Name: Détermination des acides sialiques dans les échantillons de foie et de lait de type sauvage et CMAH Souris knock-out. (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse des acides sialiques dans le foie et le lait de souris CMAH knock-out par chromatographie liquide haute performance. Cette technique permet de quantifier les niveaux d'acide N-acétylneuraminique et d'acide N-glycolylneuraminique chez les souris homozygotes et hétérozygotes.

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Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 31471703, A0201300537 et 31671854 à JV et LL) et au 100 Plan des talents étrangers (numéro de subvention JSB2014012 à JV).

Les procédures impliquant des sujets d&#39;animaux ont été approuvées par le Comité d&#39;éthique du Centre animal expérimental de l&#39;Université agricole de Nanjing conformément aux Lignes directrices nationales pour le bien-être animal expérimental (Ministère de la Science et de la Technologie, PR de Chine, 2006) avec les animaux hébergés dans un SPF Installation (ID d&#39;autorisation: SYXK-J-2011-0037). 1. Modèle de souris Cmah Knock-out <ol><li> Utiliser des souris C57Bl / 6 de type sauvage du Centre de médecine comparée de l&#39;Université de Yangzhou (Chine). NOTE: Les souris Cmah knock-out ont été générées en fonction de l&#39;information fournie par les précédentes études Cmah knock-out 17 , 19 et obtenues commercialement en utilisant une stratégie CRISPR / Cas9 20 en éliminant 92 paires de bases de l&#39;exon 6 du gène Cmah , qui est également Supprimé dans le gène CMAH humain 19 . Positif F 0 &lt;/ Sub&gt; -mice (2 individus) ont été croisés avec des souris de type sauvage pour obtenir un mélange F 1 hétérozygote. Après avoir traversé le mélange de F 1 hétérozygote (5 individus), on peut obtenir un homozygose à la souris F- 2 (3 individus). </li><li> Effectuer le génotypage de souris en utilisant de l&#39;ADN génomique selon la méthode montrée par Zangala 21 en utilisant un kit commercial de purification d&#39;ADN. <ol><li> Amplifier un fragment d&#39;ADN correspondant du gène Cmah en utilisant une ADN polymérase commerciale et la paire d&#39;amorces 5&#39;gaaagggctcggctctgtatgaa3 &#39;et 5&#39;tttaaaatgtcccgggtgagaagc3&#39;. Effectuer l&#39;amplification du gène en utilisant 34 cycles de PCR consistant en une dénaturation à 94 ° C pendant 40 s, un recuit à 63 ° C pendant 40 s et un allongement à 72 ° C pendant 1 min. </li><li> Visualiser les produits de PCR sur un gel d&#39;agarose à 1%. On devrait observer une seule bande (0,5 kb) pour l&#39;individu de type sauvage, une bande double (0,4 et 0,5 kb) pour laIndividu hétérozygote knock-out, et une bande unique (0,4 kb) pour l&#39;individu knock-out homozygote. </li></ol></li></ol> 2. Collection d&#39;échantillons <ol><li> Recueillir du lait de souris en utilisant le protocole décrit par Willingham et al. 22 . </li><li> Recueillir du tissu hépatique de souris en utilisant le protocole décrit par Gonçalves et al. 23 et stockez les échantillons à -80 ° C. </li></ol> 3. Isolation des acides sialiques du lait <ol><li> Préparer 100 ml d&#39;une solution d&#39;acide acétique 2 M en ajoutant 12 ml d&#39;acide acétique glacial dans 88 ml d&#39;H 2 O distillé. </li><li> Transférer 50 μL de lait dans un tube de centrifugation de 1,5 ml et ajouter 1,2 ml de la solution aqueuse d&#39;acide acétique préparée. </li><li> Incuber la suspension pendant 4 h à 80 ° C et centrifuger l&#39;échantillon à 14 000 xg pendant 10 min. </li><li> Transférer le dessus de 1000 μL du surnageant dans un tube de centrifugation de 1,5 mL frais et remDéposer le solvant par évaporation centrifuge à température ambiante jusqu&#39;à la sécheresse complète (selon la pompe à vide ci-jointe, cela prendra de 4 à 20 h). Ré-dissoudre l&#39;échantillon dans 500 ul de H 2 O distillé. </li><li> Préparez une