Name: Optimisé méthode LC-MS/MS pour l’analyse de haut débit d’échantillons cliniques de Ivacaftor, ses principaux métabolites et Lumacaftor dans les fluides biologiques des patients atteints de fibrose kystique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Découvrez une méthode HPLC-MS optimisée pour l'analyse simultanée d'ivacaftor, de ses métabolites et de lumacaftor dans les fluides biologiques de patients atteints de mucoviscidose. Cette technique permet un suivi thérapeutique rapide et sensible.

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J.L. et T.V. sont pris en charge par le National Institute of Allergy et maladies infectieuses (NIAID) de la National Institutes of Health (R01 AI111965). Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de l’Institut National des allergies et maladies infectieuses ou les National Institutes of Health. MC est un chercheur australien NHMRC Principal. J. L. est un Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Research Fellow et T.V. est un australien NHMRC industrie carrière développement niveau 2 Research Fellow. E.K.S est un nommé 2017 jeune Ambassadeur pour ASM (American Society for Microbiology) et est supporté par l’Australian Postgraduate Award. Certaines parties de ce travail a été présenté à la 12ème Conférence d’Australiasien sur la fibrose kystique à Melbourne (5-8ème d’août 2017).

approbation de l’éthique a été obtenue de la Monash University humaine Comité recherche pour l’éthique (MUHREC).
 1. application du test : prélèvement d’échantillons de Patient <ol><li>enregistrer le moment où le patient prend leur dose standard de 150 mg ivacaftor ou ivacaftor 125 mg /lumacaftor 200 mg.</li>
	<li>Note vers le bas l’heure exacte lorsque l’échantillon de sang de patients est collecté. 
	Remarque : Nous recommandons le prélèvement d’échantillons de 4-5 sur un parcours de temps de 24h. Si le prélèvement d’un seul échantillon est possible, le point de l’heure indiquée est 2,5 à 4 h post ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor combinaison de dosage comme C max des concentrations à l’équilibre seront obtenues après &#62; 5 jours de traitement consécutif.</li>
	<li>Recueillir 4 à 5 mL de sang dans des tubes bleus non traités commercialement disponibles.</li>
	<li>Après le prélèvement du sang entier, permettre au sang de coaguler en le laissant intact à température ambiante. 
	Remarque : Cela prend habituellement 15 à 30 min.</li>
	<li>Retirer le caillot par centrifugation à 1 000-2 000 x g pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse réfrigérée. Désigner le surnageant qui en résulte comme plasma.</li>
	<li>Après la centrifugation, transférer immédiatement le surnageant (plasma) dans un tube en polypropylène nettoyer à l’aide d’une pipette Pasteur. Étiquette le plasma tube avec l’ID du Patient (p. ex., 1 Patient), le médicament administré (par exemple, combinaison ivacaftor-lumacaftor) et le temps de l’échantillon du patient a été collectées (par exemple, dosage après 2,5 h).</li>
	<li>Échantillons de conserver entre 2 et 8 ° C pendant la manipulation. Une fois que le traitement est achevé, conserver les échantillons à &#8211; 20 ° C.</li>
	<li>Si nécessaire, expédier les échantillons avec un coursier agréé à l’Institut analyse. 
	NOTE : Les échantillons doivent être expédiés sur la glace sèche jusqu'à l’arrivée et doivent être maintenus au &#8211; 80° C jusqu'à l’analyse.</li>
</ol> 2. Préparation et traitement des échantillons engagés et normes Remarque : Plasma provenant de donneurs sains naïfs au traitement ivacaftor/lumacaftor a été obtenue de la Croix Rouge australienne. Afin d’assurer l’intégrité, tous les échantillons/normes doit être entre 2 et 8 ° C au cours de la collecte et le traitement. Une fois que le traitement est achevé, conserver les échantillons à &#8211; 20 ° C.
<ol><li>Peser IVA IVA-carboxylate, hydroxyméthyl-IVA et LUMA qui servira de référence pour les étalons internes.</li>
	<li>Préparer les deux solutions indépendantes de chaque analyte (IVA, M1, M6 et luminance) dans le méthanol de qualité LC-MS à 100 µg/mL et à 10 µg/mL. 
	Remarque : Composés expirera au bout de 10 jours sur la paillasse.</li>
	<li>Fraîchement préparer les étalons SM-avant chaque série d’analyses par dilution des normes d’étalonnage solutions dans le plasma humain pour atteindre à la suite des concentrations : 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1.0, 2,5, 5,0 et 10,0 µg/mL. Ces échantillons sont appelées normes.</li>
