Name: Détermination des acides sialiques dans les échantillons de foie et de lait de type sauvage et CMAH Souris knock-out. (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse des acides sialiques dans le foie et le lait de souris CMAH knock-out par chromatographie liquide haute performance. Cette technique permet de quantifier les niveaux d'acide N-acétylneuraminique et d'acide N-glycolylneuraminique chez les souris homozygotes et hétérozygotes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 31471703, A0201300537 et 31671854 à JV et LL) et au 100 Plan des talents étrangers (numéro de subvention JSB2014012 à JV).

Les procédures impliquant des sujets d&#39;animaux ont été approuvées par le Comité d&#39;éthique du Centre animal expérimental de l&#39;Université agricole de Nanjing conformément aux Lignes directrices nationales pour le bien-être animal expérimental (Ministère de la Science et de la Technologie, PR de Chine, 2006) avec les animaux hébergés dans un SPF Installation (ID d&#39;autorisation: SYXK-J-2011-0037). 1. Modèle de souris Cmah Knock-out <ol><li> Utiliser des souris C57Bl / 6 de type sauvage du Centre de médecine comparée de l&#39;Université de Yangzhou (Chine). NOTE: Les souris Cmah knock-out ont été générées en fonction de l&#39;information fournie par les précédentes études Cmah knock-out 17 , 19 et obtenues commercialement en utilisant une stratégie CRISPR / Cas9 20 en éliminant 92 paires de bases de l&#39;exon 6 du gène Cmah , qui est également Supprimé dans le gène CMAH humain 19 . Positif F 0 &lt;/ Sub&gt; -mice (2 individus) ont été croisés avec des souris de type sauvage pour obtenir un mélange F 1 hétérozygote. Après avoir traversé le mélange de F 1 hétérozygote (5 individus), on peut obtenir un homozygose à la souris F- 2 (3 individus). </li><li> Effectuer le génotypage de souris en utilisant de l&#39;ADN génomique selon la méthode montrée par Zangala 21 en utilisant un kit commercial de purification d&#39;ADN. <ol><li> Amplifier un fragment d&#39;ADN correspondant du gène Cmah en utilisant une ADN polymérase commerciale et la paire d&#39;amorces 5&#39;gaaagggctcggctctgtatgaa3 &#39;et 5&#39;tttaaaatgtcccgggtgagaagc3&#39;. Effectuer l&#39;amplification du gène en utilisant 34 cycles de PCR consistant en une dénaturation à 94 ° C pendant 40 s, un recuit à 63 ° C pendant 40 s et un allongement à 72 ° C pendant 1 min. </li><li> Visualiser les produits de PCR sur un gel d&#39;agarose à 1%. On devrait observer une seule bande (0,5 kb) pour l&#39;individu de type sauvage, une bande double (0,4 et 0,5 kb) pour laIndividu hétérozygote knock-out, et une bande unique (0,4 kb) pour l&#39;individu knock-out homozygote. </li></ol></li></ol> 2. Collection d&#39;échantillons <ol><li> Recueillir du lait de souris en utilisant le protocole décrit par Willingham et al. 22 . </li><li> Recueillir du tissu hépatique de souris en utilisant le protocole décrit par Gonçalves et al. 23 et stockez les échantillons à -80 ° C. </li></ol> 3. Isolation des acides sialiques du lait <ol><li> Préparer 100 ml d&#39;une solution d&#39;acide acétique 2 M en ajoutant 12 ml d&#39;acide acétique glacial dans 88 ml d&#39;H 2 O distillé. </li><li> Transférer 50 μL de lait dans un tube de centrifugation de 1,5 ml et ajouter 1,2 ml de la solution aqueuse d&#39;acide acétique préparée. </li><li> Incuber la suspension pendant 4 h à 80 ° C et centrifuger l&#39;échantillon à 14 000 xg pendant 10 min. </li><li> Transférer le dessus de 1000 μL du surnageant dans un tube de centrifugation de 1,5 mL frais et remDéposer le solvant par évaporation centrifuge à température ambiante jusqu&#39;à la sécheresse complète (selon la pompe à vide ci-jointe, cela prendra de 4 à 20 h). Ré-dissoudre l&#39;échantillon dans 500 ul de H 2 O distillé. </li><li> Préparez une colonne d&#39;échange de micro-anions. Cette étape va spécifiquement enrichir les composés anioniques et éliminer les composés cationiques et neutres des échantillons de lait et de foie, et augmente donc la sélectivité de l&#39;agent d&#39;étiquetage OPD fluorogène pour la dérivatisation de l&#39;acide sialique. <ol><li> Transférer pour chaque échantillon 200 mg de la résine échangeuse d&#39;anions (Dowex 1X8) dans des tubes de colonne de 3 mL vides avec un robinet d&#39;arrêt attaché. </li><li> Ajouter 2 ml de la solution aqueuse d&#39;acide acétique préparée à l&#39;étape 3.1 pour remplacer les ions chlorure dans la résine par des ions acétate. Fermez le robinet dès que le solvant atteint le haut de la résine. </li><li> Ajoutez doucement 2 ml d&#39;H 2 O distillé, ouvrez le robinet et arrête le débit dès que la majeure partie du solvant atteintLe dessus de la résine. Assurez-vous que la résine est toujours recouverte de solvant. </li><li> Laver la colonne de résine deux fois de plus avec 2 ml d&#39;H 2 O distillé pour éliminer l&#39;excès d&#39;acétate. </li></ol></li><li> Transférer les 500 μL résultants d&#39;échantillon de solvant à partir de l&#39;étape 3.4. Sur la colonne de résine et jeter l&#39;écoulement. Laver délicatement la résine avec 2 ml d&#39;H 2 O distillé. Eluer les échantillons d&#39;anions de la résine en utilisant 1 ml d&#39;une solution d&#39;acétate d&#39;ammonium 50 mM (386 mg d&#39;acétate d&#39;ammonium dissous dans 100 ml d&#39;H 2 O distillé) dans un 1,5 ml Tube centrifuge. Retirer le solvant par evaporation centrifuge à température ambiante jusqu&#39;à la sécheresse. REMARQUE: Les échantillons secs peuvent être conservés à 4-6 ° C pendant 12 mois maximum. </li></ol> 4. Isolation des acides sialiques à partir du tissu de foie <ol><li> Dégraisser doucement 20 à 50 mg de foie de souris et le transférer dans un moulin à papier Dounce (1 mL ou 2 mL de volume). Ajouter 1,2 ml de la solution aqueuse d&#39;acide acétiquePréparé à l&#39;étape 3.1 et homogénéiser le tissu par cisaillement doux pendant 10 s. Transférer la suspension résultante dans un tube de centrifugation de 1,5 ml. </li><li> Suivez les étapes 3.3. À 3.6. REMARQUE: Les échantillons secs peuvent être conservés à 4-6 ° C pendant 12 mois maximum. </li></ol> 5. Préparation d&#39;un ester d&#39;acide sialique mixte <ol><li> Peser entre 5 et 8 mg d&#39;acide N-acétylneuraminique sur un bilan analytique dans un tube de centrifugation de 1,5 mL. Notez le poids exact et ajoutez 164 μL d&#39;H 2 O distillé pour chaque mg ( c.-à - d. Si le poids de Neu5Ac est de 7,2 mg puis ajoutez 7,2 x 164 = 1, 181 μl d&#39;H 2 O distillé). Il en résulte une solution mère de 20 mM Neu5Ac qui peut être stockée à -20 ° C pendant 12 mois. </li><li> Obtenir de l&#39;acide N-glycolylneuraminique à des quantités plus petites à un prix modéré tel que dans des aliquotes de 1 mg. Ajouter 154 μl d&#39;H 2 O distillé directement au composé afin d&#39;obtenir une solution mère de Neu5Gc ~ 20 mM. Transférer leSolution dans un tube de centrifugation de 1,5 ml. Cette solution peut être stockée à -20 ° C pendant 12 mois maximum. </li><li> Mélanger 5 μL de chaque solution mère de l&#39;étape 5.1 et 5.2 dans un tube centrifuge frais de 1,5 mL et éliminer le solvant par evaporation centrifuge à température ambiante jusqu&#39;à la sécheresse. REMARQUE: le standard d&#39;acide sialique mélangé peut être conservé entre 4 et 6 ° C pendant 12 mois maximum. </li></ol> 6. Fluoréscence de la dérivation des acides sialiques <ol><li> Préparer 10 mL de solution OPD, consistant en 100 mg d&#39;o-phénylènediamine et 208 mg d&#39;hydrogénosulfite de sodium dans 10 ml d&#39;H 2 O distillé. </li><li> Ajouter 20 μL de solution OPD aux échantillons d&#39;acide sialique dérivés du lait de souris (étape 3), du foie de souris (étape 4) ou du standard d&#39;acide sialique mixte (étape 5). Vortex vigoureusement pendant 30 s et incuber les échantillons pendant 4 h à 80 ° C dans l&#39;obscurité ( c.-à-d. Envelopper les microtubes dans du papier d&#39;aluminium). </li><li> Laisser refroidir les échantillons pendant 5 minutes, ajouter 80 μ; L d&#39;H 2 O distillé et centrifuger les tubes à 14 000 xg pendant 1 min. </li><li> Transférer 80 μL du surnageant dans un flacon HPLC à haute récupération de 300 μL. Les échantillons d&#39;acide sialique dérivés peuvent être conservés entre 4 et 6 ° C pendant une semaine. </li></ol> 7. Analyse HPLC des dérivés de l&#39;acide sialique <ol><li> Analyser les échantillons en utilisant un système HPLC standard connecté à un détecteur de fluorescence en ligne. </li><li> Utilisez une colonne en phase inversée C18 avec les dimensions standard de 250 mm de longueur et 4,6 mm de diamètre pour l&#39;analyse. </li><li> Préparer le solvant A en diluant 200 ml de solution stock avec 800 ml d&#39;eau de qualité LCMS (LCMS - spectrométrie de masse en chromatographie liquide). La solution stock elle-même peut être préparée comme suit: <ol><li> Ajouter 46 g d&#39;acide formique à 800 ml d&#39;H 2 O de qualité LCMS. </li><li> Ajuster le pH à 4,5 en ajoutant goutte à goutte une solution d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium (pur. Pa). </li><li> Transférer le solvant à unMesurez le cylindre et remplissez jusqu&#39;à 1000 mL avec H 2 O de qualité LCMS. Cette solution mère peut être conservée entre 4 et 6 ° C pendant 3 mois maximum. </li></ol></li><li> Pour le solvant B, utiliser de l&#39;acétonitrile de qualité LCMS. </li><li> Séparer les dérivés d&#39;acides sialiques à un débit de 1 mL / min avec l&#39;élution en gradient suivant: <ol><li> Commencez par ajouter 10% de solvant B mélangé au solvant A. </li><li> De 0 min à 15 min, augmente progressivement la proportion de solvant B avec un gradient linéaire à 60%. </li><li> De 15 min à 16 min, augmente rapidement la proportion de solvant B avec un gradient linéaire de 60% à 90%. Ceci initie le lavage de la colonne HPLC. </li><li> Pour laver davantage la colonne HPLC, maintenir le niveau de solvant B à 90% entre 16 min et 18 min avant de réduire progressivement le taux de solvant B de nouveau à 10% entre 18 min et 19 min. </li><li> Rééquilibrer la colonne HPLC aux conditions de départ de 10% B entre 19 et 24 minutes. </li></ol></li><li> DansJeter 50 μL d&#39;échantillon dans le système HPLC. </li><li> Surveiller les éluants en utilisant les longueurs d&#39;onde d&#39;excitation / émission du détecteur de fluorescence de 373/448 nm, et les acides sialiques dérivés peuvent être attendus aux temps de rétention approximatifs de 9 min (pour Neu5Gc-OPD) et 10 min (pour Neu5Ac-OPD). </li><li> Calculer la quantité relative de Neu5Gc (F Neu5Gc ) des zones de pointe de fluorescence des Neu5Ac (A Neu5Ac ) et Neu5Gc (A Neu5Gc ) comme suit: F Neu5Gc [%] = 100 × A Neu5Gc / (A Neu5Ac + A Neu5Gc ). Dans le cas des échantillons de lait et de foie de la souris homozygote Cmah knock-out, F Neu5Gc devrait être de 0%, alors que les valeurs de F Neu5Gc de souris hétérozygotes et de type sauvage peuvent varier considérablement en fonction de l&#39;âge de la souris et du type de tissu (entre 2% Et&gt; 90%) avec des marges d&#39;erreur attendues de ± 12%. </li></ol>