colonne d&#39;échange de micro-anions. Cette étape va spécifiquement enrichir les composés anioniques et éliminer les composés cationiques et neutres des échantillons de lait et de foie, et augmente donc la sélectivité de l&#39;agent d&#39;étiquetage OPD fluorogène pour la dérivatisation de l&#39;acide sialique. <ol><li> Transférer pour chaque échantillon 200 mg de la résine échangeuse d&#39;anions (Dowex 1X8) dans des tubes de colonne de 3 mL vides avec un robinet d&#39;arrêt attaché. </li><li> Ajouter 2 ml de la solution aqueuse d&#39;acide acétique préparée à l&#39;étape 3.1 pour remplacer les ions chlorure dans la résine par des ions acétate. Fermez le robinet dès que le solvant atteint le haut de la résine. </li><li> Ajoutez doucement 2 ml d&#39;H 2 O distillé, ouvrez le robinet et arrête le débit dès que la majeure partie du solvant atteintLe dessus de la résine. Assurez-vous que la résine est toujours recouverte de solvant. </li><li> Laver la colonne de résine deux fois de plus avec 2 ml d&#39;H 2 O distillé pour éliminer l&#39;excès d&#39;acétate. </li></ol></li><li> Transférer les 500 μL résultants d&#39;échantillon de solvant à partir de l&#39;étape 3.4. Sur la colonne de résine et jeter l&#39;écoulement. Laver délicatement la résine avec 2 ml d&#39;H 2 O distillé. Eluer les échantillons d&#39;anions de la résine en utilisant 1 ml d&#39;une solution d&#39;acétate d&#39;ammonium 50 mM (386 mg d&#39;acétate d&#39;ammonium dissous dans 100 ml d&#39;H 2 O distillé) dans un 1,5 ml Tube centrifuge. Retirer le solvant par evaporation centrifuge à température ambiante jusqu&#39;à la sécheresse. REMARQUE: Les échantillons secs peuvent être conservés à 4-6 ° C pendant 12 mois maximum. </li></ol> 4. Isolation des acides sialiques à partir du tissu de foie <ol><li> Dégraisser doucement 20 à 50 mg de foie de souris et le transférer dans un moulin à papier Dounce (1 mL ou 2 mL de volume). Ajouter 1,2 ml de la solution aqueuse d&#39;acide acétiquePréparé à l&#39;étape 3.1 et homogénéiser le tissu par cisaillement doux pendant 10 s. Transférer la suspension résultante dans un tube de centrifugation de 1,5 ml. </li><li> Suivez les étapes 3.3. À 3.6. REMARQUE: Les échantillons secs peuvent être conservés à 4-6 ° C pendant 12 mois maximum. </li></ol> 5. Préparation d&#39;un ester d&#39;acide sialique mixte <ol><li> Peser entre 5 et 8 mg d&#39;acide N-acétylneuraminique sur un bilan analytique dans un tube de centrifugation de 1,5 mL. Notez le poids exact et ajoutez 164 μL d&#39;H 2 O distillé pour chaque mg ( c.-à - d. Si le poids de Neu5Ac est de 7,2 mg puis ajoutez 7,2 x 164 = 1, 181 μl d&#39;H 2 O distillé). Il en résulte une solution mère de 20 mM Neu5Ac qui peut être stockée à -20 ° C pendant 12 mois. </li><li> Obtenir de l&#39;acide N-glycolylneuraminique à des quantités plus petites à un prix modéré tel que dans des aliquotes de 1 mg. Ajouter 154 μl d&#39;H 2 O distillé directement au composé afin d&#39;obtenir une solution mère de Neu5Gc ~ 20 mM. Transférer leSolution dans un tube de centrifugation de 1,5 ml. Cette solution peut être stockée à -20 ° C pendant 12 mois maximum. </li><li> Mélanger 5 μL de chaque solution mère de l&#39;étape 5.1 et 5.2 dans un tube centrifuge frais de 1,5 mL et éliminer le solvant par evaporation centrifuge à température ambiante jusqu&#39;à la sécheresse. REMARQUE: le standard d&#39;acide sialique mélangé peut être conservé entre 4 et 6 ° C pendant 12 mois maximum. </li></ol> 6. Fluoréscence de la dérivation des acides sialiques <ol><li> Préparer 10 mL de solution OPD, consistant en 100 mg d&#39;o-phénylènediamine et 208 mg d&#39;hydrogénosulfite de sodium dans 10 ml d&#39;H 2 O distillé. </li><li> Ajouter 20 μL de solution OPD aux échantillons d&#39;acide sialique dérivés du lait de souris (étape 3), du foie de souris (étape 4) ou du standard d&#39;acide sialique mixte (étape 5). Vortex vigoureusement pendant 30 s et incuber les échantillons pendant 4 h à 80 ° C dans l&#39;obscurité ( c.