Optimisé méthode LC-MS/MS pour l’analyse de haut débit d’échantillons cliniques de Ivacaftor, ses principaux métabolites et Lumacaftor dans les fluides biologiques des patients atteints de fibrose kystique

Il s’agit du protocole de préparation des échantillons pour le dosage plasmatique. Veuillez noter que, pour assurer leur intégrité, tous les échantillons et les étalons doivent être conservés à une température de deux à huit degrés Celsius pendant la collecte et le traitement. Une fois la manipulation terminée, stockez tous les échantillons à moins 20 degrés.

Pour la préparation standard, préparer deux solutions mères indépendantes de chaque anilide, ivacaftor, métabolite M1, métabolite M6 et lumacaftor dans du méthanol à 100 microgrammes par millilitre et 10 microgrammes par millilitre. Veuillez noter que les composés expirent après 10 jours sur la paillasse. Pour les normes, transférez 100 microlitres de plasma humain dans les tubes à centrifuger en polypropylène de 1,5 millilitre.

Continuez à le faire pour tous vos autres échantillons. Ajoutez ensuite l’étalon interne à chaque tube. Par exemple, nous choisissons 0,01 microgramme par millilitre dans l’étalon préparé.

Maintenant, ce tube contient du plasma enrichi avec l’étalon interne. Procédez ainsi avec toutes les autres normes. Prenez vos étalons et faites-les tourner pendant quelques secondes pour vous assurer que tout le liquide se trouve au fond du tube.

Continuez à le faire pour toutes vos 40 normes. Pour les échantillons de patients, transférez 100 microlitres du tube d’échantillon du patient dans le tube de microcentrifugation. L’échantillon réel du patient n’est pas enrichi d’un étalon interne.

Faites tourner l’échantillon du patient pendant quelques secondes pour vous assurer que tout le liquide se trouve au fond du tube. Les étapes suivantes sont à la fois conçues pour les échantillons et les normes. Ajoutez 200 microlitres d’acide formique à 0,1 % dans de l’acétonitrile dans chaque tube d’échantillon pour précipiter les protéines plasmatiques.

Continuez de le faire pour tous les étalons et les échantillons de patients. Agitez vigoureusement chaque échantillon pendant environ 15 secondes. Continuez à le faire pour toutes les normes et les échantillons encourus.

Laisser reposer 10 minutes au réfrigérateur pour faciliter la précipitation. À des fins de démonstration, je ne centrifugerai qu’un seul échantillon et un seul étalon. Nous centrifugons à 10 000 tr/min pendant 10 minutes sur une centrifugeuse Eppendorf 5430 à quatre degrés.

Nous allons maintenant filtrer le surnageant dans les flacons de Phenomenex. Pour cela, nous utilisons un filtre à seringue de 13 millimètres avec des filtres en nylon Grace de 0,45 micromètre achetés aux États-Unis, et nous filtrons dans les flacons HPLC qui peuvent contenir 1,5 millilitre. Après la filtration, nous transférerons 100 microlitres de surnageant dans les flacons LC/MS pour l’analyse LC/MS.

Cet échantillon est maintenant prêt à être analysé. Il vous suffit maintenant de placer tous vos échantillons dans le support de flacons. Nous utilisons un système LC/MS Shimadzu 8030, couplé à une spécification de masse à trois quadripôles.

Laissez le système s’équilibrer avant l’analyse. Une fois équilibré, ce qui prend environ 15 minutes, il suffit d’appuyer sur le bouton Démarrer. Pour chaque métabolite, construisez une courbe d’étalonnage en traçant les rapports de surface de pic des aniliures en fonction de la concentration nominale des étalons d’étalonnage.

Utilisez l’équation de régression de la courbe d’étalonnage pour calculer les concentrations d’anilides dans l’échantillon encouru. Cette figure montre un chromatogramme typique. Une résolution chromatographique optimisée a été obtenue en utilisant une phase mobile de 100 % d’acétonitrile et 0,1 % d’acide formique dans de l’eau avec une élution en gradient sur une colonne Phenomenex Kinetex C8.

Les temps de rétention des LC étaient les suivants. Pour M6, une minute. Pour M1, 1,3 minute.

Pour l’ivacaftor, 1,55 minute. Pour lumacaftor, 2,3 minutes. Dans tous les échantillons de plasma à blanc, aucune interférence avec le temps de rétention de l’un ou l’autre des anilides n’a été observée, et aucune interférence n’a été détectée lors de l’association de l’ivacaftor et du lumacaftor.

Grâce à l’analyse à haut débit d’une grande quantité d’échantillons de patients, nous avons optimisé notre méthode rapportée grâce à l’utilisation d’une colonne de chromatographie en phase inverse de plus petite taille de pores, d’une colonne Phenomenex C8 et d’un système de solvant à gradient au lieu de l’élution isocratique actuelle. Cela réduit le temps de fonctionnement à six minutes par échantillon, y compris la phase de lavage. Cette méthode fiable et novatrice offre une approche simple, sensible et rapide pour la surveillance thérapeutique de l’ivacaftor et de l’association ivacaftor-lumacaftor et des fluides biologiques.

Étant donné la nécessité d’établir des relations exposition-réponse afin de maximiser l’efficacité des médicaments et de contenir les coûts des soins de santé, des outils plus sensibles doivent être développés et validés pour aider les cliniciens à utiliser un traitement fondé sur des données probantes et des techniques analytiques à haut débit pour les patients souffrant de CF.By l’application de la méthode analytique proposée aux études pharmacocinétiques et pharmacodynamiques cliniques, l’occasion se présente d’étudier davantage les paramètres pharmacocinétiques de l’ivacaftor ou de l' Combinaison IVACAFTOR-LUMACAFTOR-Lumacaftor, sur un plus grand collectif de patients.