Name: Génération d’immunoprécipitation de la chromatine Native séquençage des bibliothèques pour l’analyse de densité de nucléosomes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Découvrez une méthode ChIP-seq native pour l'analyse de la densité des nucléosomes en combinant l'accessibilité MNase et les modifications d'histones. Cette approche permet d'étudier les caractéristiques épigénétiques au niveau du nucléosome unique.

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A.L. était soutenue par une bourse d’études supérieures canadiennes de l’instituts de recherche en santé du Canada. Ce travail a été soutenu par des subventions de Génome Colombie-Britannique et les Instituts canadiens de recherche en santé (IRSC-120589) dans le cadre de l’épigénétique canadiens, l’environnement et l’Initiative Consortium de recherche en santé et par le programme d’Institut de recherche Terry Fox Subvention de projet #TFF-122869 M.H. et une Institut de recherche Terry Fox bourse de nouveau chercheur (subvention # 1039) à M.H.

<ol><li>Simpson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+Positioning%3A+Occurrence%2C+Mechanisms%2C+and+Functional+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucleic+Acid+Res.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleosome Positioning: Occurrence, Mechanisms, and Functional Consequences.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 40, Issue C 143-184 (1991).</li>
<li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10458604">Twenty-five years of the nucleosome, fundmamental particle of the eukaryotic chromosome.</a> Cell. 98, 285-294 (1999).</li>
<li>Schones, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+nucleosome+positioning+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of nucleosome positioning in the human genome.</a> Cell. 132 (5), 887-898 (2008).</li>
<li>Segal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+code+for+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genomic code for nucleosome positioning.</a> Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).</li>
<li>Shiio, Y., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+sumoylation+is+associated+with+transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Histone sumoylation is associated with transcriptional repression.</a> PNAS. 100 (23), 13225-13230 (2003).</li>
<li>Li, L., Lorzadeh, A., Hirst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+variation%3A+An+emerging+vantage+point+for+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Syst.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulatory variation: An emerging vantage point for cancer biology.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 6 (1), 37-59 (2014).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+acetylation+mechanism+by+GCN5+histone+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Investigation of the acetylation mechanism by GCN5 histone acetyltransferase.</a> PLoS ONE. 7 (5), (2012).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+in+transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Histone methylation in transcriptional control.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 12 (2), 198-209 (2002).</li>
<li>Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nat. Commun. 6, 6033(2015).</li>
<li>Lorzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+Density+ChIP-Seq+Identifies+Distinct+Chromatin+Modification+Signatures+Associated+with+MNase+Accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Nucleosome Density ChIP-Seq Identifies Distinct Chromatin Modification Signatures Associated with MNase Accessibility.</a> Cell Rep. 17 (8), 2112-2124 (2016).</li>
<li>Noll, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+micrococcal+nuclease+on+chromatin+and+the+location+of+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Action of micrococcal nuclease on chromatin and the location of histone H1.</a> J. Mol. Biol. 109 (3), 393-404 (1977).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+generating+high-resolution+maps+of+genome+wide+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A simple method for generating high-resolution maps of genome wide protein binding.</a> eLife. 4, 09225(2015).</li>
<li>Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. -P., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+nucleosome+positions+in+yeast+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution.</a> Nature. , (2012).</li>
<li>Cui, K., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+approaches+to+determining+nucleosome+occupancy+in+metazoans+using+MNase-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide approaches to determining nucleosome occupancy in metazoans using MNase-Seq.</a> Methods Mol. Biol. 833, 413-419 (2012).</li>