-à-d. Envelopper les microtubes dans du papier d&#39;aluminium). </li><li> Laisser refroidir les échantillons pendant 5 minutes, ajouter 80 μ; L d&#39;H 2 O distillé et centrifuger les tubes à 14 000 xg pendant 1 min. </li><li> Transférer 80 μL du surnageant dans un flacon HPLC à haute récupération de 300 μL. Les échantillons d&#39;acide sialique dérivés peuvent être conservés entre 4 et 6 ° C pendant une semaine. </li></ol> 7. Analyse HPLC des dérivés de l&#39;acide sialique <ol><li> Analyser les échantillons en utilisant un système HPLC standard connecté à un détecteur de fluorescence en ligne. </li><li> Utilisez une colonne en phase inversée C18 avec les dimensions standard de 250 mm de longueur et 4,6 mm de diamètre pour l&#39;analyse. </li><li> Préparer le solvant A en diluant 200 ml de solution stock avec 800 ml d&#39;eau de qualité LCMS (LCMS - spectrométrie de masse en chromatographie liquide). La solution stock elle-même peut être préparée comme suit: <ol><li> Ajouter 46 g d&#39;acide formique à 800 ml d&#39;H 2 O de qualité LCMS. </li><li> Ajuster le pH à 4,5 en ajoutant goutte à goutte une solution d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium (pur. Pa). </li><li> Transférer le solvant à unMesurez le cylindre et remplissez jusqu&#39;à 1000 mL avec H 2 O de qualité LCMS. Cette solution mère peut être conservée entre 4 et 6 ° C pendant 3 mois maximum. </li></ol></li><li> Pour le solvant B, utiliser de l&#39;acétonitrile de qualité LCMS. </li><li> Séparer les dérivés d&#39;acides sialiques à un débit de 1 mL / min avec l&#39;élution en gradient suivant: <ol><li> Commencez par ajouter 10% de solvant B mélangé au solvant A. </li><li> De 0 min à 15 min, augmente progressivement la proportion de solvant B avec un gradient linéaire à 60%. </li><li> De 15 min à 16 min, augmente rapidement la proportion de solvant B avec un gradient linéaire de 60% à 90%. Ceci initie le lavage de la colonne HPLC. </li><li> Pour laver davantage la colonne HPLC, maintenir le niveau de solvant B à 90% entre 16 min et 18 min avant de réduire progressivement le taux de solvant B de nouveau à 10% entre 18 min et 19 min. </li><li> Rééquilibrer la colonne HPLC aux conditions de départ de 10% B entre 19 et 24 minutes. </li></ol></li><li> DansJeter 50 μL d&#39;échantillon dans le système HPLC. </li><li> Surveiller les éluants en utilisant les longueurs d&#39;onde d&#39;excitation / émission du détecteur de fluorescence de 373/448 nm, et les acides sialiques dérivés peuvent être attendus aux temps de rétention approximatifs de 9 min (pour Neu5Gc-OPD) et 10 min (pour Neu5Ac-OPD). </li><li> Calculer la quantité relative de Neu5Gc (F Neu5Gc ) des zones de pointe de fluorescence des Neu5Ac (A Neu5Ac ) et Neu5Gc (A Neu5Gc ) comme suit: F Neu5Gc [%] = 100 × A Neu5Gc / (A Neu5Ac + A Neu5Gc ). Dans le cas des échantillons de lait et de foie de la souris homozygote Cmah knock-out, F Neu5Gc devrait être de 0%, alors que les valeurs de F Neu5Gc de souris hétérozygotes et de type sauvage peuvent varier considérablement en fonction de l&#39;âge de la souris et du type de tissu (entre 2% Et&gt; 90%) avec des marges d&#39;erreur attendues de ± 12%. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Le protocole présenté ici permet l&#39;évaluation phénotypique des souris homozygotes Cmah knock-out en analysant et en quantifiant les quantités relatives de Neu5Gc de lait et d&#39;échantillons de foie. L&#39;analyse a été effectuée en utilisant une configuration HPLC standard avec détection de fluorescence. L&#39;étape la plus critique de cette procédure est la préparation des colonnes d&#39;échange d&#39;anions et la réalisation de la chromatographie d&#39;échange d&#39;anions; Régler correctement ...