	<li>à précipiter les protéines, préparer l’acide formique 0,1 % (FA) dans l’acétonitrile (ACN, SM-grade) et laisser au réfrigérateur jusqu'à ce que nécessaire.</li>
</ol> 3. Prétraitement des échantillons exposés et des normes <ol><li>laisser les deux échantillons de plasma patient et vierge s’équilibrer à température ambiante.</li>
	<li>Vortex à mélanger chaque échantillon de plasma pour 15 s par exemple.</li>
	<li>Transfert d’une quantité de 100 µL de soit plasma Vierge des normes ou des échantillons de patients pour l’analyse dans un tube de microcentrifuge polypropylène de 1,5 mL.</li>
	<li>Ajouter l’IVA standard interne dans chacun des tubes standards (p. ex., 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1.0, 2,5, 5,0 et 10,0 µg/mL pour couvrir la gamme de concentration possibles), fermer le couvercle et vortexer pendant 2-3 s. Note l’étalon interne est uniquement ajouté au plasma vide et aucun étalon interne n’est ajouté dans les échantillons de patients.</li>
	<li>Répéter l’étape 3.4. pour les autres normes internes M1, M6 et LUMA.</li>
	<li>Spin dans chaque tube brièvement pour s’assurer qu’il n’y a pas des gouttelettes sur le couvercle.</li>
	<li>Ajouter 200 µL du mélange de 0,1 % FA chez ACN dans chaque tube à précipiter les protéines plasmatiques.</li>
	<li>Vortex le mélange vigoureusement pendant environ 15 s.</li>
	<li>Autoriser les tubes au repos pendant 10 min dans le réfrigérateur.</li>
	<li>Centrifuger à 10 000 g pendant 10 min à 4 ° C, si possible.</li>
	<li>Filtrer une quantité de 200 µL du liquide surnageant à travers un filtre de seringue de 13 mm dans un flacon HPLC de 1,5 mL.</li>
	<li>Transférer 100 µL de surnageant dans le flacon de LC-MS pour l’analyse HPLC-MS.</li>
</ol> 4. L’analyse HPLC-MS Remarque : HPLC-MS l’analyse a été effectuée sur un système de SM-couplé avec le spectromètre de masse quadripolaire triple (tableau 1).
<ol><li>Tourner sur le système LC-MS, placez le plateau avec les échantillons à l’échantillonneur automatique.</li>
	<li>Fixer la colonne sur une colonne de garde et de se connecter au système LC-MS.</li>
	<li>Fixer les deux bouteilles de phases mobiles (bouteille A: 100 % ACN ; bouteille b : 0,1 % d’acide formique dans l’eau) et équilibrer le système LC-MS.</li>
	<li>Intégrer les paramètres suivants dans le protocole LC-MS.
	<ol><li>Diviser le débit de la phase mobile avant d’entrer dans le spectromètre de masse dans un rapport 2:1 (déchets : MS inlet).</li>
		<li>Effectuer une élution gradient à un débit de 0,5 mL/min en utilisant une phase mobile composé de 100 % ACN et 0,1 % d’acide formique dans l’eau (départ à 40 : 60, v/v). Notez que le pourcentage de volume de la phase mobile change tout au long de l’analyse.</li>
		<li>Exploiter le spectromètre de masse en mode d’ionisation électrospray positif.</li>
		<li>S’assurer que les paramètres de la LC-MS sont les suivants : tension de pulvérisation ionique 4.5 kV, énergie de collision 295,9 V, nébulisation gaz : azote à 3 L/min ; gaz de collision : argon ; séchage gaz débit 20 L/min, tension Q3 de l’objectif :-22 V, désolvatation température 250 ° C avec un bloc chauffant température de 400 ° C.</li>
		<li>Volume µL injecter 10 par exemple.</li>
		<li>Analytes de détecter à l’aide de plusieurs réaction surveillance (MRM). Surveiller les transitions de l’ion m/z 392.49 &#8594; 393, m/z 408.49 &#8594; 409, m/z 422.47 &#8594; 423 et m/z 452.40 &#8594; 453 pour IVA, IVA-M1, IVA-M6 et LUMA, respectivement. 
		Remarque : La méthode nouvellement optimisée doit encore être entièrement validée selon les normes FDA.</li>
	</ol></li></ol> 5. Courbes d’étalonnage <ol><li>Construct la SM-courbes de calibration avant chaque série d’analyses à l’aide de la relation entre les ratios de surface de pic de chacune des quatre analytes à étalon interne et les concentrations nominales standard de calibration de ivacaftor (IVA-M1, IVA-M6 ou LUMA) au sein du programme de réglages de LC-MS. 
	Remarque : Les étapes exactes pour la construction de la courbe d’étalonnage est dépendante sur le modèle du SM-matériel utilisé. Cette information peut être disponible dans le manuel de l’équipement.</li>
	<li>Effectuer une analyse de régression linéaire des moindres carrés en pondérant 2 selon la réciproque des concentrations de.</li>
</ol>

