Génération d’immunoprécipitation de la chromatine Native séquençage des bibliothèques pour l’analyse de densité de nucléosomes

L’objectif global de cette procédure est de générer des banques de séquençage d’immunoprécipitation de la chromatine native pour l’analyse de la densité des nucléosomes. Cette méthode peut répondre à des questions en épigénétique, telles que la révélation de caractéristiques épigénomiques dans une population cellulaire au niveau d’un seul nucléosome et la résolution de signatures hétérogènes de chromatine en leurs éléments continus. Le principal avantage de cette technique est d’utiliser la propriété MNase d’accès préférentiel à la région ouverte de la chromatine pour générer une mesure qui combine l’accessibilité de la MNase avec la modification des histones.

En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal car elles ne sont pas en mesure d’obtenir une digestion MNase optimale. Commencez ce protocole par la préparation des cellules comme décrit dans le protocole texte. Le premier jour, décongelez chaque pastille de cellule dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 secondes.

Ensuite, transférez les cellules dans de la glace. À chaque pastille de cellule, ajoutez immédiatement un tampon de lyse glacé 1X plus un PIC X jusqu’à une concentration finale de 10 000 cellules par 20 microlitres. Mélangez 10 fois en pipetant de haut en bas sans créer de bulles.

En travaillant sur de la glace, aliquote 20 microlitres par puits des lysats résultants dans une plaque de 96 puits. Couvrez l’assiette avec le sceau en plastique avant de l’incuber sur de la glace pendant 20 minutes. Étiquetez la plaque comme MNase et enregistrez les puits dans une clé de modèle.

Juste avant la fin de la lyse de 20 minutes, diluez l’enzyme MNase 1 avec le tampon de dilution MNase 1 jusqu’à une concentration finale de 20 unités par microlitre et maintenez-la sur de la glace. En travaillant sur de la glace, préparez le mélange maître de digestion MNase one comme décrit dans le protocole de texte. Ensuite, aliquote 20 microlitres du mélange principal pour chaque rangée d’échantillons, plus cinq microlitres de volume supplémentaire dans une plaque de réservoir à 96 puits.

Une fois que les lysats ont fini d’incuber, retirez la plaque de digestion MNase de la glace. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 20 microlitres de mélange maître de digestion MNnase one dans chaque rangée d’échantillons et mélangez en pipetant de haut en bas 10 fois. Changez les pointes entre les rangées.

Ensuite, incubez la plaque à température ambiante pendant exactement cinq minutes. Pour arrêter la réaction après cinq minutes, utilisez une pipette multicanaux pour ajouter six microlitres d’EDTA de 250 micromolaires dans chaque rangée d’échantillons et mélangez de haut en bas plusieurs fois. Assurez-vous de changer les pointes entre les rangées.

Après l’ajout d’EDTA, réglez la pipette sur 20 microlitres et mélangez 10 fois comme auparavant pour assurer l’arrêt complet de la réaction de digestion. Enfin, ajoutez six microlitres de tampon de lyse 10X à chaque rangée d’échantillons digérés par la MNase et mélangez bien en pipetant 10 fois vers le haut et vers le bas. Couvrez l’assiette avec un sceau en plastique et incubez sur de la glace pendant 15 minutes.

Préparez la plaque complexe de billes d’anticorps et la plaque de pré-nettoyage comme décrit dans le protocole de texte. Faites tourner rapidement les deux plaques en les centrifugant pendant 10 secondes à 200 fois G.Ensuite, placez la plaque complexe de billes d’anticorps sur un aimant à plaque et attendez 15 secondes pour que la solution devienne claire. Retirez et jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette sans déranger les billes.

Ensuite, retirez la plaque de l’aimant de la plaque et maintenez-la sur de la glace. Placez la plaque de réaction de pré-nettoyage sur une plaque magnétique et attendez 15 secondes que les billes se séparent et que la solution devienne claire. Sans déranger les billes, à l’aide d’une pipette, transférez soigneusement le surnageant dans les puits correspondants de la plaque du complexe de billes d’anticorps maintenue sur glace.

Mélangez bien chaque fois doucement en pipetant de haut en bas 15 fois. Scellez bien la plaque avec un couvercle de plaque en aluminium et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius sur une plate-forme rotative. Après l’incubation, réétiqueter la plaque IP Réaction.

Le deuxième jour, réglez le mélangeur de chauffage à 65 degrés Celsius, puis préparez un tampon de lavage à faible teneur en sel et un tampon de lavage à haute teneur en sel sur de la glace. Faites tourner rapidement la plaque de réaction IP pendant 10 secondes à 200 fois G.Placez la plaque de réaction IP sur un aimant à plaque et attendez 15 secondes que la solution devienne claire. À l’aide d’une pipette multicanaux, sans déranger les billes, retirez et jetez soigneusement le surnageant.

