Profilage anti-Neu5Gc IgG dans les sérums humains avec un dosage de microarray de sialoglycan

L’objectif global du test de micropuce à sialoglycane est d’évaluer les IgG anti-Neu5Gc dans le sérum humain à haut débit contre une collection diversifiée de sialoglycanes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la glycoimmunologie, telles que l’implication des anticorps anti-Neu5Gc dans diverses maladies humaines, notamment le cancer, les maladies cardiaques et la xénotransplantation. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un profilage à haut débit des anticorps anti-Neu5Gc contre une myriade d’antigènes sialoglycanes.

La démonstration de la procédure sera assurée par Sharon Yehuda, une étudiante en master de mon laboratoire. Une planification minutieuse et détaillée de la fabrication et de l’agencement du réseau est importante pour assurer le succès. Ce processus est détaillé dans le protocole texte et les informations supplémentaires.

Diluez chaque glycane à 100 micromolaires dans un volume total de 100 microlitres de tampon d’impression de glycanes dans des tubes de microcentrifugation. Ensuite, préparez l’amine primaire contenant un colorant fluorescent à un milligramme par millimètre avec un tampon de marqueur. Ensuite, diluez à un microgramme par millilitre dans un volume total d’un millilitre.

Préparer les dilutions de la courbe standard d’IgG humaines comme décrit dans le protocole de texte. Placez la plaque à 384 puits sur de la glace. À l’aide d’une multipipette électronique, aliquote sept microlitres de chaque glycane, marqueur et courbe IgG selon la disposition de la plaque trouvée dans le protocole de texte.

Couvrez la plaque de parafilm et tournez pendant deux minutes à 250 fois g et 12 degrés Celsius. L’impression doit être effectuée dans un endroit exempt de poussière avec une humidité de 60 à 70 %Ici, toutes les étapes sont effectuées dans une salle blanche avec des gants et des vêtements de protection appropriés. Allumez la nano-imprimante et l’humidificateur.

Après avoir programmé la machine d’impression comme décrit dans le protocole texte, positionnez la plaque à 384 puits avec les échantillons aliquotes à son emplacement sur le pont de l’arrayer et retirez le couvercle du parafilm. À ce stade, commencez à imprimer. Numérotez les diapositives à l’aide d’un marqueur résistant aux solvants d’alcool et rangez-les dans une boîte scellée sous vide dans l’obscurité.

Pour traiter les matrices, retirez d’abord une lame de la boîte scellée sous vide et placez-la dans une hotte chimique pendant cinq minutes, matrice vers le haut, pour évaporer l’excès de liquide. Ensuite, hydratez la lame en la plaçant dans un tube de coloration rempli d’eau déminéralisée. Couvrez le tube d’une feuille d’aluminium et incubez pendant cinq minutes en secouant lentement et doucement à température ambiante.

Pour bloquer les groupes époxy réactifs sur la lame, trempez la lame dans le tube de coloration de 50 millilitres rempli d’une solution bloquante d’éthanolamine préchauffée. Couvrez le tube d’une feuille d’aluminium et incubez pendant 30 minutes en secouant lentement et doucement à température ambiante. Jetez la solution bloquante d’éthanolamine dans la poubelle appropriée pour les risques biologiques.

Ensuite, placez la lame dans un nouveau tube de coloration propre rempli d’eau déminéralisée à 50 degrés Celsius. Couvrez le tube d’une feuille d’aluminium et incubez pendant 10 minutes en secouant lentement et doucement à température ambiante. Jetez l’eau et transférez les lames dans un support de coloration en verre.

Placez l’appareil dans un support de plaque oscillante et centrifugez la lame à sec. Ensuite, placez la diapositive sur un séparateur de 16 puits. Après avoir pré-mouillé les puits, utilisez une multipipette pour aliquoter 200 microlitres de PBST dans les puits de lames.

Ensuite, placez-les dans une chambre couverte et humide et secouez-les pendant cinq minutes. Retirez le PBST en tapotant doucement sur une serviette en papier propre. Ensuite, aliquote 200 microlitres de tampon bloquant PBS-Ovalbumine dans chaque puits.

Placez les lames dans une chambre humide et incubez pendant une heure à température ambiante en secouant doucement. Ensuite, préparez la détection primaire, diluée dans la mémoire tampon de blocage PBS-OVA comme décrit dans le protocole texte. Retirez le tampon de blocage PBS-OVA de la lame et ajoutez 200 microlitres d’anticorps primaires par puits.

Incuber les lames dans une chambre humide pendant deux heures. Ensuite, retirez la détection primaire de la diapositive et lavez trois fois avec PBST. Incuber la lame dans PBST pendant cinq minutes dans une chambre humide avant de laver une dernière fois avec PBST.

Ensuite, lavez une fois avec du PBS. Ensuite, préparez l’anticorps secondaire dans le PBS comme décrit dans le protocole texte. Retirez le PBS de la diapositive et ajoutez 200 microlitres d’anticorps secondaires.

Retirez l’anticorps secondaire de la lame et lavez-la quatre fois avec du PBST comme précédemment. Retirez délicatement le cadre, puis placez les lames dans un tube de coloration de lame de 50 millilitres rempli de PBS et secouez pendant cinq minutes. Ensuite, remplissez deux bains de coloration de lames avec de l’eau déminéralisée.

Placez la glissière dans le support de diapositive et trempez-la dans le premier bain. Trempez rapidement la diapositive dix fois. Ensuite, transférez la diapositive dans le deuxième bain et trempez dix fois de plus.

Après le trempage, incubez la lame pendant dix minutes à température ambiante en secouant. Après l’incubation, jetez l’eau et transférez la lame dans un support de coloration en verre. Placez le support de coloration en verre dans un support de plaque pivotante et centrifugez la lame pour la sécher.

Ouvrez la porte du scanner et placez la diapositive à l’intérieur, le tableau vers le bas. À ce stade, lancez l’analyse. Enregistrez les diapositives numérisées sous forme de fichier TIFF.

Pour préparer une diapositive à analyser, sélectionnez Charger la liste des tableaux" et chargez le fichier GAL approprié qui mappe les tableaux de chaque bloc de la diapositive. Les lames ont été développées avec 16 fractions de détection primaires différentes, une dans chaque bloc. La lectine SNA de la plante se lie à l’acide sialique lié à a2-6.

Alors que la lectine végétale MALII se lie à l’acide sialique lié à a2-3. Les IgY polyclonales anti-Neu5Gc se lient aux sialoglycanes contenant Neu5Gc mais ne se lient pas aux sialoglycanes contenant Neu5Ac. Pour établir le profil des IgG anti-Neu5Gc, 12 sérums provenant de donneurs humains sains ont été analysés sur la puce sialoglycan imprimée et développés à l’aide d’IgG anti-humaines marquées par fluorescence en nanogrammes par microlitre.

Tous les sérums humains testés contenaient divers niveaux d’IgG anti-Neu5Gc avec presque aucune reconnaissance des paires appariées de sialoglycanes contenant du Neu5Ac. De plus, les modèles de reconnaissance des IgG anti-Neu5Gc sont très divers entre ces 12 sérums différents, tant au niveau d’intensité que de diversité. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de profiler les anticorps anti-Neu5Gc dans divers échantillons humains à haut débit, à l’aide d’un système de microréseaux de glycanes.