<ol><li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-drug+plasma+protein+binding+interactions+of+ivacaftor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor.</a> J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).</li>
<li>Solomon, M., Leatte, P. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolomon%2C+M+%22Treatments+for+Cystic+fibrosis%22">Treatments for Cystic fibrosis</a>. , (2009).</li>
<li>O'Sullivan, B. P., Flume, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+approach+to+lung+disease+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis.</a> Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).</li>
<li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).</li>
<li>Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+N-%282%2C4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl%29-4-oxo-1%2C4-dihydroquinoline-3-carboxamide+%28VX-770%2C+ivacaftor%29%2C+a+potent+and+orally+bioavailable+CFTR+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator.</a> J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).</li>
<li>FDA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22FDA+Advisory+Commitee+Briefing+Material+VERTEX-FDA+Pulmonary-Allergy+drugs+advisory+commitee%22">FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee</a>. 98 , VERTEX Pharmaceuticals Incorporated. (2015).</li>
<li>Holmes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+dawn+for+cystic+fibrosis+disease+modifiers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">False dawn for cystic fibrosis disease modifiers?</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).</li>
<li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+gating+potentiators%2C+including+VX-770%2C+diminish+DeltaF508-CFTR+functional+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>Cholon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiator+ivacaftor+abrogates+pharmacological+correction+of+DeltaF508+CFTR+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>EMA, <a target="_blank" href="http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/003954/human_med_001935.jsp&mid=WC0b01ac058001d124">Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency</a>. , (2015).</li>
<li>VERTEX. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Vertex+prescribing+infomation%22">Vertex prescribing infomation</a>. , (2015).</li>
<li>Matthes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+free+drug+concentration+prevents+inhibition+of+F508del+CFTR+functional+expression+by+the+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor).</a> Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).</li>
<li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+HPLC+and+LC-MS%2FMS+methods+for+the+analysis+of+ivacaftor%2C+its+major+metabolites+and+lumacaftor+in+plasma+and+sputum+of+cystic+fibrosis+patients+treated+with+ORKAMBI+or+KALYDECO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chrom+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO.</a> J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).</li>
<li>Su, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LC-MS%2FMS+method+for+the+quantitation+of+cabozantinib+in+rat+plasma%3A+application+to+a+pharmacokinetic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Comme indiqué précédemment, notre groupe a pour la première fois élaboré et validé une méthode HPLC et LC-MS pour une détection rapide et la quantification de l’ivacaftor et ses principaux métabolites M1 hydroxyméthyl-IVA (active) et IVA-carboxylate M6 (inactif) ; et lumacaftor dans le plasma et les expectorations de CF patients14. Le dosage indiqué par notre groupe précédemment a été utilisé avec succès pour quantifier la concentration de LUMA, IVA, IVA-M1 et IVA-M6 dans le plasma et de crachat d...