<ol><li>Lamari, F. N., Karamanos, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+methods+for+sialic+acids+and+critical+evaluation+of+their+biologic+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).</li>
<li>Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+for+the+absence+of+N-glycolylneuraminic+acid+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans.</a> J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).</li>
<li>Chou, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+human+CMP-sialic+acid+hydroxylase+occurred+after+the+Homo-Pan+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).</li>
<li>Rehan, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Glycomics+of+Livestock%3A+Discovery+of+Highly+Sensitive+Serum+Biomarkers+Indicating+an+Environmental+Stress+Affecting+Immune+Responses+and+Productivity+of+Holstein+Dairy+Cows%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows.</a> J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).</li>
<li>Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+ganglioside+and+glycoprotein+sialic+acid+in+breastfed+compared+with+formula-fed+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants.</a> Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).</li>
<li>Yao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sialic+acids+in+red+meat+by+UPLC-FLD+using+indoxylsialosides+as+internal+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards.</a> Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).</li>
<li>Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+natural+human+antibodies+against+a+nonhuman+sialic+acid+that+metabolically+incorporates+into+activated+and+malignant+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells.</a> J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).</li>
<li>Byres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+non-human+glycan+mediates+human+susceptibility+to+a+bacterial+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin.</a> Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).</li>
<li>Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+human-specific+mechanism+for+diet+and+antibody-mediated+inflammation+in+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).</li>
<li>Tangvoranuntakul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+uptake+and+incorporation+of+an+immunogenic+nonhuman+dietary+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).</li>
<li>Svennerholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+estimation+of+sialic+acids.+II.+A+colorimetric+resorcinol-hydrochloric+acid+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method.</a> Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).</li>
<li>Warren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thiobarbituric+acid+assay+of+sialic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The thiobarbituric acid assay of sialic acids.</a> J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).</li>
<li>Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+sialic+acids+by+gas+chromatography+of+the+mannosamine+derivatives+released+by+the+action+of+N-acetylneuraminate+lyase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase.</a> J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).</li>
<li>Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+sialic+acids+for+stabilization+in+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+and+concomitant+differentiation+of+alpha%282+--%3E+3%29-+and+alpha%282+--%3E+6%29-isomers%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).</li>
<li>Hurum, D. C., Rohrer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+sialic+acids+in+infant+formula+by+chromatographic+methods%3A+a+comparison+of+high-performance+anion-exchange+chromatography+with+pulsed+amperometric+detection+and+ultra-high-performance+liquid+chromatography+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods.</a> J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fluorometric+high-performance+liquid+chromatography+method+for+sialic+acid+determination%3A+an+internal+standard+method+and+its+application+to+sialic+acid+analysis+of+human+apolipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22E.+Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein.</a> E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+Center+Marker+GL7+Probes+Activation-Dependent+Repression+of+N-Glycolylneuraminic+Acid%2C+a+Sialic+Acid+Species+Involved+in+the+Negative+Modulation+of+B-Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation.</a> Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).</li>
<li>Manzi, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+liquid+chromatography+of+sialic+acids+on+a+pellicular+resin+anion-exchange+column+with+pulsed+amperometric+detection%3A+a+comparison+with+six+other+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems.</a> Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).</li>
<li>Hedlund, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-glycolylneuraminic+acid+deficiency+in+mice%3A+implications+for+human+biology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution.</a> Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Zangala, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+genomic+DNA+from+mouse+tails%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of genomic DNA from mouse tails.</a> J Vis Exp. (6), e246(2007).</li>
<li>Willingham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+collection+methods+for+mice+and+Reeves%27+muntjac+deer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar J. 6, 169(2007).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Le protocole présenté ici permet l&#39;évaluation phénotypique des souris homozygotes Cmah knock-out en analysant et en quantifiant les quantités relatives de Neu5Gc de lait et d&#39;échantillons de foie. L&#39;analyse a été effectuée en utilisant une configuration HPLC standard avec détection de fluorescence. L&#39;étape la plus critique de cette procédure est la préparation des colonnes d&#39;échange d&#39;anions et la réalisation de la chromatographie d&#39;échange d&#39;anions; Régler correctement ...

