Un système hybride de levure modifié pour les études d'interaction complexe-ADN de protéines hétérogènes

L'essai à un hybride de levure modifié décrit ici est une extension de l'essai à base d'hybride (Y1H) de levure classique pour étudier et valider l'interaction de l'ADN-complexe hétérologue-ADN dans un système hétérologue pour toute étude de la génomique fonctionnelle.

L’objectif global de cette expérience est d’étudier et de valider l’interaction entre le complexe protéique hétéromère et l’ADN dans un système hétérologue pour toute étude génomique fonctionnelle dans un cadre de laboratoire régulier. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génomique fonctionnelle, comme la génomique planifiée. Le principal avantage de cette technique est qu’elle détecte les interactions entre l’ADN d’une protéine et plus d’un facteur de transcription.

Commencez cette procédure l’après-midi de ce qui sera désigné comme le premier jour. Commencer une culture de 5 millilitres dans un milieu synthétique défini ou SD sans uracile à partir d’une boîte de Pétri fraîchement striée. Incuber toute la nuit dans un agitateur à 30 degrés Celsius.

L’après-midi suivant, inoculez 10 millilitres de milieu YPDA avec 500 microlitres de culture de nuit et incubez toute la nuit dans un agitateur à 30 degrés Celsius. Tôt le matin du lendemain, inoculez 100 millilitres de milieu YPDA avec 2 millilitres de culture de nuit. Cultivez cette culture fraîche à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que la densité optique, à 600 nanomètres, atteigne 0,4 à 0,8.

Centrifuger à 1000 fois G et 21 degrés Celsius pendant 5 minutes. Jetez le surnageant. Ajouter 10 millilitres d’eau stérile et reconstituer la pastille par vortex.

Centrifugeuse à 1000 fois G et 21 degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le surnageant, ajoutez 2 millilitres d’acétate de lithium TE et reconstituez la pastille par vortexage. Centrifugeuse à 1000 fois G et 21 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Jetez le surnageant. Ajoutez 4 millilitres d’acétate de lithium TE et 400 microlitres d’ADN de sperme de saumon et remettez la pastille en suspension en pipetant de haut en bas. Les cellules sont maintenant prêtes pour la transformation, comme le montre le segment suivant.

La co-transformation des cellules est effectuée dans une plaque de mélange à fond en U de 96 puits. Tout d’abord, répartissez 20 microlitres de cellules compétentes par puits dans la plaque de 96 puits. Ensuite, ajoutez aux puits 150 nanogrammes chacun des deux plasmides et le contrôle de normalisation.

Ce schéma montre la plaque générale mise en place pour la co-transformation des cellules de levure avec la protéine d’intérêt. La configuration de la plaque peut être modifiée en fonction des besoins de l’expérience et du nombre de régions ou de fragments d’ADN testés. Ajouter 100 microlitres de polyéthylène glycol d’acétate de lithium TE par puits et mélanger trois fois par pipetage.

Couvrez l’assiette d’un joint respirant et incubez à 30 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Choc thermique à 42 degrés Celsius pendant précisément 20 minutes. Après le choc thermique, centrifugez à 1000 fois G et 21 degrés Celsius pendant 5 minutes.

Utilisez une pipette multicanaux pour retirer le surnageant. Ajouter 110 microlitres de TE et mélanger. Centrifugez à nouveau pendant 5 minutes.

Retirez 100 microlitres de surnageant de chaque puits. Plongez un puncheur dans de l’éthanol à 100 %, brûlez-le, attendez une minute que les goupilles du perforateur refroidissent, puis utilisez le puncheur stérile pour remettre la pastille en suspension. Transférez les cellules sur des plaques de tarière de dérivation du tryptophane SD et de la lucine.

Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant deux jours. Dans l’après-midi du cinquième jour, récupérez les plaques de la vis sans fin de l’incubateur. Remplissez chaque puits de la plaque de mélange stérile à fond en U de 96 puits avec 50 microlitres de TE. Prémouillez un puncheur stérile dans TE, poinçonnez les colonies à partir de la plaque de chute du tryptophane SD et de la lucine, et remettez-les en suspension dans la plaque remplie de TE.