Fibrose kystique (FK) est une maladie génétique commune impliquant les glandes exocrines de mucus du poumon, foie, pancréas et les intestins causant la rupture progressive de plusieurs organes, comme une diminution de la fonction pulmonaire et une insuffisance pancréatique1, 2,3. Ivacaftor (IVA) est le premier aliment et Drug Administration (FDA-US) et l’Agence européenne des médicaments (EMA) a approuvé la fibrose kystique membranaires conductance regulator (CFTR) potentialisateur, dont l’efficacité clinique en témoigne, produisant une importante amélioration de la fonction pulmonaire au placebo chez un petit sous-groupe de patients atteints de mucoviscidose portant le G551D-CFTR [glycine (G) en position 551 est remplacé par l’acide aspartique (D)] mutation faux-sens (~ 4 à 5 % de l’effectif des FC)4,5. Cela administré par voie orale drogue augmente le canal CFTR ouvrir, donc augmenter le flux d’ions chlorure et agissant sur le défaut principal qui mène aux manifestations cliniques de CF4,6. Malheureusement, IVA en monothérapie n’est pas efficace chez les patients avec la plus commune mutation homozygote de F508del [dans une délétion du gène CFTR qui entraîne la perte de la phénylalanine (F) en position 508 cadre] qui se traduit par CFTR mal repliée, ce qui est vu dans environ 50 % des le CF population7,8.
Récemment, la FDA a accordé l’homologation permettant de combiner IVA avec le correcteur CFTR drogue lumacaftor. L’habile stratégie de combiner un correcteur CFTR (lumacaftor, LUMA) qui sauve F508del-CFTR à la surface de la cellule avec un modulateur (IVA) qui potentialise l’activité du canal CFTR, étendre efficacement la fenêtre de traitement à la plupart de la population de CF5 . Des questions subsistent sur la question de savoir si ces médicaments seront engage réaliser comme un certain nombre de rapports contradictoires est apparues que jeté le doute sur leur efficacité clinique9,10. En outre, amélioration des fonctions pulmonaires ont été modeste (2,6-4 % seulement pour combinaison ivacaftor-lumacaftor) par rapport aux succès obtenus avec IVA en monothérapie chez les patients ayant une mutation (10,6-12,5 %) de G551D8. Des interactions de médicaments antagonistes entre IVA et LUMA qui limitent potentiellement l’efficacité clinique d’ivacaftor-lumacaftor Association viennent de ses propriétés pharmacocinétiques moins qu’idéales7,11. IVA est fortement métabolisée par les enzymes du cytochrome P450 (CYP), principalement à un métabolite actif hydroxyméthyl-IVA (IVA-M1, M1) et une forme inactive IVA-carboxylate (IVA-M6, M6)7,12. L’inducteur du CYP3A4 LUMA, en revanche, n’est pas métabolisée et est principalement excrétée inchangée dans les fèces11. Comme inducteurs du CYP3A4 induisent le métabolisme du cytochrome, pourraient ramener les concentrations d’ivacaftor (substrat du CYP3A4). En outre, IVA et la luminosité sont des molécules très hydrophobes et sont ~ 99 % liée aux protéines plasmatiques, ce qui limite considérablement le médicament (actif) gratuit concentration1,13.
Collectivement, ces facteurs peuvent venir ensemble pour limiter l’efficacité clinique de la combinaison de l’ivacaftor-lumacaftor. On ne sait pas si les concentrations plasmatiques optimale sont atteints dans la posologie actuelle pour combinaison ivacaftor-lumacaftor, ou si le seuil thérapeutique est maintenu8. Actuellement, il y a un manque d’informations concernant les paramètres pharmacocinétiques tels que le pic et les concentrations plasmatiques de l’état d’équilibre d’ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor. Compte tenu du métabolisme a noté des ivacaftor et lumacaftor, suivi des relations exposition-réponse est nécessaire pour atteindre les posologies optimales pour la thérapie ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor. Notre groupe a récemment publié la première méthode CLHP/SM-pour le suivi des relations exposition-réponse de l’IVA et LUMA14. Aucune des techniques alternatives de mesurer les concentrations d’ivacaftor, de ses métabolites et lumacaftor n’ont été signalés à ce jour. Pour permettre l’analyse de haut débit d’un collectif plus grand de patients et de réduire considérablement les temps d’analyse, notre groupe a optimisé la méthode signalée par l’utilisation d’une colonne de chromatographie en phase inverse de taille pores plus petite et un système de solvants dégradé qui réduit le coût et le temps.