<li>Mieczkowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MNase+titration+reveals+differences+between+nucleosome+occupancy+and+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">MNase titration reveals differences between nucleosome occupancy and chromatin accessibility.</a> Nat. Commun. 7, 11485(2016).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22JOVE%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> JOVE. (41), (2010).</li>
<li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective%2C+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).</li>
<li>Zheng, Y., Josefowicz, S. Z., Kas, A., Chu, T. T., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Foxp3+target+genes+in+developing+and+mature+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Foxp3 target genes in developing and mature regulatory T cells.</a> Nature. 445 (7130), 936-940 (2007).</li>
<li>Krishnakumar, R., Gamble, M. J., Frizzell, K. M., Berrocal, J. G., Kininis, M., Kraus, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+Binding+of+PARP-1+and+Histone+H1+at+Promoters+Specifies+Transcriptional+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reciprocal Binding of PARP-1 and Histone H1 at Promoters Specifies Transcriptional Outcomes.</a> Science. 319 (5864), 819-821 (2008).</li>
<li>Mendenhall, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-specific+editing+of+histone+modifications+at+endogenous+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Locus-specific editing of histone modifications at endogenous enhancers.</a> Nat. Biotechnol. 31 (12), 1133-1136 (2013).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Reference Epigenome Standards - IHEC. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ihec-epigenomes.org/research/reference-epigenome-standards/">http://ihec-epigenomes.org/research/reference-epigenome-standards/</a> (2017).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Combinations+of+Lineage-Determining+Transcription+Factors+Prime+cis-Regulatory+Elements+Required+for+Macrophage+and+B+Cell+Identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities.</a> Mol. Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+ChIP-seq+enrichment+using+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Identifying ChIP-seq enrichment using MACS.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).</li>
<li>Fraley, C., Raftery, A. E. <a target="_blank" href="https://www.stat.washington.edu/raftery/Research/PDF/fraley1999.pdf">MCLUST: Software for Model-Based Cluster Analysis.</a> J. Classif. 16 (2), 297-306 (1999).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Compte tenu de la nature combinatoire de modification de la chromatine et nucléosome positionnement dans la régulation transcriptionnelle, une méthode qui permet la mesure simultanée de ces caractéristiques est susceptible d’offrir de nouvelles perspectives sur la régulation épigénétique. Le ndChIP-seq présenté ici est un protocole de ChIP-seq natif optimisé permettant l’interrogation simultanée de modification d’histone et densité des nucléosomes dans rares cellules primaires9,10. ndChIP-seq utilise la digestion enzymatique de la chromatine qui, lorsqu’il est couplé au séquençage massivement parallèle jumelé-fin et un modèle de distribution de mélange gaussien, permet les modifications d’histone enquête au niveau de single nucléosome et le déconvolution des profils épigénomique entraînée par l’hétérogénéité au sein d’une population. Utilisant ce protocole, nous avons déjà rapporté une distribution unique de tailles de fragment immuno-précipité, déterminée par jumelé-fin lire limites, associées aux États de chromatine spécifiques définies par ChromHMM10,24.
La qualité d’une bibliothèque de ndChIP-seq dépend de multiples facteurs, comme la spécificité de l’anticorps et de sensibilité, des conditions optimales de digestion MNase et qualité de la chromatine. La spécificité de l’anticorps utilisé est cruciale dans la production réussie ndChIP-seq bibliothèque. Un anticorps idéal montre une affinité élevée contre l’épitope d’intérêt avec peu de réactivité croisée avec les autres épitopes. Il est également important de choisir des billes magnétiques avec l’affinité de l’anticorps de choix.
MNase digestion est une réaction critique et sensibles au temps et concentration dans le présent protocole. Par conséquent, lors du traitement des échantillons multiples, il est important que chaque réaction est incubée pendant une durée équivalente (Voir l’étape 2.2). La qualité de la chromatine est un autre facteur que les effets significativement le résultat de ndChIP-suiv. fragmentés chromatine entraîne un profil de digestion MNase sous-optimal et résultats dans les bibliothèques avec un faible rapport signal sur bruit. Des échantillons primaires avec faible viabilité cellulaire ou dégradent de la chromatine, tels que fixés au formol des tissus inclus en paraffine (FFIP) ne sont pas recommandés pour ce protocole.