L&#39;acide N-acétylneuraminique (Neu5Ac) et l&#39;acide N-glycolylneuraminique (Neu5Gc) sont les acides sialiques les plus courants chez la plupart des mammifères 1 . Bien que capable de synthétiser Neu5Ac de manière endogène, les humains ne sont pas capables de produire Neu5Gc en raison d&#39;une deletion primaire d&#39;exon sur le gène CMAH codant pour une hydroxylase CMP-Neu5Ac 2 , 3 . Cependant, les produits alimentaires à base d&#39;animaux peuvent être des sources alimentaires de Neu5Gc 4 , 5 , 6 , conduisant à la production d&#39;anticorps anti-Neu5Gc et déclenchent donc une réponse immunitaire envers Neu5Gc 7 . Cet effet diététique de Neu5Gc est suspecté de contribuer à l&#39;inflammation chronique et à diverses autres maladies 8 , 9 , 10 . Afin de comprendre de façon compréhensive les effets de Neu5Gc en hUn modèle animal pour l&#39;étude systématique des effets des acides sialiques d&#39;origine alimentaire est hautement souhaitable. Bien que les protocoles basés sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour l&#39;analyse de souris knock-out soient bien établis et constituent un moyen pratique pour l&#39;évaluation génotypique, l&#39;analyse fonctionnelle du phénotype sur le niveau métabolique nécessite des méthodes d&#39;analyse plus spécifiques. Le phénotype d&#39;un modèle de souris Cmah knock-out peut être évalué en isolant et en analysant la composition des acides sialiques dans des échantillons de foie ou de lait. Plusieurs méthodes pour la détection des acides sialiques dans les tissus animaux ont déjà été rapportées: la réaction des acides sialiques avec le résorcinol 11 ou l&#39;acide thiobarbiturique 12 entraîne la formation d&#39;un produit chromophore et peut être simplement analysée à l&#39;aide d&#39;une configuration basée sur platereader, mais seulement le sialique total La teneur en acide peut être déterminée. En variante, l&#39;analyse des acides sialiques a également été décrite en utilisant une Chromatographie en phase gazeuse13 , la spectrométrie de masse MALDI-ToF 14 ou les méthodes ampérométriques 15 . Cependant, les méthodes d&#39;analyse d&#39;acide sialique les plus couramment appliquées sont basées sur la libération hydrolytique, suivie d&#39;une dérivation de fluorescence et de la Chromatographie liquide 16 , 17 , 18 .