<table><tbody><tr><td>IVA (Cat#S114)&nbsp ;</td><td>SelleckChem (États-Unis).&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LUMA (Cat#S1565)&nbsp ;</td><td>SelleckChem (États-Unis).&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS)&nbsp ;</td><td>Clearsynth (Canada).&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydroxyméthyl-IVA (Cat# 510240849CS)&nbsp ;</td><td>Clearsynth (Canada).&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Méthanol (MeOH, grade LC-MS),&nbsp ;</td><td>Acétonitrile Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(grade ACN, LC-MS)&nbsp ;</td>Acide formique (FA) <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>triple-quadripôle Shimadzu 8030 LC-MS&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex (2,6 & micro ; m C8 100 &Aring ;; 50 & fois ; 2,1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Filtre en ligne HPLC KrudKatcher Ultrea, Filtre de profondeur de 0,5 m x 0,004 po ID).&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation en polypropylène (VWR) de 1,5 mL.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5430</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue de 13 mm (0,45 & micro ; m nylon, GRACE, États-Unis)&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 & micro ; L, septa en PTFE/silicone].&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optimisé méthode lc-ms/ms pour l’analyse de haut débit d’échantillons cliniques de ivacaftor, ses principaux métabolites et lumacaftor dans les fluides biologiques des patients atteints de fibrose kystique

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Défauts dans le régulateur de la conductance membranaires de la fibrose kystique (CFTR) sont la cause de la fibrose kystique (FK), une maladie dont les manifestations pulmonaires mortelles. Ivacaftor (IVA) et combinaison ivacaftor-lumacaftor (luminance) sont deux nouveaux médicaments pour percée CF directement modulent l’activité et le trafic de la protéine CFTR défectueuse. Cependant, il y a toujours un manque de compréhension sur les paramètres pharmacocinétiques/pharmacodynamiques et la pharmacologie des ivacaftor et lumacaftor. La technique HPLC-MS pour l’analyse simultanée des concentrations d’ivacaftor hydroxyméthyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate et lumacaftor dans les liquides biologiques chez les patients recevant la combinaison standard d’ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor la thérapie a été développé par notre groupe et partiellement validé aux normes FDA. Toutefois, pour permettre l’analyse de haut débit d’un grand nombre d’échantillons de patients, notre groupe a optimisé la méthode signalée par l’utilisation d’une colonne de chromatographie en phase inverse de taille pores plus petite (2,6 µm, C8 100 Å ; 50 x 2.1 mm) et un système de solvants dégradé ( 0-1 min : 40 % B ; 1-2 min : 40-70 % B ; 2-2,7 min : tenue à 70 % B ; 2.7-2,8 min : 70-90 % B ; 2.8-lavage de 4,0 min : 90 % de B ; 4.0-4,1 min : 90-40 % B ; 4.1-6.0 min : tenue à 40 % B) au lieu d’une élution isocratique. L’objectif de cette étude était de réduire le temps d’analyse HPLC-MS par exemple spectaculaire de ~ 15 min à seulement 6 min par échantillon, ce qui est essentiel pour l’analyse d’une grande quantité d’échantillons de patients. Ce moyen de communication sera très utile pour les études sur les relations exposition-réponse de ces médicaments de CF révolutionnaires.