Retirez la plaque de l’aimant de la plaque et placez-la sur de la glace. À chaque rangée d’échantillons dans la plaque de réaction IP, ajoutez 150 microlitres de tampon de lavage glacé à faible teneur en sel et mélangez lentement de haut en bas 10 fois pour remettre complètement les billes en suspension. Replacez la plaque de réaction IP sur l’aimant de la plaque et retirez le surnageant comme précédemment.

Ensuite, remettez l’assiette sur de la glace et répétez les étapes de lavage pour un total de deux lavages. En travaillant sur de la glace, ajoutez 150 microlitres de tampon de lavage à haute teneur en sel à chaque rangée d’échantillons dans la plaque de réaction IP. Mélangez lentement les échantillons en pipetant 10 fois de haut en bas pour remettre complètement les billes en suspension.

Après avoir retiré le surnageant comme précédemment, placez la plaque de réaction IP sur de la glace et prérefroidissez une nouvelle plaque à 96 puits à côté. À chaque rangée d’échantillons dans la plaque de réaction IP, ajoutez 150 microlitres de tampon de lavage à haute teneur en sel et mélangez lentement 10 fois en pipetant de haut en bas pour remettre complètement les billes en suspension. Après la remise en suspension, transférez chaque rangée d’échantillons dans la rangée correspondante de la nouvelle plaque à 96 puits pré-refroidie.

Jetez l’ancienne assiette. Placez la nouvelle plaque de réaction IP sur l’aimant de la plaque et jetez le surnageant comme précédemment. Conservez l’assiette à température ambiante.

À chaque rangée d’échantillons dans la plaque de réaction IP, ajoutez 30 microlitres de tampon d’élution ChIP et mélangez lentement en pipetant 10 fois vers le haut et vers le bas. Prenez soin d’éviter la formation de bulles. Scellez la plaque avec un couvercle PCR et incubez dans un mélangeur chauffant à 65 degrés Celsius pendant 1 heure et demie avec une vitesse de mélange de 1 350 tr/min.

Après une incubation d’une heure et demie, faites tourner la plaque de réaction IP à 200 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Ensuite, placez la plaque de réaction IP sur un aimant à plaque et attendez que la solution se dissipe. À l’aide d’une pipette multicanaux, sans perturber les billes, transférez soigneusement 20 microlitres de surnageant dans une nouvelle plaque de 96 puits en utilisant des pointes fraîches pour chaque rangée.

Étiquetez la plaque IP Reaction et conservez-la à température ambiante. Procédez à la digestion des protéines suivie de la construction de la bibliothèque comme décrit dans le protocole de texte. Voici les résultats représentatifs d’une chromatine digérée par MNase optimale, sous-digérée et surdigérée avant la génération de la banque.

Le profil de digestion optimale est dominé par la taille des fragments de nucléosomes uniques, mais n’est pas surdigéré pour permettre la récupération de fragments de nucléosomes d’ordre supérieur. Une digestion sous-optimale de la chromatine sera également apparente dans le profil de la bibliothèque de séquençage générée à partir du matériau IP. Pour valider les bibliothèques par qPCR, l’enrichissement des plis des bibliothèques IP par rapport à la bibliothèque d’entrée a été évalué pour les cibles positives et négatives.

De plus, l’inspection des lectures alignées des banques avec un enrichissement de pliage évalué par qPCR élevé sur un navigateur génomique devrait révéler des enrichissements visuellement détectables par rapport à la bibliothèque d’entrée. Les bibliothèques de séquençage ChIP à densité de nucléosomes contiendront des réplicats hautement corrélés avec une part significative de lectures alignées dans des pics enrichis identifiés par MACS2. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement exécutée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des bibliothèques de séquençage d’immunoprécipitation de la chromatine native pour l’analyse de la densité des nucléosomes. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de s’assurer que la chromatine est digérée de manière optimale et de n’utiliser que des anticorps qui montrent une grande affinité avec l’épitope d’intérêt et qui montrent peu ou pas de réactivité croisée avec d’autres épitopes. Suite à cette procédure, une modélisation informatique de l’accessibilité de la MNase peut être effectuée pour répondre à des questions telles que les signatures épigénétiques dues à l’hétérogénéité au sein d’une population cellulaire.

Cette méthode donne un aperçu de l’effet combinatoire de la position des nucléosomes et de la densité locale ainsi que de la modification post-traductionnelle de leurs sous-unités d’histones et peut être appliquée à n’importe quel système tel que l’homme ou la souris, les cellules primaires et les tissus congelés.