<table><tbody><tr><td>Produits chimiques <fort> :</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide N-acétylneuraminique</td><td>Sigma</td><td>A0812</td><td></td></tr><tr><td>Acide N-glycolylneuraminique</td><td>Sigma</td><td>50644</td><td>1 mg aliquote devrait être suffisant</td></tr><tr><td>o-Phénylènediamine</td><td>Sigma</td><td>694975</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogénésulfite</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>75234</td><td></td></tr><tr><td>Outils/Matériaux :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL Tubes SPE</td><td>Supelco</td><td>Sigma 57024</td><td>vides Colonnes d’extraction en phase solide</td></tr><tr><td>Luer stopcock</td><td>Sigma</td><td>S7396</td><td>pour arrêter l’écoulement du tube SPE</td></tr><tr><td>Dowex 1X8</td><td>Dow Chemicals</td><td>Sigma 44340</td><td>200 - 400 mesh</td></tr><tr><td>Dounce broyeur de tissus</td><td>Sigma</td><td>D8938</td><td>tight fit</td></tr><tr><td>HPLC Analysis :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacon HPLC à haute récupération</td><td>Agilent Technologies</td><td>#5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>Système HPLC</td><td>Détecteur de fluorescence Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>pour HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Column</td><td>Phenomenex</td><td>Hyperclone ODS</td><td>250 x 4,6 mm</td></tr> H<tr><td>2O</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile de qualité LCMS</td><td>Merck Millipore</td><td>#100029</td><td>Hypergrade</td></tr> Solution <tr><td>d’hydroxyde d’ammonium</td><td>Fluka</td><td>#44273</td><td>puriss.</td></tr></tbody></table>

détermination des acides sialiques dans les échantillons de foie et de lait de type sauvage et<em&gt; cmah</em&gt; souris knock-out.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

