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitateur de plaques</td><td>Corning, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TECAN Microplate Washer</td><td>Tecan, Suisse</td><td>HydroSpeed</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries inc, États-Unis</td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Mettler Toledo, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation de 1,5 ml</td><td>Axygen, États-Unis</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Bandelette de test de débit lacrymal Schirmer</td><td>Eye Care and Cure, États-Unis</td><td>101657</td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D Calibration Kit</td><td>Luminex Corp, Austin, TX, USA</td><td>40-028</td><td></td></tr><tr><td>Kit de vérification 3D Flexmap</td><td>Luminex Corp, Austin, TX, USA</td><td>40-029</td><td></td></tr><tr>Chaise <td></td><td></td><td></td><td>d’examen oculaire</td></tr></tbody></table>

perles base essai multiplex pour l’analyse des profils de cytokine de larme

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Film lacrymal est un mélange complexe de lipides, de protéines et de minéraux qui recouvre la surface externe de le œil, fournissant ainsi la lubrification, de nutrition et de protection pour les cellules sous-jacentes. Analyse des larmes est un domaine émergent pour l’identification de biomarqueurs pour la prédiction, diagnostic et pronostic des maladies oculaires différents. Larmes sont facilement accessibles et leur collection est non invasif. Donc, technologies avancées gagnent en importance pour l’identification de plusieurs analytes en larmes pour étudier les changements dans la composition de protéines ou de métabolite et son association avec certaines pathologies. Larme de cytokines sont des biomarqueurs idéales pour l’étude de la santé de la surface oculaire et aussi aider à comprendre les mécanismes des différents troubles de la surfaces oculaire comme maladie de le œil sec et conjonctivite vernal. Dosages multiplex perle basé ont la capacité de détecter plusieurs analytes dans une petite quantité d’échantillon avec une sensibilité plus élevée. Nous décrivons ici un protocole normalisé de prélèvement d’échantillons de larme, extraction et analyse des cytokines profilage à l’aide d’un cordon fonction essai multiplex.

Larme échantillons ont été prélevés de 8 yeux de 4 sujets sains en utilisant des bandes de flux lacrymal et des niveaux de cytokine ont été analysées à l’aide du protocole mentionné ci-dessus. Tous les sujets étaient des hommes et l’âge des quatre sujets était de 36, 42, 44 et 52 ans respectivement. Santé de surface oculaire et sécheresse oculaire la maladie a été évaluée par des tests cliniques (larme film rompre temps, de Schirmer test, coloration cornéenne, coloration conjonctive, exam...

Analyse du film lacrymal permet de cytokines dans l’étude de diverses maladies oculaires. Dosages multiplex perle basé sont simples et sensibles et permettent l’essai de plusieurs cibles dans les échantillons de petits volumes. Nous décrivons ici un protocole pour tear film cytokine profilage à l’aide d’une perle basé essai multiplex.

