Analyse cinématique démarche plan sagittal chez les souris C57BL/6 soumis à MOG35-55 induit une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

L’objectif global de cette procédure est de mesurer les déficiences motrices fonctionnelles dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale ou EAE, modèle murin de sclérose en plaques, à l’aide de l’analyse cinématique de la marche. L’application de l’analyse cinématique de la marche au comportement de marche de la souris a déjà été établie et décrite par d’autres. Les déficits neurologiques d’une EAE résultent d’une inflammation neuronale et d’une perte sporadique de substance blanche dans toute la moelle épinière et le cervelet.

Traditionnellement, la stabilité motrice chez les souris EAE a été évaluée à l’aide de systèmes de notation clinique, dans lesquels les souris se voient attribuer un score clinique basé sur l’impression de l’observateur de la gravité des déficits moteurs. Les données des scores cliniques sont ordinales et ne sont pas bien corrélées avec l’histopathologie de la moelle épinière. L’analyse cinématique de la marche s’est récemment avérée être un meilleur corrélat comportemental de la perte de substance blanche que les scores cliniques, en plus de fournir une description objective des déficits de marche chez les souris EAE.

Cette technique consiste à placer des marqueurs réfléchissants sur les membres hauts des souris et à leur permettre de marcher sur un tapis roulant tout en étant enregistrées avec une caméra à haute vitesse. Les paramètres cinématiques sont ensuite extraits de la vidéo à l’aide d’un logiciel d’analyse de mouvement. La première étape consiste à fabriquer les marqueurs qui seront placés sur la patte arrière de l’animal.

La réflexion de la lumière sur ces marqueurs permet d’extraire les coordonnées des points anatomiques de la jambe à partir des vidéos. Pour commencer, percez le nombre de cercles souhaité sur la feuille de papier réfléchissant. Chaque souris a besoin de cinq marqueurs par enregistrement, deux grands et trois petits.

À l’aide de ciseaux fins, faites une coupe s’étendant du périmètre au centre du cercle. Décollez le support en papier pour révéler la surface adhésive à l’aide d’une pince fine. Saisissez le marqueur avec une pince et, à l’aide de votre doigt, enroulez-le sur lui-même pour former un cône.

Pour faire un petit marqueur, faites une coupe plus longue et courbez le cône plus serré. Pour faire un grand marqueur, faites une coupe plus courte et enroulez le cône plus lâchement. À l’aide d’un pistolet à colle chaude, remplissez l’intérieur du cône de colle et collez-le sur un morceau de carton.

Il est important de remplir complètement le marqueur avec de la colle pour éviter qu’il ne s’effondre lors de la manipulation pendant l’enregistrement. Une fois la colle sèche, coupez le marqueur à l’aide d’un scalpel. Assurez-vous de couper loin de votre corps.

L’étape suivante consiste à préparer l’animal pour l’enregistrement. Pour ce faire, les marqueurs réfléchissants doivent être collés sur le membre postérieur de la souris aux endroits anatomiques appropriés. Ceci est effectué sous anesthésie légère.

Placez la souris dans une chambre d’induction et anesthésez-la avec de l’isoflurane à 2,5 %. Une fois inconscient, transférez la souris de la chambre d’induction à un cône nasal ou à un coussin chauffant à recirculation d’eau. Appliquez un lubrifiant topique sur les deux yeux.

Rasez le membre postérieur souhaité en s’étendant de la cheville à la colonne vertébrale et au bas des côtes. Dans cette démonstration, nous recodons les mouvements du membre postérieur droit, mais l’un ou les deux membres peuvent être utilisés. Localisez la crête iliaque en rapprochant les deux genoux avec le pouce et l’index et en palpant juste en dessous des côtes.

Marquez cet emplacement à l’aide d’un marqueur permanent. Localisez la hanche en étendant la jambe et en la déplaçant d’avant en arrière. Placez un marqueur sur l’articulation de la hanche, qui est le point d’articulation entre la tête du fémur et le bassin.

À l’aide d’une règle souple, mesurez et notez la longueur du tibia ou de la tige de la souris. Mesurez et notez également la longueur du fémur ou de la cuisse. Pour isoler le quatrième orteil pour le placement du marqueur, collez le reste du pied.