L’ajout d’un PIC au cours de l’extraction de la chromatine réduit non désirés (c.-à-d., aléatoire) chromatine fragmentation et préserve l’intégrité des queues d’histone. Par conséquent, PIC doit être ajoutée au tampon de lyse et immunoprécipitation tampon juste avant d’utiliser. Tandis que la sélection de cellules par cytométrie en flux, sélectionnez des cellules viables et vérifiez les cellules sont triés à un faible débit pour augmenter la précision de l’estimation numéro de cellulaire et de la viabilité des cellules. Éviter le tri des cellules directement dans le tampon de lyse. Le tampon de la gaine va diluer le tampon de lyse et empêche efficacement perméabilisation de la membrane cellulaire à MNase. Selon un type de cellules ou d’organismes, titrage de MNase peut être nécessaire d’obtenir une digestion optimale.
ndChIP-seq sur cellules de mammifères nécessite une profondeur minimale de séquençage de 50 millions jumelé-lectures (fragments de 25 millions) pour les marques étroites et 100 millions jumelé-lectures (fragments de 50 millions) pour l’entrée et les grandes marques. L’algorithme de distribution gaussienne de mélange ne pas fonctionne de manière optimale sur les bibliothèques qui ont été séquencés jusqu'à une profondeur largement inférieures de cette recommandation. ndChIP-seq classera pas promoteurs avec peu de distinction entre la valeur de la distribution pondérée pour des longueurs de fragment de mono - et di-nucléosomes dans mono - ou di-nucléosomes dominé promoteurs. Par conséquent, ces promoteurs doivent être enlevés dans l’analyse qui suit. Réplicats biologiques peuvent être générés pour accroître la confiance dans les distributions prédites et identifier la variabilité technique dans la construction de la digestion et bibliothèque MNase.
Contrairement aux itérations précédentes de protocoles natifs de ChIP-seq, ndChIP-seq fournit les moyens d’enquêter sur les effet combinatoire de modification de structure et les histones de la chromatine en utilisant la taille de fragment post immunoprécipitation pour intégrer la densité du nucléosome, déterminé par l’accessibilité MNase, avec mesures de modification des histones. Demande de ndChIP-seq primaires de cellules et tissus fournira de nouveaux aperçus de la nature intégrative de régulation épigénétique et permettre l’identification de signatures épigénétiques en raison de l’hétérogénéité au sein de la population.

Le génome des eucaryotes est emballé dans la chromatine par répétition de structures nucléosome qui se composent de deux copies de quatre protéines histones (p. ex., H2A, H2B, H3 et H4) circonscrits par 146 paires de bases d’ADN1,2. Complexes de remodelage de la chromatine nucleosome à stabiliser des limites gène promoteur et participent à la régulation de l’expression génique en altérant l’accessibilité de l’ADN à des facteurs de transcription et de l’ARN polymérase machines3, 4.
Aminés terminales queues des histones dans les nucléosomes sont soumis à diverses modifications covalentes, y compris l’acétylation, méthylation, phosphorylation, ubiquitination, sumoylation, formylation et hydroxylation des acides aminés spécifiques5 , 6 , 7 , 8. postes et degrés de ces modifications exigent un état de la chromatine qui influencent la chromatine structure et contrôle l’accès des complexes moléculaires qui permettent l’activation de la transcription,7. Étant donné que les deux modifications de densité et histone nucléosome jouent un rôle dans le contrôle local de la transcription des gènes, nous avons développé une approche native de puce qui permet la mesure simultanée de la densité du nucléosome et histone modification9, 10.