Perles base essai Multiplex pour l’analyse des profils de Cytokine de larme

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

L'objectif général de ce protocole est d'étudier les profils de cytokines dans des échantillons de larmes humaines recueillis à l'aide de bandes de Schirmer, en utilisant un dosage multiplexe basé sur des billes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'ophtalmologie, comme le rôle des cytokines dans diverses maladies oculaires. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'analyser plusieurs analytes à partir de petits volumes d'échantillon.La démonstration de la procédure sera effectuée par Praveen Balne, un post-doctorant de mon laboratoire. Après avoir prélevé des larmes sur un sujet selon le protocole décrit, couper la bande de prélèvement de flux lacrymal sur une longueur de 0,5 centimètre et la placer dans un tube stérile de 1,5 millilitre. Ajouter 30 microlitres de tampon de dosage et incuber le tube à température ambiante pendant cinq minutes.Ensuite, centrifuger le tube à 14 000 × g pendant une minute. Transférer le surnageant dans un autre tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et jeter la bandelette. Puis placer le tube contenant l'échantillon sur de la glace et utiliser immédiatement l'échantillon de larmes élué pour le profilage des cytokines.Pour réaliser le test multiplex à base de billes, porter tous les réactifs à température ambiante et les vortexer pendant cinq à dix secondes. Si les échantillons de larmes élutées ont été stockés à moins 80 degrés Celsius avant le test, décongeler les extraits lacrymaux sur de la glace et centrifuger les échantillons à 1 000 ×g pendant cinq minutes. Préparer une feuille de travail pour le test en configuration verticale pour les étalons de cytokines humaines QC-1, QC-2 et les échantillons.Ajouter 200 microlitres de tampon de lavage 1X dans chaque puits de la plaque et la sceller avec un film adhésif. Incuber ensuite la plaque sur un agitateur orbital à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, éliminer le tampon de lavage 1X en renversant la plaque et taper plusieurs fois sur une serviette absorbante afin d'éliminer toute quantité résiduelle de tampon de lavage présente dans les puits.Ensuite, ajouter 25 microlitres de chaque standard de cytokine humaine en solution (QC-1, QC-2), du témoin contenant uniquement le tampon de dosage, ainsi que des échantillons dans les puits appropriés. Ajouter 25 microlitres de tampon de dosage dans chaque puit. Puis ajouter 25 microlitres de solution 1X du mélange d'anticorps couplés à des billes dans chaque puit. Étant donné que la solution d'anticorps liée aux billes est sensible à la lumière, scellez la plaque et recouvrez-la de papier d'aluminium et du couvercle de la plaque afin de la protéger de la lumière pendant le dosage. Incubez la plaque à quatre degrés Celsius sur un agitateur pendant toute la nuit. Le jour suivant, placez la plaque sur le support de plaque d'un laveur magnétique automatique et laissez-la reposer pendant une minute afin de permettre la décantation des billes magnétiques au fond des puits.Aspirez le contenu des puits et ajoutez 200 microlitres de tampon de lavage par puits à l’aide d’un laveur automatique de plaques magnétique. Laissez la plaque reposer pendant une minute, puis aspirez le contenu des puits comme précédemment et répétez le lavage une fois supplémentaire. Ajoutez 25 microlitres de solution d’anticorps de détection dans chaque puit.Sceller la plaque. La recouvrir de papier d'aluminium et du couvercle de plaque, puis l'incuber à température ambiante sur un agitateur pendant 60 minutes. Ensuite, ajouter 25 microlitres de solution de streptavidine phycoérythrine dans chaque puits et, après avoir scellé et recouvert la plaque, l'incuber à température ambiante sur un agitateur pendant 30 minutes.Après l'incubation, placez la plaque sur un laveur magnétique et laissez-la reposer pendant une minute. Aspirez ensuite le contenu des puits et ajoutez 200 microlitres de tampon de lavage par puits. Laissez reposer pendant une minute, puis aspirez le contenu des puits avant de répéter le lavage une fois de plus.Ajoutez 150 