Saisissez un petit marqueur avec une pince et trempez l’extrémité plate dans de la colle. Placez le petit marqueur sur la pointe du quatrième orteil. Placez un autre petit marqueur sur l’articulation métatarso-phalangienne.

Placez le dernier petit marqueur sur la cheville. Placez un gros marqueur sur l’articulation de la hanche directement sur la marque sur la peau. Placez le deuxième grand marqueur sur la marque au-dessus de la crête iliaque.

Retirez le ruban adhésif du pied. Placez la souris dans une cage de récupération et transportez-la immédiatement dans la salle d’enregistrement de la marche. L’étape suivante consiste à enregistrer la souris marchant sur un tapis roulant.

Cette photo est de notre configuration d’enregistrement sur tapis roulant, montrant la lumière, la caméra à grande vitesse et le tapis roulant. Avant d’enregistrer la démarche de la souris, prenez une photo d’un bloc d’étalonnage dont les dimensions sont connues sur le tapis roulant. Cela permettra aux pixels de la vidéo d’être convertis en mesures réelles.

Il est essentiel que l’angle de la caméra et la position à laquelle l’image d’étalonnage est prise restent les mêmes pendant l’enregistrement du comportement de marche. Placez la souris dans le tapis roulant. Augmentez progressivement la vitesse du tapis de course pour orienter la souris dans la bonne direction.

Accélérez lentement jusqu’à 20 centimètres par seconde, ce qui est la vitesse de course idéale pour obtenir des enregistrements de démarche régulière. Pour une analyse précise, il est préférable d’enregistrer huit à 12 cycles de marche régulière. C’est un exemple de marche régulière.

Ce qui suit est la même vidéo montrée à mi-vitesse. Parce que les souris marchent si vite, il peut être utile de visionner les vidéos à des vitesses plus lentes pour compter les cycles de pas et mieux apprécier le modèle de démarche. Voici un exemple d’une souris EAE marchant sur le tapis roulant.

Cette souris est incapable de supporter son poids corporel car son bassin est très bas par rapport au sol. De plus, il a du mal à lever son pied du sol pendant la phase de balancement. Il s’agit d’un exemple d’une autre souris EAE qui a des déficits moteurs moins graves.

La souris EAE marche sur la pointe des pieds avec un mouvement réduit au niveau de l’articulation de la cheville. Cela donne à la souris une démarche inégale. Voici des exemples de comportements qui vont composer l’analyse.

Les enregistrements, y compris ces comportements, ne doivent pas être utilisés. Le retard se produit lorsque la souris s’arrête de marcher et se déplace vers l’arrière du tapis roulant, puis reprend la marche. Cela peut se produire chez n’importe quelle souris, mais se produira plus fréquemment à des vitesses inférieures.

Le cabrage se produit lorsque la souris déplace son poids sur son dos, ses membres postérieurs et lève la tête et le haut de son corps. Ce comportement est courant chez les souris anxieuses. Voici des exemples de mauvais éclairage qui entraîneront des problèmes d’analyse de la position des marqueurs dans le temps et l’espace.

Si l’éclairage est trop faible, les marqueurs peuvent ne pas refléter suffisamment de lumière pour être reconnus par le logiciel informatique. Dans cette vidéo, les marqueurs d’orteils ne sont pas facilement visibles en raison d’un éclairage insuffisant. Si l’éclairage est trop lumineux, les objets autres que les marqueurs peuvent réfléchir trop de lumière et être reconnus comme un marqueur.

Dans cette vidéo, les marqueurs d’orteils semblent fusionner avec les parties réfléchissantes du tapis roulant. Les données des marqueurs réfléchissants sur les souris qui marchent peuvent être utilisées pour créer des modèles de bâton de la patte à partir desquels des paramètres cinématiques peuvent être extraits. Il s’agit d’un enregistrement d’une souris marchant avec un modèle de bâton de la patte superposée.