Natif de ChIP-seq profite de la nucléase de micrococci endonucléase (MNase) pour digérer la chromatine intacte dans son état natif dans le noyau11,12, une propriété qui a été mis à profit pour faire correspondre les nucléosomes positionnement13 , 14 , 15. densité nucléosome ChIP-seq (ndChIP-seq) tire profit de la propriété de l’accès préférentiel de MNase pour ouvrir les régions de chromatine pour générer des mesures qui allient accessibilité MNase histone modification10. ndChIP-seq est adapté pour le profilage des modifications d’histone dans les rares cellules primaires, des tissus et des cellules cultivées. Nous présentons ici un protocole détaillé qui permet la génération d’ensembles de données de séquence pour un travail de cadre analytique décrit précédemment10 qui intègre le fragment taille post immunoprécipitation, déterminée par jumelé-fin lire les limites, à en même temps étudier MNase accessibilité avec mesures de modification des histones. Auparavant, l’application du présent protocole au sang de cordon humain primaire 10 000 dérivés CD34+ les cellules et les cellules souches embryonnaires humaines ont révélé une relation unique entre la chromatine structure et histone modifications au sein de ces cellules types10 . Compte tenu de sa capacité à mesurer simultanément l’accessibilité nucléosome et modification d’histone, ndChIP-seq est capable de révéler épigénomique caractéristiques dans une population de cellules à un niveau unique nucléosome et de résoudre les signatures hétérogènes dans leurs éléments constitutifs. Enquête des promoteurs bivalents, où H3K4me3, une marque active et H3K27me3, une marque répressive, sont présents10, est un exemple de l’exploration des populations cellulaires hétérogènes par ndChIP-seq.

<table><tbody><tr><td>1M Tris-HCl &ndash ; pH 7,5</td><td>Thermo Scientific</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-HCl &ndash ; pH 8</td><td>Thermo Scientific</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td>Sigma</td><td>1001385276</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>1001412354</td><td></td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma</td><td>1001437582</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Thermo Scientific</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>100 % EtOH</td><td>NA NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96 well plate (AB 1400)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1400-L</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P2 pipetman</td><td>Mandel</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P10 pipetman</td><td>Mandel</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P20 pipetman</td><td>Mandel</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P100 pipetman</td><td>Mandel</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P200 pipetman</td><td>Mandel</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P1000 pipetman</td><td>Mandel</td><td>F123603</td><td></td></tr><tr><td>Nucléase micrococcique&nbsp ;</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Mixer C (Mélangeur à blocs chauffants)</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12 canaux Pippet P20</td><td>Rainin</td><td>17013803</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12 canaux Pippet P200</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml LoBind tube</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml LoBind tube</td><td>Eppendorf</td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle de plaque en plastique</td><td>Bord Bio</td><td>48461</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle PCR</td><td>Bio Rad</td><td>MSD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle de plaque en aluminium</td><td>Bio Rad</td><td>MSF-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’élution (tampon EB)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>1M DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R centrifugeuse&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>22625004</td><td></td></tr><tr><td>Eau ultrapure</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Protéines G Dynabeads</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td><td></td></tr><tr><td>Protéines A Dynabeads</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td> Inhibiteur de <td></td></tr><tr><td>protéase Cocktail</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>Plate-forme rotative</td><td>Mandel</td><td>1b109-12052010</td><td></td></tr><tr><td>Aimant à plaques</td><td>Alpaqua</td><td>2523</td><td></td></tr><tr><td>Bande bombée à 12 capuchons</td><td>Bio Rad</td><td>TCS1201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer G2</td><td>Qiagen</td><td>1014636</td><td></td></tr><tr><td>Protéase</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>Aimant tubulaire (DynaMag-2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Aimant tubulaire (DynaMag-2)</td><td>LabCore</td><td>730-006</td><td></td></tr><tr><td>Forme en V Réservoir en plastique</td><td>Mandel</td><td>S0100A</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Mandel</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>Mini Fuge</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS2035</td><td></td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>Mandel</td><td>LB109-12052010</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de réaction de ligature rapide, 5X</td><td>NEB</td><td>B6058S</td><td></td></tr><tr><td>ADN polymérase I, Grand (Klenow) Fragment</td><td>NEB</td><td>M0210S</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'-5' exo)</td><td>NEB</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN polymérase</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucléotide kinase</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de solution de désoxynucléotide, 10mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>solution dATP 10mM</td><td>NEB</td><td>N0440S</td><td></td></tr><tr><td>Quick T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5'-triphosphate (ATP), 25mM</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>ADN polymérase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2 NEB</td><td></td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée de Hank</td><td>Thermo Scientific</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>A3160702</td><td></td></tr><tr><td>tampon phosphate saline&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9751S</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410037</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>pAb-069-050</td><td></td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410056</td><td></td></tr><tr><td>SeraMag&nbsp ; super-paramagnétique chapelet</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

génération d’immunoprécipitation de la chromatine native séquençage des bibliothèques pour l’analyse de densité de nucléosomes

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nous présentons une immunoprécipitation de la chromatine native mis à jour le séquençage protocole expérimental (ChIP-seq) compatible avec une méthodologie de l’analyse de distribution basée mélange gaussien (densité nucléosome ChIP-seq ; ndChIP-seq) qui permet la génération de combinée des mesures d’accessibilité de la nucléase micrococcique (MNase) avec modification d’histone Génome-large. Position du nucléosome et densité locale et la modification post-traductionnelle de leurs sous-unités d’histone, agissent de concert pour réguler les États locaux de transcription. Des mesures d’accessibilité nucléosome avec modification d’histone générée par ndChIP-seq combinatoires permet l’interrogation simultanée de ces fonctionnalités. La méthodologie ndChIP-seq est applicable à un petit nombre de cellules primaires inaccessibles à réticulation selon des protocoles de ChIP-seq. L’ensemble ndChIP-seq permet la mesure de la modification des histones en combinaison avec une densité de nucléosomes local pour obtenir de nouvelles connaissances sur les mécanismes communs qui régulent la transcription de l’ARN au sein des populations rares cellules primaires.

Nous présentons une immunoprécipitation de la chromatine native mis à jour le séquençage (ChIP-seq) méthodologie pour la production d’ensembles de données de séquence pour un cadre d’analyse des nucléosomes densité ChIP-seq intégrant l’accessibilité nucléase micrococcique (MNase) avec mesures de modification d’histone.

Génération d’immunoprécipitation de la chromatine Native séquençage des bibliothèques pour l’analyse de densité de nucléosomes

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des bibliothèques de séquençage par immunoprécipitation de chromatine native pour l'analyse de la densité des nucléosomes. Cette méthode permet de répondre à des questions en épigénétique, telles que la mise en évidence de caractéristiques épigénomiques au sein d'une population cellulaire au niveau d'un nucléosome unique, ou encore la résolution des signatures hétérogènes de chromatine en leurs éléments continus. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation de la propriété de la MNase, qui accède préférentiellement aux régions de chromatine ouverte, afin de produire une mesure combinant l'accessibilité à la MNase et les modifications des histones.