Un système hybride de levure modifié pour les études d'interaction complexe-ADN de protéines hétérogènes

L'objectif général de cette expérience est d'étudier et de valider l'interaction entre un complexe protéique hétéromérique et l'ADN dans un système hétérologue, dans le cadre de toute étude en génomique fonctionnelle réalisée en conditions de laboratoire courantes. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la génomique fonctionnelle, telles que la génomique planifiée. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à détecter les interactions protéine-ADN impliquant plus d'une protéine ou facteur de transcription.

Commencez cette procédure l'après-midi du jour qui sera désigné comme jour un. Démarrez une culture de 5 millilitres dans un milieu synthétique défini ou milieu SD sans uracile à partir d'une boîte de Pétri fraîchement striée. Incubez toute la nuit dans un agitateur à 30 degrés Celsius.

Le lendemain après-midi, inoculer 10 millilitres de milieu YPDA avec 500 microlitres de la culture de nuit et incuber toute la nuit dans un agitateur à 30 degrés Celsius. Tôt le matin du jour suivant, inoculer 100 millilitres de milieu YPDA avec 2 millilitres de la culture de nuit. Faire croître cette culture fraîche à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne une valeur comprise entre 0,4 et 0,8.

Centrifuger à 1000 × g et à 21 degrés Celsius pendant 5 minutes. Éliminer le surnageant. Ajouter 10 millilitres d'eau stérile et reconstituer le culot par vortexage.

Centrifuger à 1000 fois G et à 21 degrés Celsius pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant, ajouter 2 millilitres d'acétate de lithium TE et reconstituer le culot par vortexage. Centrifuger à 1000 fois G et à 21 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Jetez le surnageant. Ajoutez 4 millilitres de TE acétate de lithium contenant 400 microlitres d'ADN de sperme de saumon et remettez en suspension le culot par aspiration et expulsion répétées à l’aide d’une pipette. Les cellules sont désormais prêtes à être transformées, comme illustré dans le prochain segment.

La co-transformation des cellules est réalisée dans une plaque de mélange en U à 96 puits. Répartissez d'abord 20 microlitres de cellules compétentes par puits dans la plaque à 96 puits. Ajoutez ensuite dans les puits 150 nanogrammes de chacun des deux plasmides ainsi que du contrôle de normalisation.

Ce schéma illustre la configuration générale de la plaque pour la co-transformation des cellules de levure avec la protéine d'intérêt. La configuration de la plaque peut être modifiée selon les besoins de l'expérience et le nombre de régions ou fragments d'ADN testés. Ajoutez 100 microlitres de TE acétate de lithium polyéthylène glycol par puits et mélangez trois fois par pipetage.

Couvrez la plaque avec un scellé perméable et incubez à 30 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Effectuez un choc thermique à 42 degrés Celsius pendant exactement 20 minutes. Après le choc thermique, centrifugez à 1000 ×g et à 21 degrés Celsius pendant 5 minutes.

Utilisez une pipette multicanal pour éliminer le surnageant. Ajoutez 110 microlitres de tampon TE et mélangez. Effectuez une nouvelle centrifugation pendant 5 minutes.

Retirer 100 microlitres du surnageant de chaque puits. Plonger un poinçon dans de l'éthanol à 100 %, le flamber, attendre une minute que les broches du poinçon refroidissent, puis utiliser le poinçon stérile pour resuspendre le culot. Transférer les cellules sur des boîtes de gélose SD privées de tryptophane et de leucine.

Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant deux jours. L'après-midi du cinquième jour, retirer les plaques à tige filetée de l'incubateur. Remplir chaque puits de la plaque de mélange stérile en 96 puits avec 50 microlitres de TE. Pré-humidifier un perforateur stérile dans du TE, prélever les colonies à partir de la plaque de sélection sans tryptophane et sans leucine en SD, puis les resuspendre dans la plaque remplie de TE.

