Criblage de nanoparticules bioactives dans des cellules immunitaires phagocytaires pour les inhibiteurs de la signalisation des récepteurs de type péage

L’objectif global de cette procédure de criblage est d’identifier de nouvelles nanoparticules bioactives capables d’inhiber la signalisation des récepteurs de type Toll. Cette méthode peut vous aider à identifier physiquement de nouveaux nanoinhibiteurs ciblant la signalisation des récepteurs de type Toll dans les cellules immunitaires innées. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide, robuste et facile à réaliser à l’aide de systèmes de cellules rapporteures.

Les applications de cette technique s’étendent au traitement de nombreuses maladies inflammatoires, car la signalisation des récepteurs de type Toll est impliquée dans la pathogenèse de ces maladies. Bien que cette méthode puisse fournir un criblage élevé sur et les nanoparticules d’or, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes de nanoparticules ainsi qu’aux petites molécules thérapeutiques et aux biologies. Pour commencer cette procédure, préparez les milieux de culture comme indiqué dans le protocole de texte.

Ensuite, ajoutez 100 millilitres d’eau ultra-pure sans endotoxines dans une fiole en verre propre de 125 millilitres. Ajoutez un sachet de poudre de substrat de phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée et faites tourner doucement la solution jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure pour assurer la dissolution complète des substrats.

À l’aide d’une membrane de 0,2 micromètre, filtrez la solution. Conserver à quatre degrés Celsius jusqu’au moment de l’utiliser. Ensuite, ajoutez un sachet de poudre de substrat de luciférase dans un tube à centrifuger de 50 millilitres contenant 25 millilitres d’eau ultra pure sans endotoxines.

Une fois la poudre complètement dissoute, conservez-la à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine jusqu’au moment de l’utiliser. Ensuite, préparez les solutions mères de tous les autres réactifs comme indiqué dans le protocole de texte. Après la culture et la préparation des cellules, transférez-les du ballon de culture dans un tube à centrifuger.

Faites tourner les cellules à 300 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, mettez-les en suspension dans le milieu R-10 à une concentration de 1 X 10 à 6 cellules par millilitre. Ajouter des aliquotes de la solution de PMA à la suspension cellulaire de sorte que la concentration finale soit de 50 nanogrammes par millilitre.

Versez la suspension cellulaire dans un réservoir de réactif stérile. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 100 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture à fond plat de 96 puits. Incuber dans un incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures à 37 degrés Celsius.

Après cela, utilisez un aspirateur pour retirer soigneusement le milieu de culture. À l’aide d’un microscope inversé, vérifiez les cellules pour vous assurer que les macrophages dérivés adhèrent au fond du puits. Lavez doucement les cellules deux fois avec 100 microlitres de PBS par puits pour chaque lavage.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu frais R-10 dans chaque puits. Laissez les cellules reposer pendant deux jours dans un incubateur à 37 degrés Celsius avant d’effectuer le test rapporteur. Tout d’abord, déterminez la dose optimale de LPS comme indiqué dans le protocole textuel.

Ensuite, ajoutez 180 microlitres de solution Quanti-Blue préchauffée à chaque puits d’une nouvelle plaque à fond plat de 96 puits. Ensuite, transférez 20 microlitres de surnageant de chaque échantillon dans la plaque. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures pour permettre à la couleur de se développer du rose au bleu foncé.

Une fois que la densité optique est supérieure à un, utilisez un lecteur de plaques pour déterminer l’absorption à 655 nanomètres. Pour commencer l’analyse de l’activation de l’IRF, transférez 10 microlitres de surnageant frais de chaque échantillon dans une plaque blanche fraîche à fond plat transparent de 96 puits. À l’aide de l’auto-injection, ajoutez 50 microlitres de la solution de luciférase dans chaque puits.

Ensuite, collectez immédiatement la luminescence puits par puits pour produire une courbe dose-réponse afin de déterminer la concentration optimale de LPS pour le criblage de nanoparticules. Ensuite, centrifugez 20 volumes de la solution hybride peptide-GMP dans des tubes Eppendorf de 1,5 millilitre à 18 000 fois G pendant 30 minutes. Jetez soigneusement les surnageants.