microlitres de fluide de gainage dans chaque puits. Ensuite, placez la plaque sur un agitateur pendant cinq minutes à température ambiante pour resuspendre les billes d'anticorps avant de procéder à la lecture de la plaque et à l'analyse des concentrations en cytokines. Pour lire la plaque d'analyse conformément au protocole écrit, ouvrez la page des lots et cliquez sur l'onglet créer un nouveau lot à partir d'un protocole existant.Dans la zone Nom du lot, saisissez le nom du lot et entrez une description du lot dans la zone Saisir une description facultative. Cliquez sur le protocole généré précédemment, puis cliquez sur Suivant. L'onglet suivant qui s'ouvre est l'onglet Étalons et contrôles.Consultez les détails des normes de dosage et sélectionnez suivant. Sous l'onglet disposition de la plaque, attribuez des commandes aux puits pour le lot et cliquez sur enregistrer pour sauvegarder les informations du lot dans la liste des lots en attente. Chargez la plaque dans le lecteur de plaque pour dosage multiplex basé sur des billes et exécutez le lot à partir de la liste des lots en attente.Lancez le logiciel de conversion RBX et, dans la section sélectionner les fichiers d'exposants, sélectionnez le fichier csv généré à partir du logiciel d'analyse multiplexe à base de billes. Cliquez ensuite sur le bouton générer. Un fichier rbx sera enregistré dans le dossier de sortie sélectionné.Maintenant, lancez le logiciel d'analyse et ouvrez le fichier rbx. Ensuite, à l'aide de l'ajustement de courbe 4PL-5PL, optimisez les courbes standards. Pour optimiser les courbes standards, sélectionnez les éléments suivants dans l'onglet courbe standard : type de régression, logistique 5PL, et transformation des axes : log X, Y linéaire. Cochez ensuite les cases suivantes : afficher les lignes de la plage de concentration, afficher les échantillons inconnus, afficher les échantillons témoins, appliquer à tous les analytes, et afficher le rapport après optimisation.Cliquez sur le bouton d'optimisation pour l'optimisation automatique. Sous l'onglet Saisir les informations sur l'échantillon, indiquez les identités des échantillons. Enfin, récupérez les concentrations observées dans l'onglet du tableau de rapport et cliquez sur Exporter le tableau de rapport pour générer les données dans un fichier de feuille de calcul destiné à une analyse ultérieure.Des échantillons de larmes ont été prélevés sur huit yeux de quatre hommes en bonne santé âgés de 36 à 52 ans. Parmi les 41 cytokines analysées à l’aide du test multiplex basé sur des billes, 31 ont été détectées dans tous les échantillons de larmes. Par exemple, l’IL-17A, la MIP-1b et le TNFa ont été détectés sur sept yeux de quatre sujets, et l’IL-4 a été détecté sur six yeux de quatre sujets.En outre, l'interféron gamma a été détecté dans six yeux de trois sujets. L'interleukine-1a a été détectée dans cinq yeux de trois sujets. L'eotaxine et l'interleukine-9 ont été détectées dans trois yeux de deux sujets.L'interleukine-3 a été détectée dans un œil et la MIP-1a n'a été détectée dans aucun des échantillons. Les concentrations moyennes, plus ou moins l'écart type, des 41 cytokines détectées sont illustrées dans ce diagramme de dispersion. L'interleukine-1ra était fortement exprimée dans tous les échantillons.Les cytokines IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, fractalkine, interleukine-a, EGF, PDGF-BB, VEGF et G-CSF étaient également fortement exprimées à des niveaux de nanogrammes par millilitre, tandis que les cytokines restantes étaient exprimées à des niveaux de picogrammes par millilitre. Comme on le voit ici, la concentration minimale mesurée de cytokine dans les larmes était celle du TNF-a, avec une moyenne ± écart type de 27,25 ± 19,97 picogrammes par millilitre. Parmi les 31 cytokines détectées dans tous les échantillons, aucune ne présentait de différence statistiquement significative de concentration entre l’œil droit et l’œil gauche selon le test T.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en un jour et demi si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser un dosage multiplex basé sur des billes pour le profilage des cytokines dans les larmes.