Nous avons récemment rapporté une méthode, partiellement validée aux normes FDA, sur un triple-quadripôle LC-MS et d’un système de détecteur CLHP, en utilisant une colonne de C8 (5 µm, i.d. 3,9 x 50 mm) avec la phase mobile, composé de 100 % ACN et 0,1 % d’acide formique dans l’eau (40 : 60 v/v) à un débit de 1 mL/min. Concentrations allant de 0,01 à 10 µg/mL, a observé une corrélation linéaire des pics dans le plasma humain pour tous les métabolites, ivacaftor, Iva-M1, Iva-M6 et lumacaftor14. Ici...

Combinaison Ivacaftor et ivacaftor-lumacaftor sont deux nouveaux médicaments CF. Cependant, il y a toujours un manque de compréhension sur leur pharmacocinétique/pharmacodynamique et pharmacologie. Nous présentons une technique HPLC-MS optimisée pour l’analyse simultanée d’ivacaftor et ses principaux métabolites et lumacaftor.

Optimisé méthode LC-MS/MS pour l’analyse de haut débit d’échantillons cliniques de Ivacaftor, ses principaux métabolites et Lumacaftor dans les fluides biologiques des patients atteints de fibrose kystique

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Il s'agit du protocole de préparation des échantillons pour le dosage plasmatique. Veuillez noter que, pour préserver leur intégrité, tous les échantillons et étalons doivent être conservés entre 2 et 8 degrés Celsius pendant le prélèvement et la préparation. Une fois la manipulation terminée, conserver tous les échantillons à moins 20 degrés.Pour la préparation standard, préparez deux solutions mères indépendantes de chaque anilide, ivacaftor, métabolite M1, métabolite M6 et lumacaftor dans du méthanol à 100 microgramme par millilitre et 10 microgramme par millilitre. Veuillez noter que les composés expirent après 10 jours à température ambiante. Pour les étalons, transférez 100 microlitres de plasma humain dans des tubes en polypropylène de 1,5 millilitre.Procédez de la même manière pour tous vos autres échantillons. Ensuite, ajoutez l'étalon interne à chaque tube. Par exemple, nous choisissons 0,01 microgramme par millilitre parmi l'étalon préparé.Ce tube contient désormais le plasma additionné de l'étalon interne. Procédez de la même manière pour tous les autres étalons. Prenez vos étalons et centrifugez-les quelques secondes afin de vous assurer que tout le liquide se trouve au fond du tube.Continuez ainsi pour toutes vos 40 normes. Pour les échantillons de patients, transférez 100 microlitres à partir du tube d'échantillon de patient dans le tube de microcentrifugation. L'échantillon réel de patient n'est pas dopé avec un étalon interne.Faire tourner l'échantillon du patient pendant quelques secondes afin de s'assurer que tout le liquide se trouve au fond du tube. Les étapes suivantes s'appliquent aussi bien aux échantillons qu'aux étalons. Ajouter 200 microlitres d'acide formique 0,1 % dans l'acétonitrile dans chaque tube d'échantillon pour précipiter les protéines plasmatiques.Procédez de la même manière pour toutes les normes et tous les échantillons de patients. Vortexez chaque échantillon vigoureusement pendant environ 15 secondes. Procédez de la même manière pour toutes les normes et tous les échantillons contaminés.Laisser reposer pendant 10 minutes au réfrigérateur pour faciliter la précipitation. À des fins de démonstration, je vais centrifuger un seul échantillon et un seul standard. Nous effectuons la centrifugation à 10 000 tr/min pendant 10 minutes dans une centrifugeuse Eppendorf Centrifuge 5430 à quatre degrés.Nous allons maintenant filtrer le surnageant dans les vials Phenomenex. Pour cela, nous utilisons un filtre à seringue de 13 millimètres avec des filtres en nylon Grace de 0,45 micromètre provenant des États-Unis, et nous filtrons directement dans les vials HPLC pouvant contenir 1,5 millilitre. Après filtration, nous transférerons 100 microlitres de surnageant dans les vials LC/MS pour l'analyse LC/MS.Cet échantillon est désormais prêt pour l'analyse. Placez simplement tous vos échantillons dans le porte-flacons. Nous utilisons un système LC/MS Shimadzu 8030, couplé à un spectromètre de masse à triple quadripôle.Laisser équilibrer le système avant l'analyse. Une fois l'équilibre atteint, ce qui prend environ 15 minutes, appuyer simplement sur le bouton Démarrer. Pour chaque métabolite, établir une courbe d'étalonnage en portant le rapport des aires des pics des anilides en fonction de la concentration nominale des solutions étalons.Utilisez l'équation de régression de la courbe d'étalonnage pour calculer les concentrations des anilides dans l'échantillon analysé. Un chromatogramme typique est présenté dans cette figure. Une résolution chromatographique optimisée a été obtenue en utilisant une phase mobile composée d'acétonitrile à 100 % et d'acide formique à 0,1 % dans l'eau, avec une élution en gradient sur une colonne Phenomenex Kinetex C8.Les temps de rétention en CL étaient les suivants. Pour M6, une minute. Pour M1, 1,3 minutes.Pour l'ivacaftor, 1,55 minute. Pour le lumacaftor, 2,3 minutes. Dans tous les échantillons de plasma témoins, aucune interférence avec le temps de rétention de l'un ou l'autre des anilides n'a été observée, et aucune interférence n'a été détectée provenant de la combinaison d'ivacaftor avec le lumacaftor.Grâce à l'analyse à haut débit d'un grand nombre d'échantillons de patients, nous avons optimisé notre méthode publiée en utilisant une colonne de chromatographie en phase renversée à taille de pore plus faible, la colonne Phenomenex C8, et un système de solvants en gradient au lieu de l'élution isocratique actuelle. Cela réduit le temps d'analyse à six minutes par échantillon, y compris la phase de lavage. Cette méthode fiable et nouvelle offre une approche simple, sensible et rapide pour la surveillance thérapeutique des concentrations d'ivacaftor et de la combinaison ivacaftor-lumacaftor dans les fluides biologiques.Étant donné la nécessité d'établir des relations exposition-réponse afin d'optimiser l'efficacité des médicaments tout en maîtrisant les coûts des soins de santé, des outils plus sensibles doivent être mis au point et validés pour aider les cliniciens à utiliser des traitements fondés sur des données probantes ainsi que des techniques analytiques à haut débit pour les patients souffrant de fibrose kystique. En appliquant la méthode analytique proposée à des études cliniques de pharmacocinétique et de pharmacodynamie, il devient possible d'approfondir l'investigation des paramètres pharmacocinétiques d'ivacaftor ou de la combinaison ivacaftor-lumacaftor sur un plus large groupe de patients.