Le CMAH (cytidine monophosphate-N-acétylneuraminique acide hydroxylase) est responsable de l&#39;oxydation des acides cytidine monophosphate-N-acétylurauraminiques chez les mammifères. Cependant, les humains ne peuvent pas oxyder l&#39;acide cydaine monophosphate-N-acétylurauraminique en acide cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminique en raison d&#39;une deletion primaire d&#39;exon du gène CMAH . Pour comprendre plus en détail les effets et les implications du manque d&#39;activité du CMAH, un modèle Cmah knock-out chez la souris présente un vif intérêt pour la recherche fondamentale et la recherche appliquée. Le procédé d&#39;analyse pour déterminer le phénotype de ce modèle de souris est décrit ici en détail et est basé sur la détection à la fois de l&#39;acide N-acétylneuraminique et de l&#39;acide N-glycolylenuraminique dans le foie et du lait de souris de type sauvage et Cmah knock-out. Les acides sialiques endogènes sont libérés et dérivés avec de l&#39;O-phénylènediamine pour générer des dérivés fluorogènes, qui peuvent ensuite être analysés par HPLC. Le protocole présenté peut êtreA également demandé l&#39;analyse d&#39;échantillons de lait et de tissus provenant de diverses autres origines et peut être utile pour étudier les effets nutritionnels et sanitaires de l&#39;acide N-glycolylneuraminique.

Une vue d&#39;ensemble schématique du procédé d&#39;analyse décrit est illustrée à la figure 1 et comprend l&#39;isolement des acides sialiques à partir d&#39;échantillons de lait et de foie de souris mutantes de type sauvage et Cmah knock-out et de la dérivation de fluorescence et de l&#39;analyse HPLC de ces composants. La figure 2 et la figure 3 montrent des chromatogrammes HPLC représen...

Nous décrivons une méthode à base de HPLC pour la détermination de l&#39;acide N-acétylneuraminique et de l&#39;acide N-glycolylenuraminique dans le foie et le lait de souris.

Détermination des acides sialiques dans les échantillons de foie et de lait de type sauvage et<em&gt; CMAH</em&gt; Souris knock-out.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

L'objectif général de cette méthodologie est la détection de l'acide N-acétylneuraminique et de l'acide N-glycolylneuraminique dans le foie et le lait de souris de type sauvage et de souris invalidées pour le gène CMAH à l'aide d'une analyse par HPLC. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de la glycoscience, notamment l'effet que les génotypes des modèles murins CMAH ont sur la teneur réelle en acides sialiques de ces animaux. Le principal avantage de cette technique par rapport aux criblages génétiques est que les niveaux relatifs d'acides sialiques peuvent également être déterminés chez les souris hétérozygotes.L'évaluation de cette méthode sera effectuée par Cui Cao et Wang Wenjiao, deux étudiants diplômés de notre laboratoire. Commencez cette procédure par la collecte de lait de souris et de tissu hépatique de souris dont le gène CMAH a été inactivé, comme décrit dans le protocole écrit. Pour isoler les acides sialiques du lait, transférez 50 microlitres de lait dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre et ajoutez 1,2 millilitre de solution aqueuse d'acide acétique préparée.Pour isoler les acides sialiques à partir de tissu hépatique, décong

determination-sialic-acids-liver-milk-samples-wild-type-cmah-knock

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Non fixées échantillons de tissus congelés incorporés dans un milieu de température optimale de coupe (OCT) peut être utilisé pour étudier la distribution de glycosylation naturelle et du mucus sécrété. Dans cette approche de traitement de tissus est minime et la présentation naturelle des glycolipides, des mucines et glycane-épitopes est préservée. Les coupes de tissus peuvent être analysées par immunohistochimie en utilisant la détection par fluorescence ou chromogène.

Utilisation non fixés, des tissus congelés pour étudier la distribution mucine naturel

Dans cette vidéo, nous démontrons la détection des acides sialique, de l’acide N-acétylneuraminique et de l’acide N-glycolylneuraminique, à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance, HPLC, après dérivation avec un réactif de marquage fluorescent approprié pour faciliter la détection de fluorescence.