Notez que dans cette vidéo, il y a un sixième marqueur sur le genou, ce qui n’est pas nécessaire car l’emplacement du genou peut être triangulé à partir des positions des articulations de la hanche et de la cheville, et des longueurs mesurées du fémur et du tibia. Étant donné que les marqueurs sur l’articulation du genou sont souvent imprécis en raison du glissement de la peau, la triangulation est la méthode préférée. Le cycle de pas d’une souris peut être divisé en deux phases principales.

La phase d’appui et la phase d’oscillation. Ce diagramme en bâton peut être utilisé pour illustrer qualitativement le mouvement du membre postérieur dans le temps et l’espace. Par exemple, il pourrait s’agir d’évaluer le mouvement du membre postérieur à différents moments de l’étude.

Cet exemple montre que la patte arrière est comprimée pendant la phase d’appui, indiquant que la souris a du mal à supporter son poids corporel. Cela se traduit par une flexion accrue des articulations du genou et de la cheville. À la fin de la période, cela s’est partiellement rétabli.

Cette vidéo illustre la relation entre le comportement de marche et les angles articulaires au fil du temps. Les formes d’onde de l’angle de la hanche, du genou et de la cheville peuvent être extraites de chaque enregistrement. Les angles d’articulation peuvent ensuite être moyennés sur huit à 12 cycles de pas consécutifs, ce qui donne un cycle de pas moyen qui peut être utilisé pour une analyse plus approfondie.

Ce graphique représente une forme d’onde d’articulation du genou faisant la moyenne de 10 cycles de pas consécutifs. Les données ont été normalisées, de sorte que la longueur des phases d’appui et d’oscillation est respectivement de 100 images. L’arrière-plan clair représente la phase d’oscillation et l’arrière-plan vert représente la phase d’appui.

Pour cette souris, le comportement de marche d’une semaine à l’autre était très cohérent et les formes d’onde du cycle de pas de chaque semaine se chevauchaient considérablement. Cependant, il peut également y avoir une variabilité substantielle de la démarche chez les souris en bonne santé, comme le montre ce graphique. Le degré de variabilité montré ici est acceptable et dans la gamme de ce que l’on pourrait attendre d’une souris.

Ce graphique représente le cycle de pas du genou de la souris EAE enregistré sur trois semaines consécutives. Il y a un léger changement dans la forme du cycle de pas à la deuxième semaine et une déviation substantielle à la troisième semaine, où le genou de la souris est beaucoup plus fléchi et ne s’étend pas pendant la marche. De nombreux paramètres peuvent être mesurés à l’aide de cette technique.

Nous en décrirons brièvement trois. L’angle moyen est obtenu en faisant la moyenne de tous les angles tout au long du cycle de pas normalisé. Dans ce cas, l’angle moyen diminue tout au long de l’étude, ce qui suggère que les souris n’étendent pas leurs genoux autant que d’habitude.

L’amplitude du mouvement est obtenue en soustrayant le plus petit angle du plus grand angle dans le cycle de pas normalisé. Ce paramètre peut vous donner un aperçu de la flexibilité, de la rigidité ou de la faiblesse des articulations. Dans cet exemple, l’amplitude de mouvement du genou diminue tout au long de l’étude, ce qui indique que les souris ne sont pas capables de bouger leur genou normalement, peut-être en raison d’une faiblesse musculaire.

La différence quadratique moyenne est une méthode utilisée pour mesurer l’écart des formes d’onde du cycle pas à pas par rapport à l’enregistrement de base. Ce paramètre vous indique l’écart par rapport à l’enregistrement initial. L’analyse cinématique de la marche est une technique précieuse qui peut être utilisée pour détecter et décrire avec sensibilité les changements de démarche.

L’application de l’analyse cinématique de la marche aux études EAE peut être un outil précieux pour comprendre les conséquences fonctionnelles de la pathologie de la moelle épinière dans ce modèle. Cela pourrait faciliter la découverte de nouveaux traitements pour la sclérose en plaques. De plus, l’analyse cinématique de la marche n’est pas limitée au contexte de l’EAE.

Cette technique a déjà été utilisée dans des modèles murins atteints de lésions de la moelle épinière, de sclérose latérale amyotrophique, de la maladie de Huntington et d’accidents vasculaires cérébraux, et peut être appliquée à d’autres modèles murins atteints de troubles neurologiques, y compris la maladie de Parkinson.