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Le profilage des métabolites non ciblés par chromatographie liquide ultra performante couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS) est une technique puissante pour étudier le métabolisme.  Cet article décrit un flux de travail typique utilisé pour le profilage non ciblé des métabolites du sérum, y compris l’organisation et la préparation des échantillons, l’acquisition de données, l’analyse des données, le contrôle de la qualité et l’identification des métabolites.

À grande échelle non ciblée profilage métabolomique du sérum par Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Nous décrivons ici un test de chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS) à haute performance pour quantifier l’immunosuppresseur tacrolimus dans des taches de sang séché à l’aide d’une simple étape manuelle de précipitation des protéines et d’une extraction en colonne en ligne.

Quantification de l&#39;immunosuppresseur tacrolimus sur des taches de sang séché en utilisant LC-MS / MS

Compétence métabolique des systèmes in vitro est une condition essentielle pour la biotransformation et l' élimination des médicaments et produits toxiques. Dans ce protocole, nous décrivons l'application des sondes métaboliques de référence pour évaluer métabolisme de phase I dans les cultures cellulaires.

Spectrométrie de masse et les approches fondées luminogène à la phase I Caractériser métabolique des compétences<em&gt; In vitro</em&gt; Cell Cultures

Nous décrivons ici un protocole à l’aide de microdissection de saisie de laser couplée à l’analyse de LC/MS dans l’espace-quantifier des distributions de médicaments au sein des granulomes de tuberculose pulmonaire. L’approche a largement applicables à la quantification des concentrations du médicament dans les tissus à haute détails spatiaux.

