Génération d’immunoprécipitation de la chromatine Native séquençage des bibliothèques pour l’analyse de densité de nucléosomes

L'objectif général de cette procédure est de générer des bibliothèques de séquençage par immunoprécipitation de chromatine native pour l'analyse de la densité des nucléosomes. Cette méthode permet de répondre à des questions en épigénétique, telles que la mise en évidence de caractéristiques épigénomiques au sein d'une population cellulaire au niveau d'un nucléosome unique, ou encore la résolution des signatures hétérogènes de chromatine en leurs éléments continus. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation de la propriété de la MNase, qui accède préférentiellement aux régions de chromatine ouverte, afin de produire une mesure combinant l'accessibilité à la MNase et les modifications des histones.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car elles ne parviendront pas à obtenir une digestion optimale par la MNase. Commencez ce protocole par la préparation des cellules, telle que décrite dans le protocole écrit. Le premier jour, décongelez chaque culot cellulaire dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius pendant 10 secondes.

Ensuite, transférez les cellules sur de la glace. À chaque culot cellulaire, ajoutez immédiatement un tampon de lyse au concentration 1X, refroidi sur glace, et du PIC à 1X, afin d'obtenir une concentration finale de 10 000 cellules par 20 microlitres. Mélangez 10 fois en aspirant et en rejetant à l’aide d’une pipette, sans créer de bulles.

Sur de la glace, aliquoter 20 microlitres par puits des lysats obtenus dans une plaque de 96 puits. Couvrir la plaque avec un scellé en plastique avant de l'incuber sur de la glace pendant 20 minutes. Étiqueter la plaque comme étant MNase et noter les puits sur une clé modèle.

Juste avant la fin de la lyse de 20 minutes, diluez l'enzyme MNase un avec le tampon de dilution MNase un jusqu'à une concentration finale de 20 unités par microlitre et maintenez-la sur glace. En travaillant sur glace, préparez le mélange maître de digestion MNase un comme décrit dans le protocole textuel. Ensuite, aliquotez 20 microlitres du mélange maître par chaque rangée d'échantillons, plus cinq microlitres de volume supplémentaire dans une plaque réservoir de 96 puits.

Une fois l'incubation des lysats terminée, retirez la plaque de digestion MNase de la glace. À l'aide d'une pipette multicanal, ajoutez 20 microlitres du mélange maître de digestion MNnase dans chaque rangée d'échantillons et mélangez en aspirant et en expulsant 10 fois. Changez les embouts entre chaque rangée.

Ensuite, incuber la plaque à température ambiante pendant exactement cinq minutes. Pour arrêter la réaction après cinq minutes, utiliser une pipette multicanal pour ajouter six microlitres d'EDTA à 250-micromolaire dans chaque rangée d'échantillons et mixer plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Veiller à changer les embouts entre chaque rangée.

Après l'ajout de l'EDTA, régler la pipette sur 20 microlitres et mélanger 10 fois comme précédemment afin de garantir l'arrêt complet de la réaction de digestion. Enfin, ajouter six microlitres de tampon de lyse 10X à chaque puits des échantillons digérés par la MNase et bien mélanger en aspirant et en expulsant 10 fois à l’aide de la pipette. Couvrir la plaque avec un film plastique et incuber sur de la glace pendant 15 minutes.

Préparez la plaque de complexe anticorps-billes et la plaque de pré-élimination comme décrit dans le protocole écrit. Faites une courte centrifugation des deux plaques pendant 10 secondes à 200 × g. Ensuite, placez la plaque de complexe anticorps-billes sur un aimant à plaque et attendez 15 secondes jusqu’à ce que la solution devienne limpide. Retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette et jetez-le, sans perturber les billes.

Ensuite, retirez la plaque de l'aimant à plaque et maintenez-la sur de la glace. Placez la plaque contenant la réaction de pré-élimination sur un aimant à plaque et attendez 15 secondes pour que les billes se séparent et que la solution devienne claire. Sans perturber les billes, utilisez une pipette pour transférer soigneusement le surnageant dans les puits correspondants de la plaque contenant les complexes anticorps-billes, maintenue sur de la glice.

Mélangez délicatement chaque puits en aspirant et en dispensant 15 fois à l’aide d’une pipette. Scellez soigneusement la plaque avec un couvercle en aluminium et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius sur une plateforme rotative. Après l’incubation, reétiquetez la plaque « Réaction IP ».

Le deuxième jour, régler le mélangeur chauffant à 65 degrés Celsius, puis préparer un tampon de lavage à faible teneur en sel et un tampon de lavage à forte teneur en sel sur de la glace. Faire une courte centrifugation de la plaque de réaction d'immunoprécipitation pendant 10 secondes à 200 ×g. Placer la plaque de réaction d'immunoprécipitation sur un aimant à plaque et attendre 15 secondes jusqu'à ce que la solution devienne limpide. À l'aide d'une pipette multipuits, sans perturber les billes, retirer soigneusement le surnageant et le jeter.

