Méthodes et conseils pour l’Administration intraveineuse de Virus Adeno-associé à des Rats et d’évaluation de la Transduction du système nerveux Central

L'objectif général de ce transfert génique par vecteur viral adéno-associé est de manipuler génétiquement le cerveau et la moelle épinière du rat à une échelle très étendue. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du transfert génique. Il s'agit d'un moyen très efficace d'introduire des gènes in vivo et, par conséquent, d'une technique très puissante et très polyvalente.

Cette procédure est à la fois rapide et hautement reproductible. Nous avons utilisé cette approche de transfert génique à grande échelle pour exprimer une protéine liée à la sclérose latérale amyotrophique dans toute la moelle épinière de rats dans plusieurs publications. Mon collègue, Robert Dayton, démontrera la procédure.

Mychal Grames assistera Robert. Commencez par préparer le poste de travail : nettoyez d'abord la surface avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, placez un tapis chauffant dans la zone de travail et réglez-le à une température de 37 degrés Celsius.

Placer un tapis de paillasse sur le dessus du coussin chauffant. Vérifier qu'il y a suffisamment d'oxygène et d'isoflurane pour la procédure. Nettoyer la chambre d'induction et le masque d'anesthésie avec de l'éthanol à 70 % et placer le masque d'anesthésie sur le tapis de paillasse.

Veillez à disposer des éléments suivants : un carré de film en paraffine d'environ 5 x 5 centimètres par animal, une compresse imprégnée d'alcool et deux ou trois compresses de gaze par animal, des embouts de pipette et une micropipette. Ensuite, décongelez le vecteur à température ambiante et étiquetez un tube stérile de microcentrifugeuse pour chaque animal. Prélèvez le volume requis d'AAV dans le tube approprié et complétez jusqu'au volume d'injection souhaité avec une solution de Ringer lactaté ou une solution saline.

Agiter l'échantillon au vortex pendant une ou deux secondes, puis effectuer une courte centrifugation de cinq secondes afin de ramener l'échantillon au fond du tube. Prélever au micropipette le volume total à injecter, le sortir du tube et le déposer sur un carré de film en paraffine. Ensuite, fixer une aiguille de calibre 30 sur une seringue d'un millilitre.

Insérez l'aiguille avec le biseau vers le bas dans le vecteur sur le film de paraffine. Tirez doucement sur le piston de la seringue jusqu'à ce que tout le virus soit dans l'aiguille et la seringue. Anesthésiez correctement le rat à l'aide du système d'anesthésie.

Assurez un plan d'anesthésie adéquat par l'absence de réaction à une pincée des orteils. Ensuite, placez le rat dans la zone de travail sur son côté et maintenez l'anesthésie à l'aide du cône nasal. Lorsque le rat est allongé sur le côté, une veine latérale de la queue doit être orientée vers le haut.

L'injection est pratiquée aux deux tiers de la longueur de la queue. Nettoyez le site d'injection avec un tampon imprégné d'alcool. Maintenez fermement la queue légèrement au-dessus de la zone d'injection, avec un doigt directement au-dessus de la veine latérale de la queue, ce qui permettra de dilater la veine.

Avec le biseau orienté vers le haut, alignez l'aiguille avec la veine caudale visible dans le même sens. Percez la peau au-dessus de la veine caudale, en prenant grand soin d'éviter l'autre main qui tient la queue et exerce une pression sur la veine caudale. Relâchez la pression exercée sur la veine caudale afin de permettre une circulation sanguine normale.

Ensuite, introduisez l'aiguille dans la veine. Pour vous assurer que l'aiguille a pénétré la veine caudale, tirez légèrement sur le piston. Si l'aiguille est bien dans la veine, le sang s'écoulera dans l'aiguille.

Après avoir repositionné l'aiguille si nécessaire, stabilisez l'aiguille en tenant l'extrémité de la seringue contre la queue. Injectez lentement le vecteur dans la queue à environ 20 microlitres par seconde. En cas d'injection médiocre, l'animal ne sera que partiellement transduit et les résultats seront probablement inutilisables.

Cependant, avec de la pratique, de bonnes injections sont très reproductibles et fiables. Si le vecteur a été administré, retirez l'aiguille de la queue et appliquez un tampon de gaze sur le site d'injection afin de limiter le saignement pendant 30 à 60 secondes. Éteignez l'anesthésie au isoflurane et l'oxygène.

Surveiller le rat jusqu'à ce qu'il reprenne connaissance, puis le ramener dans sa cage. Jeter les matériaux qui pourraient être contaminés par l'AAV dans un contenant approprié pour déchets biologiques dangereux et nettoyer le poste de travail avec de l'éthanol à 70 %. Obtenir des sections coronales de 50 microns à partir du cerveau fixé et cryoprotégé d'un animal injecté avec l'AAV, en utilisant un microtome à glissement équipé d'un plateau réfrigérant.

Après l'immunomarquage pour la GFP et le montage sur lames, réalisez une photographie microscopique de chaque section dans la région d'intérêt définie à l'aide d'un objectif de faible grossissement en utilisant un microscope. Conservez les paramètres de l'appareil photo identiques pour tous les échantillons à analyser et enregistrez les données sous forme de fichiers TIFF. Ouvrez la photographie microscopique dans le logiciel largement disponible Scion Image.

Deux fenêtres s'ouvriront ; fermez la fenêtre indiquée comme « index color ». Choisissez Options, puis « density slice ». Une gamme de nuances sera indiquée en rouge dans la fenêtre de la table de correspondance.

Dans la fenêtre, utilisez le curseur pour remplir uniquement l'étiquetage spécifique de la GFP et arrêtez-vous lorsque le fond non spécifique commence à être détecté sur l'image. Ensuite, cliquez sur analyser et définissez l'échelle. Sur la quatrième ligne, qui doit indiquer « unités », sélectionnez « pixels » dans la liste déroulante, puis cliquez sur OK.

Pour mesurer la surface fluorescente, cliquez sur analyser, puis sur mesurer. Ensuite, cliquez sur analyser et afficher les résultats. Une fenêtre de résultats apparaîtra et la mesure de la surface fluorescente sera indiquée sous l'intitulé surface.

Une fois toutes les mesures enregistrées, faites la moyenne des valeurs obtenues à partir de trois à six sections par animal. Utilisez un test statistique approprié pour comparer les zones transduites entre les groupes. Cette image représentative montre une immunofluorescence GFP dans le cervelet de rat, quatre semaines après une injection intraveineuse de la queue d'AAV 9 GFP.

Un logiciel d'analyse d'images a été utilisé pour mettre en évidence de manière sélective la zone fluorescente et pour quantifier les pixels mis en surbrillance. Il s'agit de l'image GFP provenant d'un animal non transduit. L'analyse de cette image, effectuée avec les mêmes paramètres que pour l'animal injecté avec la GFP, détecte effectivement un signal de fond très faible.

Une fois maîtrisée, l'injection peut être réalisée en environ cinq minutes par rat. En conclusion, cette technique décrit une méthode permettant d'introduire efficacement des gènes dans le système nerveux central du rat ; une administration unique du gène produit une expression durable et des effets à long terme. Plus important encore, le système nerveux central est manipulé à partir de la périphérie.

Une injection intraveineuse relativement peu invasive par vecteur atteint le cerveau et la moelle épinière, le SNC.