Quantification spatiale des drogues dans les lésions de la tuberculose pulmonaire par Laser capturer Microdissection liquide chromatographie en spectrométrie de masse (LCM-LC/MS)

Nous décrivons ici une méthode de haut-débit pour la surveillance des médicaments complète qui permet la résolution améliorée et la détection de grands panneaux de drogues d’abus et de leurs métabolites, avec contrôle de la qualité basé sur l’injection multisegment-capillaire spectrométrie de masse à l’électrophorèse.

Surveillance des médicaments haut débit et complet à l’aide de la spectrométrie de masse de l’électrophorèse capillaire-Injection Multisegment

Le filtrage de fragmentation diagnostique, implémenté dans MZmine, est une approche élégante et post-acquisition pour filtrer les jeux de données LC-MS/MS pour des classes entières de produits naturels connus et inconnus. Cet outil recherche les spectres MS/MS pour les ions produits et/ou les pertes neutres que l’analyste a définies comme étant diagnostiques pour l’ensemble de la classe de composés.

Découverte de produits naturels avec filtrage de fragmentation diagnostique LC-MS/MS: application pour l’analyse microcystine

Ici, nous présentons un protocole robuste pour quantifier 40 composés impliqués dans le métabolisme central de carbone et d'énergie dans les réactions de synthèse de protéine sans cellules. Le mélange de synthèse sans cellules est dérivé avec de l'aniline pour une séparation efficace à l'aide d'une chromatographie liquide en phase inversée, puis quantifié par spectrométrie de masse à l'aide de normes internes étiquetées isotopiques.

Quantification absolue du métabolisme de synthèse des protéines sans cellules par spectrométrie de chromatographie liquide à phase inversée

Les méthodes actuelles d’analyse de l’adhésion des patients aux régimes complexes de pharmacorésistants-tbsi (DR-TB) peuvent être inexactes et à forte intensité de ressources. Notre méthode analyse les cheveux, une matrice facilement recueillie et stockée, pour des concentrations de 11 médicaments CONTRE la tuberculose DR. À l’aide de LC-MS/MS, nous pouvons déterminer les niveaux de médicaments sous-nanogrammes qui peuvent être utilisés pour mieux comprendre l’observance des médicaments.

Comité de LC-MS/MS validé pour quantifier 11 médicaments antituberculeux pharmacorésistants dans de petits échantillons de cheveux

Décrit ici est un protocole pour la détermination de quatre métabolites différents de tryptophane produits dans la voie de kynurenine (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, acide xanthurenic, acide 3-hydroxyanthranilic) dans le milieu recueilli des cultures de cellules cancéreuses analysées par chromatographie liquide couplée à une spectrométrie de masse quadrupole simple.

Quantification simultanée de kynurenines sélectionnées analysées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse dans le milieu recueilli à partir des cultures de cellules cancéreuses

Les protocoles décrivent des méthodes de chromatographie liquide à haute performance couplées à la détection de l’indice de réfraction ou de la spectrométrie de masse pour l’étude des réactions métaboliques dans des systèmes complexes sans cellules à base de lysate.

Chromatographie liquide couplée à la détection par spectrométrie de réfraction ou de masse pour le profilage de métabolites dans des systèmes sans cellules à base de lysate

Découvrez une méthode HPLC-MS optimisée pour l'analyse simultanée d'ivacaftor, de ses métabolites et de lumacaftor dans les fluides biologiques de patients atteints de mucoviscidose. Cette technique permet un suivi thérapeutique rapide et sensible.

Optimisé méthode LC-MS/MS pour l’analyse de haut débit d’échantillons cliniques de Ivacaftor, ses principaux métabolites et Lumacaftor dans les fluides biologiques des patients atteints de fibrose kystique (Vidéo) | JoVE Journal

Optimisé méthode LC-MS/MS pour l’analyse de haut débit d’échantillons cliniques de Ivacaftor, ses principaux métabolites et Lumacaftor dans les fluides biologiques des patients atteints de fibrose kystique

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