Détermination des acides sialiques dans les échantillons de foie et de lait de type sauvage et

L'objectif général de cette méthodologie est la détection de l'acide N-acétylneuraminique et de l'acide N-glycolylneuraminique dans le foie et le lait de souris de type sauvage et de souris invalidées pour le gène CMAH à l'aide d'une analyse par HPLC. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de la glycoscience, notamment l'effet que les génotypes des modèles murins CMAH ont sur la teneur réelle en acides sialiques de ces animaux. Le principal avantage de cette technique par rapport aux criblages génétiques est que les niveaux relatifs d'acides sialiques peuvent également être déterminés chez les souris hétérozygotes.

L'évaluation de cette méthode sera effectuée par Cui Cao et Wang Wenjiao, deux étudiants diplômés de notre laboratoire. Commencez cette procédure par la collecte de lait de souris et de tissu hépatique de souris dont le gène CMAH a été inactivé, comme décrit dans le protocole écrit. Pour isoler les acides sialiques du lait, transférez 50 microlitres de lait dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre et ajoutez 1,2 millilitre de solution aqueuse d'acide acétique préparée.

Pour isoler les acides sialiques à partir de tissu hépatique, décongelez délicatement 20 à 50 milligrammes de foie de souris et transférez-les dans un homogénéisateur de tissus Dounce. Ajoutez 1,2 millilitre de la solution aqueuse d'acide acétique et homogénéisez le tissu par cisaillement doux pendant 10 secondes. Transférez la suspension obtenue dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre.

Ensuite, incuber le lait acidifié ou la suspension tissulaire pendant quatre heures à 80 degrés Celsius. Puis, centrifuger l'échantillon à 14 000 ×g pendant 10 minutes. Transférer les 1000 microlitres supérieurs du surnageant dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 millilitre.

Éliminer le solvant par évaporation centrifuge à température ambiante jusqu'à complète dessiccation. Redissoudre l'échantillon dans 500 microlitres d'eau distillée. Ensuite, préparer une colonne microd'échange d'anions en transférant 200 milligrammes de résine échangeuse d'anions par échantillon dans des tubes vides de 3 millilitres munis d'un robinet.

Ajoutez 2 millilitres de la solution aqueuse d'acide acétique pour remplacer les ions chlorure dans la résine par des ions acétate. Fermez le robinet dès que le solvant atteint le haut de la résine. Ajoutez doucement 2 millilitres d'eau distillée et ouvrez le robinet.

Arrêtez l'écoulement dès que la majeure partie du solvant atteint le haut de la résine. Veillez à ce que la résine soit toujours recouverte de solvant. Ensuite, lavez la colonne de résine deux fois supplémentaires avec deux millilitres d'eau distillée afin d'éliminer l'excès d'acétate.

Transférez les 500 microlitres de solvant d'échantillon obtenus sur la colonne de résine et jetez l'écoulement. Lavez délicatement la résine avec 2 millilitres d'eau distillée. Éluerez les anions de l'échantillon de la résine à l'aide de 1 millilitre d'une solution d'acétate d'ammonium à 50 millimolaire dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre.

Éliminer le solvant par évaporation centrifuge à température ambiante jusqu'à séchage. Peser entre 5 et 8 milligrammes d'acide N-acétylneuraminique sur une balance analytique dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre. Noter le poids exact et ajouter 164 microlitres d'eau distillée par milligramme.

Obtenez de l'acide N-glycolylneuraminique en petites quantités à un prix modéré, par exemple en aliquots de 1 milligramme. Ajoutez directement 154 microlitres d'eau distillée au composé pour obtenir une solution mère d'environ 20 millimolaire de Neu5Gc. Transférez la solution dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre.

Cette solution peut être conservée à moins 20 degrés Celsius pendant jusqu'à 12 mois. Combiner 5 microlitres de chaque solution mère dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 millilitre. Ensuite, éliminer le solvant par évaporation centrifuge à température ambiante jusqu'à séchage complet.

Ajouter 20 microlitres de la solution OPD aux échantillons d'acide sialique provenant du lait de souris, du foie de souris ou de l'étalon mixte d'acides sialiques. Vortexer vigoureusement l'échantillon pendant 30 secondes. Incuber ensuite les échantillons pendant quatre heures à 80 degrés Celsius à l'abri de la lumière.

Après avoir laissé refroidir les échantillons pendant cinq minutes, ajouter 80 microlitres d'eau distillée. Ensuite, centrifuger les tubes à 14 000 ×g pendant une minute. Puis, transférer 80 microlitres du surnageant dans un flacon HPLC haute-récupération de 300 microlitres.

Les échantillons d'acide sialique dérivés peuvent être conservés entre quatre et six degrés Celsius pendant jusqu'à une semaine. Analyser les échantillons à l'aide d'un système HPLC standard relié à un détecteur de fluorescence en ligne. Utiliser une colonne en phase inverse C18 ayant une longueur de 250 millimètres et un diamètre de 4,6 millimètres pour l'analyse.

Après avoir préparé le solvant A et le solvant B, et configuré l'analyse HPLC comme décrit dans le protocole, injectez 50 microlitres de l'échantillon dans le système HPLC. Surveillez l'élution en utilisant la longueur d'onde d'excitation du détecteur de fluorescence de 373 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 448 nanomètres. Enfin, calculez la quantité relative de Neu5Gc comme décrit dans le protocole écrit.

On observe ici des chromatogrammes HPLC représentatifs d'acides sialiques marqués par fluorescence provenant d'échantillons de lait, issus de souris CMAH knock-out homozygotes et de souris CMAH knock-out hétérozygotes. Des souris de type sauvage sont également présentées. De même, les chromatogrammes d'acides sialiques marqués par fluorescence provenant du foie de souris sont montrés ici.

La comparaison des quantités relatives de Neu5Gc montre que les souris homozygotes pour le gène CMAH inactivé ne contiennent aucune Neu5Gc, tandis que les souris hétérozygotes pour l'inactivation de CMAH et les souris de type sauvage en contiennent entre 10 et 75 %. Une fois la technique maîtrisée, les échantillons peuvent être préparés en moins de huit heures si la procédure est correctement réalisée. En outre, les échantillons peuvent être analysés par échantillonnage automatique en HPLC pendant la nuit.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'effectuer l'isolement de l'acide sialique et la procédure de dérivation le même jour. Après la procédure, d'autres méthodes, telles que l'analyse par spectrométrie de masse, peuvent être réalisées afin de confirmer la nature des signaux fluorescents obtenus. Le développement de cette technique permet aux chercheurs d'explorer la répartition des acides sialiques dans des échantillons biologiques.

N'oubliez pas que le travail avec de l'acide acétique et de l'acide formique concentrés peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port d'équipements de protection doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.