L&#39;acide N-acétylneuraminique (Neu5Ac) et l&#39;acide N-glycolylneuraminique (Neu5Gc) sont les acides sialiques les plus courants chez la plupart des mammifères 1 . Bien que capable de synthétiser Neu5Ac de manière endogène, les humains ne sont pas capables de produire Neu5Gc en raison d&#39;une deletion primaire d&#39;exon sur le gène CMAH codant pour une hydroxylase CMP-Neu5Ac 2 , 3 . Cependant, les produits alimentaires à base d&#39;animaux peuvent être des sources alimentaires de Neu5Gc 4 , 5 , 6 , conduisant à la production d&#39;anticorps anti-Neu5Gc et déclenchent donc une réponse immunitaire envers Neu5Gc 7 . Cet effet diététique de Neu5Gc est suspecté de contribuer à l&#39;inflammation chronique et à diverses autres maladies 8 , 9 , 10 . Afin de comprendre de façon compréhensive les effets de Neu5Gc en hUn modèle animal pour l&#39;étude systématique des effets des acides sialiques d&#39;origine alimentaire est hautement souhaitable. Bien que les protocoles basés sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour l&#39;analyse de souris knock-out soient bien établis et constituent un moyen pratique pour l&#39;évaluation génotypique, l&#39;analyse fonctionnelle du phénotype sur le niveau métabolique nécessite des méthodes d&#39;analyse plus spécifiques. Le phénotype d&#39;un modèle de souris Cmah knock-out peut être évalué en isolant et en analysant la composition des acides sialiques dans des échantillons de foie ou de lait. Plusieurs méthodes pour la détection des acides sialiques dans les tissus animaux ont déjà été rapportées: la réaction des acides sialiques avec le résorcinol 11 ou l&#39;acide thiobarbiturique 12 entraîne la formation d&#39;un produit chromophore et peut être simplement analysée à l&#39;aide d&#39;une configuration basée sur platereader, mais seulement le sialique total La teneur en acide peut être déterminée. En variante, l&#39;analyse des acides sialiques a également été décrite en utilisant une Chromatographie en phase gazeuse13 , la spectrométrie de masse MALDI-ToF 14 ou les méthodes ampérométriques 15 . Cependant, les méthodes d&#39;analyse d&#39;acide sialique les plus couramment appliquées sont basées sur la libération hydrolytique, suivie d&#39;une dérivation de fluorescence et de la Chromatographie liquide 16 , 17 , 18 .

<table><tbody><tr><td>Produits chimiques <fort> :</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide N-acétylneuraminique</td><td>Sigma</td><td>A0812</td><td></td></tr><tr><td>Acide N-glycolylneuraminique</td><td>Sigma</td><td>50644</td><td>1 mg aliquote devrait être suffisant</td></tr><tr><td>o-Phénylènediamine</td><td>Sigma</td><td>694975</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogénésulfite</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>75234</td><td></td></tr><tr><td>Outils/Matériaux :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL Tubes SPE</td><td>Supelco</td><td>Sigma 57024</td><td>vides Colonnes d’extraction en phase solide</td></tr><tr><td>Luer stopcock</td><td>Sigma</td><td>S7396</td><td>pour arrêter l’écoulement du tube SPE</td></tr><tr><td>Dowex 1X8</td><td>Dow Chemicals</td><td>Sigma 44340</td><td>200 - 400 mesh</td></tr><tr><td>Dounce broyeur de tissus</td><td>Sigma</td><td>D8938</td><td>tight fit</td></tr><tr><td>HPLC Analysis :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacon HPLC à haute récupération</td><td>Agilent Technologies</td><td>#5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>Système HPLC</td><td>Détecteur de fluorescence Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>pour HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Column</td><td>Phenomenex</td><td>Hyperclone ODS</td><td>250 x 4,6 mm</td></tr> H<tr><td>2O</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile de qualité LCMS</td><td>Merck Millipore</td><td>#100029</td><td>Hypergrade</td></tr> Solution <tr><td>d’hydroxyde d’ammonium</td><td>Fluka</td><td>#44273</td><td>puriss.</td></tr></tbody></table>

détermination des acides sialiques dans les échantillons de foie et de lait de type sauvage et<em&gt; cmah</em&gt; souris knock-out.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