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car elles ne parviendront pas à obtenir une digestion optimale par la MNase. Commencez ce protocole par la préparation des cellules, telle que décrite dans le protocole écrit. Le premier jour, décongelez chaque culot cellulaire dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius pendant 10 secondes.Ensuite, transférez les cellules sur de la glace. À chaque culot cellulaire, ajoutez immédiatement un tampon de lyse au concentration 1X, refroidi sur glace, et du PIC à 1X, afin d'obtenir une concentration finale de 10 000 cellules par 20 microlitres. Mélangez 10 fois en aspirant et en rejetant à l’aide d’une pipette, sans créer de bulles.Sur de la glace, aliquoter 20 microlitres par puits des lysats obtenus dans une plaque de 96 puits. Couvrir la plaque avec un scellé en plastique avant de l'incuber sur de la glace pendant 20 minutes. Étiqueter la plaque comme étant MNase et noter les puits sur une clé modèle.Juste avant la fin de la lyse de 20 minutes, diluez l'enzyme MNase un avec le tampon de dilution MNase un jusqu'à une concentration finale de 20 unités par microlitre et maintenez-la sur glace. En travaillant sur glace, préparez le mélange maître de digestion MNase un comme décrit dans le protocole textuel. Ensuite, aliquotez 20 microlitres du mélange maître par chaque rangée d'échantillons, plus cinq microlitres de volume supplémentaire dans une plaque réservoir de 96 puits.Une fois l'incubation des lysats terminée, retirez la plaque de digestion MNase de la glace. À l'aide d'une pipette multicanal, ajoutez 20 microlitres du mélange maître de digestion MNnase dans chaque rangée d'échantillons et mélangez en aspirant et en expulsant 10 fois. Changez les embouts entre chaque rangée.Ensuite, incuber la plaque à température ambiante pendant exactement cinq minutes. Pour arrêter la réaction après cinq minutes, utiliser une pipette multicanal pour ajouter six microlitres d'EDTA à 250-micromolaire dans chaque rangée d'échantillons et mixer plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Veiller à changer les embouts entre chaque rangée.Après l'ajout de l'EDTA, régler la pipette sur 20 microlitres et mélanger 10 fois comme précédemment afin de garantir l'arrêt complet de la réaction de digestion. Enfin, ajouter six microlitres de tampon de lyse 10X à chaque puits des échantillons digérés par la MNase et bien mélanger en aspirant et en expulsant 10 fois à l’aide de la pipette. Couvrir la plaque avec un film plastique et incuber sur de la glace pendant 15 minutes.Préparez la plaque de complexe anticorps-billes et la plaque de pré-élimination comme décrit dans le protocole écrit. Faites une courte centrifugation des deux plaques pendant 10 secondes à 200 × g. Ensuite, placez la plaque de complexe anticorps-billes sur un aimant à plaque et attendez 15 secondes jusqu’à ce que la solution devienne limpide. Retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette et jetez-le, sans perturber les billes.Ensuite, retirez la plaque de l'aimant à plaque et maintenez-la sur de la glace. Placez la plaque contenant la réaction de pré-élimination sur un aimant à plaque et attendez 15 secondes pour que les billes se séparent et que la solution devienne claire. Sans perturber les billes, utilisez une pipette pour transférer soigneusement le surnageant dans les puits correspondants de la plaque contenant les complexes anticorps-billes, maintenue sur de la glice.Mélangez délicatement chaque puits en aspirant et en dispensant 15 fois à l’aide d’une pipette. Scellez soigneusement la plaque avec un couvercle en aluminium et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius sur une plateforme rotative. Après l’incubation, reétiquetez la plaque « Réaction IP ».Le deuxième jour, régler le mélangeur chauffant à 65 degrés Celsius, puis préparer un tampon de lavage à faible teneur en sel et un tampon de lavage à forte teneur en sel sur de la glace. Faire une courte centrifugation de la plaque de réaction d'immunoprécipitation pendant 10 secondes à 200 ×g. Placer la plaque de réaction d'immunoprécipitation sur un aimant à plaque et attendre 15 secondes jusqu'à ce que la solution devienne limpide. À l'aide d'une pipette multipuits, sans perturber les billes, retirer soigneusement le surnageant et le jeter.Retirez la plaque de l'aimant à plaque et placez-la sur de la glace. Ajoutez à chaque rangée d'échantillons dans la plaque de réaction d'IP 150 microlitres de tampon de lavage à faible concentration saline prélevé sur glace, puis mélangez lentement par aspiration et expulsion 10 fois afin de resuspendre complètement les billes. Replacez la plaque de réaction d'IP sur l'aimant à plaque et éliminez le surnageant comme précédemment.Ensuite, remettez la plaque sur de la glace et répétez les