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Immunologie et infection

Cette vidéo illustre un test multiplex basé sur des billes pour l’analyse des cytokines dans les larmes humaines. La méthode permet l’analyse simultanée de plusieurs cytokines à partir d’un seul échantillon, ce qui offre une sensibilité accrue pour l’étude des réponses immunitaires dans diverses conditions physiopathologiques.

Un test multiplex basé sur des billes pour l’analyse des cytokines dans des échantillons de larmes humaines

Cette vidéo présente un immunodosage basé sur des billes multiplex pour quantifier plusieurs cibles de cytokines dans un échantillon. Un mélange de microsphères distinctes conjuguées à des anticorps spécifiques aux cytokines est utilisé pour lier les cytokines présentes dans l’échantillon. Les rapporteurs marqués à la streptavidine sont immobilisés sur les cytokines liées à l’aide d’anticorps de détection biotinylés. La cytométrie en flux identifie les cytokines liées en fonction de la taille...

Un immunodosage multiplex basé sur des billes pour quantifier plusieurs cibles de cytokines

Nous décrivons une procédure pour le profilage de protéines salivaires utilisant multiplexés puces à anticorps à base de microsphères. Les anticorps monoclonaux ont été liés par covalence à 4,5 um microsphères de polymère de colorants fluorescents codé en utilisant la chimie du carbodiimide. Les microsphères modifiées ont été déposés dans des micropuits à fibres optiques pour mesurer les niveaux de protéine dans la salive en utilisant des dosages immunologiques par fluorescence en sandwich.

Multiplexé fluorescent puce à ADN pour salivaire humaine analyse des protéines en utilisant un polymère microsphères et faisceaux de fibres optiques

Ce protocole décrit la quantification des cibles multiples de cytokines simultanément dans les surnageants de culture de tissus prélevés de splénocytes de souris stimulés à l’aide de perle multiplex immunodosage base plate-forme et un cytomètre en flux.

Multiplex Cytokine profilage des splénocytes de souris stimulés à l’aide d’une plateforme axée sur la cytométrie de flux perle Immunoassay

Ce protocole décrit une méthode de collecte d’échantillons de larmes à l’aide de bandelettes de Schirmer et un flux de travail quantitatif intégré pour la découverte de biomarqueurs non invasifs de la protéine lacrymale. Le flux de travail de préparation des échantillons par piégeage en suspension permet une préparation rapide et robuste des échantillons lacrymaux et une analyse par spectrométrie de masse, ce qui se traduit par des rendements de récupération des peptides et une identification...

Préparation d’échantillons de piégeage de suspension de protéines pour la protéomique lacrymale par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem

L’utilisation de réactifs de référence pour les tests de libération de cytokines permet d’obtenir des profils d’innocuité in vitro plus reproductibles et standardisés des anticorps monoclonaux immunothérapeutiques. Nous décrivons ici comment les tests de libération de cytokines peuvent être utilisés avec un panel de réactifs de référence pour prédire l’innocuité de certains anticorps monoclonaux thérapeutiques.

Utilisation de réactifs de référence pour confirmer la robustesse des tests de libération de cytokines pour la prédiction de l’innocuité des anticorps monoclonaux

Cet article décrit un protocole pour la collecte et la détection de miR-15a à partir de déchirures comme nouvel outil diagnostique pour la rétinopathie diabétique.

MiR-15a exosomal dérivé de la déchirure comme nouvel outil diagnostique pour la rétinopathie diabétique

L’identification de biomarqueurs d’ARN et de protéines à partir de déchirures dans des modèles murins est très prometteuse pour le diagnostic précoce de diverses maladies. Ce manuscrit fournit un protocole complet pour optimiser l’efficacité et l’efficience de l’isolement de l’ARNm et des protéines à partir de larmes de souris.

Optimisation de la collecte de larmes chez la souris pour l’analyse de l’ARNm et des protéines

Ce protocole décrit un protocole clinique unique pour la collecte d’échantillons de liquide lacrymal humain à l’aide de filaments rouges de phénol et d’un flux de travail basé sur la chromatographie liquide-spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) pour découvrir le profil lipidomique des larmes. La méthode simple de séparation biphasique entre méthyl tert-butyl et méthanol permet une extraction rapide des lipides lacrymaux avec une récupération élevée pour la découverte de biomarqueurs...

Procédure d’échantillonnage basée sur le fil rouge phénol pour les lipidomiques du liquide lacrymal non ciblé dans la découverte de biomarqueurs

Ce protocole décrit une méthode optimisée d’immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) pour détecter et quantifier le 17β-estradiol et la testostérone dans le liquide lacrymal humain collecté par des tubes microcapillaires. Cette approche permet une mesure peu invasive des niveaux d’hormones lacrymaux.

Détection des hormones sexuelles dans le film lacrymal humain à l’aide de tests immunosorbants liés aux enzymes

Découvrez le profilage des cytokines dans les larmes humaines par essai multiplex à base de billes. Cette méthode permet d'analyser plusieurs analytes avec de petits volumes d'échantillon pour l'ophtalmologie.

Perles base essai Multiplex pour l’analyse des profils de Cytokine de larme

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