Le CMAH (cytidine monophosphate-N-acétylneuraminique acide hydroxylase) est responsable de l&#39;oxydation des acides cytidine monophosphate-N-acétylurauraminiques chez les mammifères. Cependant, les humains ne peuvent pas oxyder l&#39;acide cydaine monophosphate-N-acétylurauraminique en acide cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminique en raison d&#39;une deletion primaire d&#39;exon du gène CMAH . Pour comprendre plus en détail les effets et les implications du manque d&#39;activité du CMAH, un modèle Cmah knock-out chez la souris présente un vif intérêt pour la recherche fondamentale et la recherche appliquée. Le procédé d&#39;analyse pour déterminer le phénotype de ce modèle de souris est décrit ici en détail et est basé sur la détection à la fois de l&#39;acide N-acétylneuraminique et de l&#39;acide N-glycolylenuraminique dans le foie et du lait de souris de type sauvage et Cmah knock-out. Les acides sialiques endogènes sont libérés et dérivés avec de l&#39;O-phénylènediamine pour générer des dérivés fluorogènes, qui peuvent ensuite être analysés par HPLC. Le protocole présenté peut êtreA également demandé l&#39;analyse d&#39;échantillons de lait et de tissus provenant de diverses autres origines et peut être utile pour étudier les effets nutritionnels et sanitaires de l&#39;acide N-glycolylneuraminique.

Une vue d&#39;ensemble schématique du procédé d&#39;analyse décrit est illustrée à la figure 1 et comprend l&#39;isolement des acides sialiques à partir d&#39;échantillons de lait et de foie de souris mutantes de type sauvage et Cmah knock-out et de la dérivation de fluorescence et de l&#39;analyse HPLC de ces composants. La figure 2 et la figure 3 montrent des chromatogrammes HPLC représen...

Nous décrivons une méthode à base de HPLC pour la détermination de l&#39;acide N-acétylneuraminique et de l&#39;acide N-glycolylenuraminique dans le foie et le lait de souris.

Détermination des acides sialiques dans les échantillons de foie et de lait de type sauvage et<em&gt; CMAH</em&gt; Souris knock-out.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

L'objectif général de cette méthodologie est la détection de l'acide N-acétylneuraminique et de l'acide N-glycolylneuraminique dans le foie et le lait de souris de type sauvage et de souris invalidées pour le gène CMAH à l'aide d'une analyse par HPLC. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de la glycoscience, notamment l'effet que les génotypes des modèles murins CMAH ont sur la teneur réelle en acides sialiques de ces animaux. Le principal avantage de cette technique par rapport aux criblages génétiques est que les niveaux relatifs d'acides sialiques peuvent également être déterminés chez les souris hétérozygotes.L'évaluation de cette méthode sera effectuée par Cui Cao et Wang Wenjiao, deux étudiants diplômés de notre laboratoire. Commencez cette procédure par la collecte de lait de souris et de tissu hépatique de souris dont le gène CMAH a été inactivé, comme décrit dans le protocole écrit. Pour isoler les acides sialiques du lait, transférez 50 microlitres de lait dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre et ajoutez 1,2 millilitre de solution aqueuse d'acide acétique préparée.Pour isoler les acides sialiques à partir de tissu hépatique, décongelez délicatement 20 à 50 milligrammes de foie de souris et transférez-les dans un homogénéisateur de tissus Dounce. Ajoutez 1,2 millilitre de la solution aqueuse d'acide acétique et homogénéisez le tissu par cisaillement doux pendant 10 secondes. Transférez la suspension obtenue dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre.Ensuite, incuber le lait acidifié ou la suspension tissulaire pendant quatre heures à 80 degrés Celsius. Puis, centrifuger l'échantillon à 14 000 ×g pendant 10 minutes. Transférer les 1000 microlitres supérieurs du surnageant dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 millilitre.Éliminer le solvant par évaporation centrifuge à température ambiante jusqu'à complète dessiccation. Redissoudre l'échantillon dans 500 microlitres d'eau distillée. Ensuite, préparer une colonne microd'échange d'anions en transférant 200 milligrammes de résine échangeuse d'anions par échantillon dans des tubes vides de 3 millilitres munis d'un robinet.Ajoutez 2 millilitres de la solution aqueuse d'acide acétique pour remplacer les ions chlorure dans la résine par des ions acétate. Fermez le robinet dès que le solvant atteint le haut de la résine. Ajoutez doucement 2 millilitres d'eau distillée et ouvrez le robinet.Arrêtez l'écoulement dès que la majeure partie du solvant atteint le haut de la résine. Veillez à ce que la résine soit toujours recouverte de solvant. Ensuite, lavez la colonne de résine deux fois supplémentaires avec deux millilitres d'eau distillée afin d'éliminer l'excès d'acétate.Transférez les 500 microlitres de solvant d'échantillon obtenus sur la colonne de résine et jetez l'écoulement. Lavez délicatement la résine avec 2 millilitres d'eau distillée. Éluerez les anions de l'échantillon de la résine à l'aide de 1 millilitre d'une solution d'acétate d'ammonium à 50 millimolaire dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre.Éliminer le solvant par évaporation centrifuge à température ambiante jusqu'à séchage. Peser entre 5 et 8 milligrammes d'acide N-acétylneuraminique sur une balance analytique dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre. Noter le poids exact et ajouter 164 microlitres d'eau distillée par milligramme.Obtenez de l'acide N-glycolylneuraminique en petites quantités à un prix modéré, par exemple en aliquots de 1 milligramme. Ajoutez directement 154 microlitres d'eau distillée au composé pour obtenir une solution mère d'environ 20 millimolaire de Neu5Gc. Transférez la solution dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre.Cette solution peut être conservée à moins 20 degrés Celsius pendant jusqu'à 12 mois. Combiner 5 microlitres de chaque solution mère dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 millilitre. Ensuite, éliminer le solvant par évaporation centrifuge à température ambiante jusqu'à séchage complet.Ajouter 20 microlitres de la solution OPD aux échantillons d'acide sialique provenant du lait de souris, du foie de souris ou de l'étalon mixte d'acides sialiques. Vortexer vigoureusement l'échantillon pendant 30 secondes. Incuber ensuite les échantillons pendant quatre heures à 80 degrés Celsius à l'abri de la lumière.Après avoir laissé refroidir les échantillons pendant cinq minutes, ajouter 80 microlitres d'eau distillée. Ensuite, centrifuger les tubes à 14 000 ×g pendant une minute. Puis, transférer 80 microlitres du surnageant dans un flacon HPLC haute-récupération de 300 microlitres.Les échantillons d'acide sialique dérivés peuvent être conservés entre quatre et six degrés Celsius pendant jusqu'à une semaine. Analyser les échantillons à l'aide d'un système HPLC standard relié à un détecteur de fluorescence en ligne. Utiliser une colonne en phase inverse C18 ayant une longueur de 250 millimètres et un diamètre de 4,6 millimètres pour l'analyse.Après avoir préparé le solvant A et le solvant B, et configuré l'analyse HPLC comme décrit dans le protocole, injectez 50 microlitres de l'échantillon dans le système HPLC. Surveillez l'élution en utilisant la longueur d'onde d'excitation du détecteur de fluorescence de 373 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 448 nanomètres. Enfin, calculez la quantité relative de Neu5Gc comme décrit dans le protocole écrit.On observe ici des chromatogrammes HPLC représentatifs d'acides sialiques marqués par fluorescence provenant d'échantillons de lait, issus de souris CMAH knock-out homozygotes et de souris CMAH knock-out hétérozygotes. Des souris de type sauvage sont également présentées. De même, les chromatogrammes d'acides sialiques marqués par fluorescence provenant du foie de souris sont montrés ici.La comparaison des quantités relatives de Neu5Gc montre que les souris homozygotes pour le gène CMAH inactivé ne contiennent aucune Neu5Gc, tandis que les souris hétérozygotes pour l'inactivation de CMAH et les souris de type sauvage en contiennent entre 10 et 75 %. Une fois la technique maîtrisée, les échantillons peuvent être préparés en moins de huit heures si la procédure est correctement réalisée. En outre, les échantillons peuvent être analysés par échantillonnage automatique en HPLC pendant la nuit.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'effectuer l'isolement de l'acide sialique et la procédure de dérivation le même jour. Après la procédure, d'autres méthodes, telles que l'analyse par spectrométrie de masse, peuvent être réalisées afin de confirmer la nature des signaux fluorescents obtenus. Le développement de cette technique permet aux chercheurs d'explorer la répartition des acides sialiques dans des échantillons biologiques.N'oubliez pas que le travail avec de l'acide acétique et de l'acide formique concentrés peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port d'équipements de protection doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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