Transférez les colonies sur de nouvelles plaques SD sans tryptophane et sans leucine, en veillant à une couverture optimale de la surface. Incubez les plaques à 30 degrés Celsius pendant 2 jours. L'après-midi du jour 7, récupérez les plaques SD sans tryptophane et sans leucine de l'incubateur.

Remplir chaque puits d'une plaque de mélange stérile à 96 puits en U avec 50 microlitres de milieu SD privé de tryptophane et de leucine. Remplir chaque puits d'un bloc profond stérile à 96 puits avec 180 microlitres de milieu SD privé de tryptophane et de leucine. Stériliser le puncher, pré-humidifier le puncher et le milieu, puis transférer les colonies depuis la plaque vers les puits contenant chacun 50 microlitres de milieu.

Transférez 20 microlitres de levure dans 180 microlitres de milieu SD privé de tryptophane et de leucine. Scellez la plaque avec un scellage perméable à l'air et incubez à 30 degrés Celsius sous agitation pendant 36 heures. Le matin du neuvième jour, transférez 100 microlitres de culture dans 500 microlitres de milieu YPDA dans une plaque 96 puits profonds stérilisée.

Couvrir avec un sceau perméable à l'air et incuber à 30 degrés Celsius avec agitation à 200 tr/min pendant trois à cinq heures. Après trois à cinq heures, resuspendre la culture et transférer 125 microlitres de chaque puits dans une plaque de spectrophotomètre. Mesurer la densité optique à 600 nanomètres pour s'assurer qu'elle se situe entre 0,3 et 0,6.

Centrifuger les cellules restantes dans la plaque à puits profonds à 3000 × g et à 21 °C pendant 10 minutes. Éliminer le surnageant par retournement. Ajouter 200 µL de tampon Z dans chaque puits et vortexer.

Centrifuger à 3000 ×g et à 21 degrés Celsius pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant par retournement. Ajouter 21 microlitres de tampon Z dans chaque puits et vortexer.

Couvrez la plaque avec du film d'étanchéité résistant aux cycles de congélation-décongélation. Dans une hotte, effectuez 4 cycles de congélation-décongélation à l'aide d'azote liquide et d'un bain d'eau à 42 degrés Celsius. Ajoutez 200 microlitres de solution fraîchement préparée de tampon Z contenant du bêta-mercaptoéthanol et du ONPG dans chaque puits.

Incuber à 30 degrés Celsius pendant 17 à 24 heures ou jusqu'à l'apparition de la couleur. Le matin du jour 10, vérifier que la couleur est apparue. Ajouter 110 microlitres de carbonate de sodium un molaire à chaque puits pour arrêter la réaction.

Enregistrez l'heure et vortexez la plaque. Faites centrifuger à 3000 × g et à 21 degrés Celsius pendant dix minutes. Utilisez une pipette multicanal pour transférer 125 microlitres de surnageant de chaque puits vers une plaque de spectrophotomètre.

Mesurez la densité optique à 420 nanomètres. Calculez l'activité de la bêta-galactosidase dans une feuille de calcul comme décrit dans le protocole textuel. Dans cette étude, la région promotrice de 2600 paires de bases en amont du début du site de démarrage de la transcription a été divisée en six régions ou fragments.

Cette photo illustre un exemple de plaque bien développée et positive après cinq jours de protocole. Dans ce résultat représentatif, les fragments d'ADN un et quatre montrent une interaction positive avec le complexe des protéines A et B. Après mesure de l'activité bêta-galactosidase, le fragment un présente une induction quadruple de l'activité du gène rapporteur.

Il est important de rappeler que cette procédure est recommandée pour obtenir des informations sur les régions d'ADN uniquement après la confirmation de l'interaction protéine-protéine proposée et n'est pas conçue pour fournir des informations sur les sites cibles. Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, telles que le test chip et le Msar, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, identifier les sites cibles in vivo.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de tester et de valider le rôle de complexes protéiques multimériques se liant à une cible d'ADN commune.