Avancée des Techniques de microscopie confocale afin d’étudier les interactions entre protéines et cinétique aux lésions de l’ADN
12 novembre 2017
Laser microirradiation est un outil utile pour l’étude de la réparation de l’ADN dans les cellules vivantes. Une approche méthodologique pour l’utilisation des lasers UVA pour induire diverses lésions de l’ADN est montrée. Nous avons optimisé une méthode pour microirradiation locale qui gère le cycle cellulaire normal ; ainsi, les cellules irradiées passent par mitose.
L’objectif global de ces expériences est d’induire des lésions de l’ADN en utilisant la micro-irradiation locale des cellules et d’observer le recrutement de protéines impliquées dans les processus de réparation de l’ADN. Cette méthode peut nous aider à comprendre une question très complexe et profonde telle que la façon dont les cellules normales et cancéreuses réagissent aux lésions de l’ADN. Le principal avantage de cette technique est que nous sommes en mesure d’étudier la réponse aux dommages de l’ADN dans des cellules vivantes individuelles. La démonstration de la procédure sera faite par Sona Legartova, post-doc et Jana Suchankova, doctorante de mon laboratoire. Pour commencer, cultivez des cellules HeLa dans du DMAM enrichis de 10 % de FBS et d’antibiotiques appropriés. Incuber les cellules à 37 ans
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Aperçu
L'irradiation microscopique au laser est une technique précieuse pour étudier les mécanismes de réparation de l'ADN dans des cellules vivantes. Cette étude présente une méthode optimisée utilisant des lasers UVA pour induire des lésions spécifiques de l'ADN tout en préservant la progression normale du cycle cellulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Réparation de l'ADN
- Biologie cellulaire
- Microirradiation au laser
Contexte
- Comprendre la réparation de l'ADN est essentiel pour obtenir des informations sur les réponses cellulaires aux dommages.
- La microirradiation par laser permet l'induction précise de lésions de l'ADN.
- Le maintien d'un cycle cellulaire normal est essentiel pour une étude précise des mécanismes de réparation.
- Les lasers UVA sont efficaces pour créer des dommages localisés de l'ADN.
Objectif de l'étude
- Optimiser une méthode de microirradiation locale à l'aide de lasers UVA.
- Étudier les effets des lésions de l'ADN induites sur la progression du cycle cellulaire.
- Approfondir la compréhension des mécanismes de réparation de l'ADN dans les cellules vivantes.
Méthodes utilisées
- Utilisation de lasers UVA pour la microirradiation.
- Surveillance de la progression du cycle cellulaire après irradiation.
- Évaluation des mécanismes de réparation de l'ADN dans les cellules irradiées.
- Comparaison du comportement des cellules normales et irradiées.
Résultats principaux
- La méthode d'irradiation localisée optimisée a induit avec succès des lésions de l'ADN.
- Les cellules ont conservé une progression normale du cycle cellulaire malgré l'irradiation.
- Une évaluation efficace des mécanismes de réparation de l'ADN a été réalisée.
- Les résultats contribuent à la compréhension des réponses cellulaires aux dommages de l'ADN.
Conclusions
- La méthode optimisée de microirradiation par laser UVA est efficace pour l'étude de la réparation de l'ADN.
- Le maintien du cycle cellulaire normal est crucial pour des résultats expérimentaux précis.
- Cette approche peut être appliquée à des recherches supplémentaires sur les lésions et la réparation de l'ADN.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La microscopie confocale avancée combinée à la microirradiation laser permet une interrogation précise, en cellules vivantes, des interactions entre protéines et de la cinétique de réparation au niveau des lésions de l'ADN. Cette capacité est essentielle pour réduire les risques liés aux hypothèses initiales de découverte concernant les voies de réponse aux dommages de l'ADN et pour renforcer la confiance prédictive dans la validation des cibles. Cette approche favorise la continuité translationnelle en permettant des études mécanistiques dans des contextes cellulaires pertinents pour la maladie.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'observation directe du recrutement des protéines et des dynamiques d'interaction aux sites de dommages de l'ADN dans des cellules vivantes.
- Permet la validation fonctionnelle des cibles de réparation de l'ADN en quantifiant les cinétiques et l'engagement des voies.
- Facilite la caractérisation mécanistique et la réduction des risques en distinguant les réponses dépendantes du cycle cellulaire à l'aide du système Fucci.
- Fournit des preuves d'une sélectivité de voie et d'un engagement de la cible dans des modèles pertinents pour la maladie.
Développement de criblages et de tests
- Établit des systèmes cellulaires vivants validés pour l'évaluation quantitative de la cinétique et des interactions des protéines.
- Permet la standardisation des tests grâce à l'induction reproductible de lésions de l'ADN à l'aide de paramètres laser définis.
- Permet le criblage à haut contenu de modulateurs affectant la dynamique des protéines de réparation de l'ADN.
- Fournit des résultats quantitatifs par FRAP, FLIM et FLIM-FRET pour une évaluation robuste des composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Corréle les découvertes mécanistiques avec les phénotypes de réparation de l'ADN pertinents pour la maladie dans les cellules cancéreuses et normales.
- Facilite la découverte de biomarqueurs en reliant la cinétique des interactions protéiques aux résultats cellulaires après un dommage.
- Permet une progression ajustée au risque en fournissant des données prédictives sur la modulation des voies de réparation.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthodologie s'intègre dès la phase de découverte jusqu'à l'identification de composés candidats, soutenant à la fois la vérification d'hypothèses et le criblage quantitatif dans des systèmes cellulaires vivants.
- Biologie de la découverte : Fournit une analyse en temps réel du recrutement des protéines et de leurs interactions au niveau des lésions de l'ADN afin de clarifier les voies biologiques.
- Essais de criblage : Produit des mesures reproductibles et quantitatives des cinétiques protéiques et des interactions pour le développement d'essais.
- Analytique : Utilise la FRAP, la FLIM et la FLIM-FRET pour générer des données cinétiques et d'interaction comparatives entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Relie le comportement mécanistique des protéines à la phase du cycle cellulaire et aux résultats de la réparation de l'ADN dans des modèles pertinents.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme modulaire adaptable à diverses cibles de réparation de l'ADN et à différents systèmes cellulaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles de réparation de l'ADN et la déconvolution des voies.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'induction de dommages de l'ADN dans des cellules vivantes et les protocoles d'analyse quantitative des protéines.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'avancement ou d'abandon en fournissant des preuves mécanistiques d'interaction avec la cible et de modulation de la voie.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles et mécanismes de réparation de l'ADN pour leur développement.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie confocale avancée et en techniques d'imagerie de cellules vivantes.
- Exige un accès à des plateformes de micro-irradiation laser et à une infrastructure d'imagerie quantitative.
- Implique une standardisation interéquipes des paramètres d'irradiation et des protocoles d'analyse cinétique.
- L'adaptation à différents types cellulaires peut nécessiter une optimisation des réglages laser et des marqueurs du cycle cellulaire.
- L'interprétation des données cinétiques et d'interaction doit tenir compte de la phase du cycle cellulaire et du type de lésion de l'ADN.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Cultivation of HeLa-derived Cell Lines
1:48
Cell Transfection
3:21
Induction of Local DNA Lesions and Confocal Microscopy
4:47
Fluorescence Lifetime Image Microscopy
6:24
FRET Efficiency Using the FLIM-FRET Script
7:48
FRAP Analysis
8:50
Results: Analysis of Recruitment of mCherry-tagged PCNA and -53BP1 at DNA Lesions in HeLa Cells
11:00
Conclusion