Retirez la plaque de l'aimant à plaque et placez-la sur de la glace. Ajoutez à chaque rangée d'échantillons dans la plaque de réaction d'IP 150 microlitres de tampon de lavage à faible concentration saline prélevé sur glace, puis mélangez lentement par aspiration et expulsion 10 fois afin de resuspendre complètement les billes. Replacez la plaque de réaction d'IP sur l'aimant à plaque et éliminez le surnageant comme précédemment.

Ensuite, remettez la plaque sur de la glace et répétez les étapes de lavage pour un total de deux lavages. En travaillant sur de la glace, ajoutez 150 microliters du tampon de lavage à haute concentration saline dans chaque ligne d'échantillons de la plaque de réaction d'IP. Mélangez doucement les échantillons en pipetant 10 fois de haut en bas afin de resuspendre complètement les billes.

Après avoir éliminé le surnageant comme précédemment, placez la plaque de réaction d'IP sur de la glace et prérefroidissez une nouvelle plaque de 96 puits à côté. À chaque ligne d'échantillons dans la plaque de réaction d'IP, ajoutez 150 microlitres de tampon de lavage à haute force ionique et mélangez lentement 10 fois en aspirant et en redistribuant pour resuspendre complètement les billes. Après la resuspension, transférez chaque ligne d'échantillons vers la ligne correspondante de la nouvelle plaque de 96 puits prérefroidie.

Jetez la plaque usagée. Placez la nouvelle plaque de réaction d'IP sur l'aimant à plaque et jetez le surnageant comme précédemment. Conservez la plaque à température ambiante.

Ajouter à chaque puits d'échantillons dans la plaque de réaction d'IP 30 microlitres de tampon deélution ChIP et mélanger doucement en pipettant de haut en bas 10 fois. Prendre soin d'éviter la formation de bulles. Sceller la plaque avec un couvercle PCR et incuber dans un agitateur chauffant à 65 degrés Celsius pendant 1 heure et demie à une vitesse d'agitation de 1 350 tr/min.

Après une incubation de 1 h 30, centrifuger la plaque de réaction d'immunoprécipitation à 200 × g pendant une minute à 4 °C. Ensuite, placer la plaque de réaction d'immunoprécipitation sur un aimant pour plaques et attendre que la solution devienne limpide. À l’aide d’une pipette multipipette, sans perturber les billes, transférer soigneusement 20 microlitres du surnageant dans une nouvelle plaque de 96 puits en utilisant des embouts neufs pour chaque rangée.

Étiquetez la plaque « Réaction IP » et conservez-la à température ambiante. Poursuivez par la digestion des protéines suivie de la construction de la banque selon ce qui est décrit dans le protocole écrit. Les résultats présentés ici sont des exemples représentatifs de chromatine digérée par MNase optimale, sous-digérée et sur-digérée avant la génération de la banque.

Le profil de digestion optimale est dominé par des fragments de taille correspondant à un seul nucléosome, sans être surextrait afin de permettre la récupération de fragments de nucléosomes d'ordre supérieur. Une digestion sous-optimale de la chromatine sera également apparente dans le profil de la bibliothèque de séquençage générée à partir du matériel d'IP. Pour valider les bibliothèques par qPCR, l'enrichissement relatif des bibliothèques d'IP par rapport à la bibliothèque témoin a été évalué pour des cibles positives et négatives.

En outre, l'inspection des lectures alignées des bibliothèques présentant un enrichissement élevé en repli évalué par qPCR, visualisées sur un navigateur génomique, devrait révéler des enrichissements détectables visuellement par rapport à la bibliothèque témoin. Des bibliothèques de séquençage ChIP de densité nucléosomique réussies contiendront des répliques fortement corrélées, avec une partie significative des lectures alignées situées au sein des pics enrichis identifiés par MACS2. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer des bibliothèques de séquençage par immunoprécipitation de chromatine native pour l'analyse de la densité des nucléosomes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à ce que la chromatine soit digérée de manière optimale et de n'utiliser que des anticorps présentant une forte affinité pour l'épitope d'intérêt et une faible ou nulle réactivité croisée avec d'autres épitopes. Après cette procédure, une modélisation informatique de l'accessibilité de la MNase peut être réalisée afin de répondre à des questions telles que les signatures épigénétiques dues à l'hétérogénéité au sein d'une population cellulaire.

Cette méthode permet d'obtenir des informations sur l'effet combinatoire de la position des nucléosomes et de leur densité locale, ainsi que sur les modifications post-traductionnelles de leurs sous-unités histones, et peut être appliquée à tout système, comme l'humain ou la souris, les cellules primaires et les tissus congelés.