Transférez les hybrides dans un seul tube frais et lavez-les deux fois avec un millilitre de PBS. Après cela, remettez en suspension les hybrides lavés dans un volume de milieu R-10. Mélanger des volumes égaux d’hybrides concentrés et de milieu contenant du R-10 de sorte que la concentration finale des hybrides et du LPS soit de 100 nanomolaires et de 10 nanogrammes par millilitre, respectivement.

Ensuite, retirez le milieu de culture de la plaque de culture de macrophages. Ajoutez 100 microlitres du mélange hybride LPS dans chaque puits, avec trois répétitions pour chaque condition. Inclure un contrôle négatif et un contrôle LPS.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, transférez le milieu de chaque puits dans un tube de centrifugation séparé. Centrifugez les tubes à 18 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.

Transférez les surnageants dans une plaque à fond rond fraîche à 96 puits. Pour commencer l’analyse du rapporteur sur ces échantillons, ajoutez 180 microlitres de solution Quanti-Blue préchauffée à chaque puits d’une nouvelle plaque à fond plat de 96 puits. Ensuite, transférez 20 microlitres de surnageants de chaque échantillon dans cette plaque.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures jusqu’à ce que la couleur bleu foncé atteigne une densité optique supérieure à un. Après cela, utilisez un lecteur de plaques pour enregistrer l’absorption à 655 nanomètres. Ensuite, transférez 10 microlitres de surnageant frais de chaque échantillon dans une plaque blanche transparente à fond plat de 96 puits.

À l’aide d’un injecteur automatique, ajoutez 50 microlitres de solution de luciférase dans chaque puits et enregistrez immédiatement la luminescence puits par puits. Ensuite, validez l’effet inhibiteur des candidats potentiels et évaluez la spécificité du TLR comme indiqué dans le protocole texte. Dans cette étude, l’activation de NF-Kappa B AP1 est détectée par le dosage colorimétrique SEAP, dans lequel l’activation de TLR-4 par LPS entraîne l’activation de NF-Kappa B AP1 et la production de SEAP.

Le PAED libéré convertit le substrat, ce qui entraîne un changement de couleur proportionnel à la quantité de PAED libérée lors de la stimulation. Ceci est quantifié en mesurant l’absorbance à 655 nanomètres. Ensuite, l’activation de l’IRF par le LPS a conduit à l’expression de la luciférase, catalysant le substrat pour produire de la luminescence.

Une concentration optimale de LPS de 10 nanogrammes par millilitre est déterminée à partir de ces doses-réponses pour cribler une bibliothèque préalablement établie d’hybrides peptide-GMP. À partir de là, un groupe d’hybrides est identifié pour leur puissante capacité à inhiber l’activation déclenchée par le LPS pour NF-Kappa B AP1 et IRF. La validation de cette activité inhibitrice montre que plus la concentration de LPS augmente, plus les effets inhibiteurs de l’hybride diminuent, comme prévu.

Un immunotransfert est ensuite effectué pour confirmer l’activité d’inhibition. On voit que l’hybride de plomb réduit la phosphorylation de p65, inhibe la dégradation alpha d’I-Kappa B et retarde la phosphorylation d’IRF3, confirmant que l’hybride de plomb, P12, est capable d’inhiber la signalisation TLR-4 médiée par LPS. Des recherches supplémentaires révèlent que P12 réduit également la signalisation NF-Kappa B AP1 médiée par TLR-2 et TLR-5, ainsi que l’activation de l’IRF médiée par TLR-3, ce qui suggère que P12 a une activité inhibitrice puissante sur plusieurs voies TLR.

À la suite de cette procédure, d’autres mesures telles que l’immunoblot et le test de cytotoxicité doivent être effectuées afin de valider les résultats du dépistage et d’éviter la découverte de faux positifs. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à d’autres chercheurs dans le domaine de la nanomédecine pour explorer les nanoinhibiteurs dans la signalisation des récepteurs de type Toll en tant que thérapies informatives de nouvelle génération.