Chromatographie liquide à haute performance en phase inverse : une méthode robuste pour la quantification d’acides sialiques marqués par fluorescence et dérivés isolés du foie de souris

La collecte de lait sur des modèles animaux facilite diverses pistes de recherche : comprendre l’immunité passive, identifier les agents pathogènes responsables de la transmission verticale et, grâce à l’utilisation de souris transgéniques, voire la production commerciale de protéines présentes dans le lait maternel humain. Nous illustrons ici une méthode simple de collecte du lait chez les souris et le cerf muntjac de Reeves.

Méthodes de collecte de lait pour souris et Muntjac cerfs de Reeves

Le protocole d'immunofluorescence indirecte décrite dans cet article permet la détection et la localisation de protéines dans la glande mammaire de la souris. Procédé complète est donnée pour préparer des échantillons de la glande mammaire, pour effectuer l'immunohistochimie, l'image de coupes de tissus par microscopie à fluorescence, et de reconstruire des images.

Immunofluorescence indirecte sur des coupes congelées de glande mammaire de souris

Le transfert de lymphocytes bm12 chez un receveur C57BL/6 est un modèle établi de lupus érythémateux disséminé. Nous décrivons ici comment initier une maladie à l’aide de ce modèle et comment caractériser les cellules auxiliaires folliculaires T, les cellules B du centre germinatif et les plasmocytes par cytométrie en flux.

Le bm12 inductible modèle du lupus érythémateux disséminé (SLE) dans C57BL / 6

L’acide sialique est une monosaccharide-unité typique trouvée dans glycoconjugués. Il est impliqué dans une multitude d’interactions moléculaires et cellulaires. Nous présentons ici une méthode pour modifier l’expression de la cellule l’acide sialique surface à l’aide de glycosylation métabolique avec N- acétylmannosamine dérivés.

Glycosylation métabolique de l’acide sialique à l’aide de N-acyl-modification Mannosamines

Hypofonction de la glande salivaire est une conséquence fréquente du traitement de la maladie et le rayonnement auto-immune. L’évaluation reproductible de fonction des glandes salivaires chez les modèles murins de ces maladies est un défi technique. Ici, on décrit une méthode simple pour la mesure précise et reproductible de la production de salive chez les souris.

Une méthode pour la mesure de la fonction des glandes salivaires chez les souris

Ce travail montre le potentiel de la technologie de baies (PGA) de glycan imprimées pour l’analyse des anticorps anti-glucides chez de petits animaux en circulation.

Tableau de Glycan imprimé : Une Technique sensible pour l’analyse du répertoire des anticorps anti-glucides chez de petits animaux en circulation

Nous présentons ici un protocole pour étudier l’effet de l’invalidation des gènes reliés à la gustation sur les réponses immunitaires dans un sodium de sulfate de dextran (DSS)-induit le modèle de souris de maladie inflammatoire de l’intestin.

Effets du goût signalisation suppression de protéine sur l’Inflammation intestinale dans un modèle de souris de la maladie inflammatoire de l’intestin

Nous décrivons un modèle d’hépatite translationnelle d’immunisation in vivo chez des souris BALB/c qui peut être utilisé pour étudier la pathogenèse de l’hépatite auto-immune induite par les médicaments, y compris les différences entre les sexes observées dans cette maladie. Nous décrirons comment ce modèle démontre des analyses reproductibles à l’aide de techniques expérimentales in vivo et in vitro.

Induction d’une hépatite auto-immune induite par des médicaments chez des souris BALB/c pour l’étude de ses mécanismes pathogènes

Cet article décrit comment assembler un appareil qui peut être utilisé pour recueillir le lait de souris de laboratoire. Cet appareil est abordable, portable et permet de recueillir de 0,1 à 0,5 ml de lait par une seule personne formée. Un protocole de traite détaillé est également inclus.

Une technique efficace pour l’échantillonnage du lait sur des souris de laboratoire

Découvrez une méthode d'analyse des acides sialiques dans le foie et le lait de souris CMAH knock-out par chromatographie liquide haute performance. Cette technique permet de quantifier les niveaux d'acide N-acétylneuraminique et d'acide N-glycolylneuraminique chez les souris homozygotes et hétérozygotes.

Détermination des acides sialiques dans les échantillons de foie et de lait de type sauvage et

Explorer plus de vidéos