étapes de lavage pour un total de deux lavages. En travaillant sur de la glace, ajoutez 150 microliters du tampon de lavage à haute concentration saline dans chaque ligne d'échantillons de la plaque de réaction d'IP. Mélangez doucement les échantillons en pipetant 10 fois de haut en bas afin de resuspendre complètement les billes.Après avoir éliminé le surnageant comme précédemment, placez la plaque de réaction d'IP sur de la glace et prérefroidissez une nouvelle plaque de 96 puits à côté. À chaque ligne d'échantillons dans la plaque de réaction d'IP, ajoutez 150 microlitres de tampon de lavage à haute force ionique et mélangez lentement 10 fois en aspirant et en redistribuant pour resuspendre complètement les billes. Après la resuspension, transférez chaque ligne d'échantillons vers la ligne correspondante de la nouvelle plaque de 96 puits prérefroidie.Jetez la plaque usagée. Placez la nouvelle plaque de réaction d'IP sur l'aimant à plaque et jetez le surnageant comme précédemment. Conservez la plaque à température ambiante.Ajouter à chaque puits d'échantillons dans la plaque de réaction d'IP 30 microlitres de tampon deélution ChIP et mélanger doucement en pipettant de haut en bas 10 fois. Prendre soin d'éviter la formation de bulles. Sceller la plaque avec un couvercle PCR et incuber dans un agitateur chauffant à 65 degrés Celsius pendant 1 heure et demie à une vitesse d'agitation de 1 350 tr/min.Après une incubation de 1 h 30, centrifuger la plaque de réaction d'immunoprécipitation à 200 × g pendant une minute à 4 °C. Ensuite, placer la plaque de réaction d'immunoprécipitation sur un aimant pour plaques et attendre que la solution devienne limpide. À l’aide d’une pipette multipipette, sans perturber les billes, transférer soigneusement 20 microlitres du surnageant dans une nouvelle plaque de 96 puits en utilisant des embouts neufs pour chaque rangée.Étiquetez la plaque « Réaction IP » et conservez-la à température ambiante. Poursuivez par la digestion des protéines suivie de la construction de la banque selon ce qui est décrit dans le protocole écrit. Les résultats présentés ici sont des exemples représentatifs de chromatine digérée par MNase optimale, sous-digérée et sur-digérée avant la génération de la banque.Le profil de digestion optimale est dominé par des fragments de taille correspondant à un seul nucléosome, sans être surextrait afin de permettre la récupération de fragments de nucléosomes d'ordre supérieur. Une digestion sous-optimale de la chromatine sera également apparente dans le profil de la bibliothèque de séquençage générée à partir du matériel d'IP. Pour valider les bibliothèques par qPCR, l'enrichissement relatif des bibliothèques d'IP par rapport à la bibliothèque témoin a été évalué pour des cibles positives et négatives.En outre, l'inspection des lectures alignées des bibliothèques présentant un enrichissement élevé en repli évalué par qPCR, visualisées sur un navigateur génomique, devrait révéler des enrichissements détectables visuellement par rapport à la bibliothèque témoin. Des bibliothèques de séquençage ChIP de densité nucléosomique réussies contiendront des répliques fortement corrélées, avec une partie significative des lectures alignées situées au sein des pics enrichis identifiés par MACS2. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer des bibliothèques de séquençage par immunoprécipitation de chromatine native pour l'analyse de la densité des nucléosomes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à ce que la chromatine soit digérée de manière optimale et de n'utiliser que des anticorps présentant une forte affinité pour l'épitope d'intérêt et une faible ou nulle réactivité croisée avec d'autres épitopes. Après cette procédure, une modélisation informatique de l'accessibilité de la MNase peut être réalisée afin de répondre à des questions telles que les signatures épigénétiques dues à l'hétérogénéité au sein d'une population cellulaire.Cette méthode permet d'obtenir des informations sur l'effet combinatoire de la position des nucléosomes et de leur densité locale, ainsi que sur les modifications post-traductionnelles de leurs sous-unités histones, et peut être appliquée à tout système, comme l'humain ou la souris, les cellules primaires et les tissus congelés.

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Immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les sites de liaison aux protéines cibles sur l’ADN génomique

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L&#39;approche ChroP Combine puce et la spectrométrie de masse à Disséquer protéomiques paysages Locus spécifiques de la chromatine

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