Transférez les colonies sur de nouvelles plaques de tarière de tryptophane SD et de lucine, pour une couverture de surface optimale. Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant 2 jours. Dans l’après-midi du jour 7, récupérez les plaques de la vis sans fin de l’incubateur.

Remplissez chaque puits d’une plaque de mélange stérile à fond en U de 96 puits avec 50 microlitres de tryptophane SD et de milieu de chute de lucine. Remplissez chaque puits d’un bloc stérile de 96 puits profonds avec 180 microlitres de tryptophane SD et de milieu de chute de lucine. Stérilisez le puncheur, prémouillez le puncheur et le milieu, et transférez les colonies de la plaque vers les puits qui contiennent chacun 50 microlitres de milieu.

Transférez 20 microlitres de levure dans les 180 microlitres de tryptophane SD et de milieu de chute de lucine. Scellez le bloc avec un joint respirant et incubez à 30 degrés Celsius en secouant pendant 36 heures. Le matin du neuvième jour, transférez 100 microlitres de culture dans 500 microlitres de milieu YPDA dans un bloc de 96 puits profonds stérilisés.

Couvrir d’un joint respirant et incuber à 30 degrés Celsius avec agitation à 200 tr/min pendant trois à cinq heures. Après trois à cinq heures, remettez la culture en suspension et transférez 125 microlitres de chaque puits sur une plaque de spectrophotomètre. Mesurez la densité optique à 600 nanomètres pour vous assurer qu’elle est comprise entre 0,3 et 0,6.

Centrifugez les cellules restantes dans le bloc de puits profond à 3000 fois G et 21 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez le surnageant en l’inversant. Ajoutez 200 microlitres de tampon Z dans chaque puits et vortex.

Centrifuger à 3000 G et 21 degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez le surnageant en l’inversant. Ajoutez 21 microlitres de tampon Z dans chaque puits et vortex.

Recouvrez la plaque d’une feuille d’étanchéité résistante aux cycles de gel-dégel. Dans une hotte, effectuez 4 cycles de congélation/décongélation à l’aide d’azote liquide et d’un bain-marie à 42 degrés Celsius. Ajoutez 200 microlitres de solution ONPG de bêta-mercaptoéthanol Z buffer fraîchement préparée dans chaque puits.

Incuber à 30 degrés Celsius pendant 17 à 24 heures ou jusqu’à ce que la couleur se développe. Le matin du jour 10, vérifiez que la couleur s’est développée. Ajoutez 110 microlitres d’une molaire de carbonate de sodium dans chaque puits pour arrêter la réaction.

Notez l’heure et faites tourbillonner la plaque. Centrifuger à 3000 fois G et 21 degrés Celsius pendant dix minutes. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 125 microlitres de surnageant de chaque puits vers une plaque de spectrophotomètre.

Mesurez la densité optique à 420 nanomètres. Calculez l’activité de la bêta-galactosidase dans une feuille de calcul comme décrit dans le protocole texte. Dans cette étude, la région promotrice de 2600 paires de bases en amont du début du site de début de transcription a été segmentée en six régions ou fragments.

Cette photo est un exemple d’une plaque bien développée et positive après le cinquième jour du protocole. Dans ce résultat représentatif, les fragments d’ADN un et quatre montrent une interaction positive avec les complexes protéiques A et B. Lors de la mesure de l’activité de la bêta-golactisidase, le premier fragment montre une induction quadruple de l’activité du gène rapporteur.

Il est important de se rappeler que cette procédure n’est recommandée pour obtenir des informations sur les régions de l’ADN qu’après la confirmation de l’interaction protéique proposée et n’est pas conçue pour fournir des informations sur les sites cibles. Suite à ces procédures, d’autres méthodes, telles que l’essai de copeaux et Msar, peuvent être utilisées afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, identifier les sites cibles in vivo.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de tester et de valider le rôle des complexes protéiques multimériques se liant à une cible d’ADN commune.