Name: Profilage anti-Neu5Gc IgG dans les sérums humains avec un dosage de microarray de sialoglycan (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Découvrez le profilage des IgG anti-Neu5Gc dans les sérums humains par dosage de microarray de sialoglycan. Cette méthode à haut débit permet d'étudier le rôle de ces anticorps dans le cancer et l'inflammation chronique.

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Ce travail a été soutenu en partie par un Prix de recherche sur le développement de carrière du Fonds de recherche sur le cancer d&#39;Israël, une subvention de l&#39;Initiative nationale de nanotechnologie israélienne et le Helmsley Charitable Trust pour une zone de technologie focale sur Nanomedicines pour les théranosites personnalisées (VP-K) et National Instituts de la subvention de santé R01GM076360 (à XC).

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Une fabrication réussie de microarray glycan nécessite une planification minutieuse et comprend plusieurs étapes importantes dans le protocole. Ceux-ci incluent: (1) la planification des dispositions de blocs et de plaques qui définissent tous les paramètres ultérieurs ( p. Ex. Distances, espacement, quantité d&#39;échantillons et impression); (2) nettoyer les broches et assurer l&#39;intégrité des broches, ce qui est essentiel pour contrôler l&#39;homogénéité des points; (3) maintenir une forte humidité pendan...

Sias sont des sucres acides couvrant les chaînes de glycan sur les glycoprotéines de la surface cellulaire et les glycolipides chez les vertébrés. L&#39;expression de Sia est modifiée dans les cellules cancéreuses 1 et est en corrélation avec la progression et / ou la métastase 2 , 3 . Deux des principales formes de Sia chez les mammifères sont Neu5Ac et sa forme hydroxylée, Neu5Gc 2 . Les humains ne peuvent pas synthétiser Neu5Gc en raison d&#39;une inactivation spécifique du gène codant pour l&#39;enzyme CMAH. Ce Sia non-humain incorpore métaboliquement dans les cellules humaines comme «soi», provenant d&#39;aliments riche en vitamines Neu5Gc ( p. Ex., Viande rouge) 4 , 5 . Neu5Gc est présent à des niveaux faibles sur les surfaces cellulaires de l&#39;épithélium humain et de l&#39;endothélium, mais il s&#39;accumule surtout dans les carcinomes. Neu5Gc est reconnu comme étranger par le système immunitaire humoral humain 2 , 6 .La complexité antigénique de Neu5Gc-glycans peut apparaître à plusieurs niveaux, y compris la modification de Neu5Gc, la liaison, les glycans sous-jacents et les échafaudages, et leur densité, tout en étant réfléchi par la complexité de la réponse des anticorps anti-Neu5Gc chez l&#39;homme 6 . Certains de ces anticorps servent de biomarqueurs de carcinome et d&#39;immunothérapies potentielles 7 . L&#39;apparition de la synthèse chimio-enzymatique de différents sialoglycans 8 a ouvert la voie à une analyse plus approfondie de ces anticorps, facilitée par l&#39;utilisation de la technologie de microarray glycan 9 , 10 . Ainsi, avec la préparation et la manipulation facilitées de grandes bibliothèques de glucides naturels et synthétiques, les microarrays de glycan sont devenus une puissante technologie à haut débit pour étudier les interactions des glucides avec une myriade de biomolécules 10 , 11 , </sup&gt; 12 , 13 . Dans un format de tableau, des quantités minimales de matériaux sont utilisées, et cet affichage multivalent de glycans biologiquement pertinents permet d&#39;étudier des milliers d&#39;interactions de liaison dans une seule expérience. Il est important de noter que cette technologie peut également être appliquée à la découverte de biomarqueurs et à la surveillance des réponses immunitaires dans divers échantillons 7 , 12 . La fabrication réussie de microarray de glycan exige la prise en compte de trois aspects importants: le type de robot de l&#39;imprimante, la chimie de la conjugaison du glycan et l&#39;optique de détection. En ce qui concerne la considération de l&#39;instrument d&#39;impression, deux techniques sont disponibles: les imprimantes sans contact et sans contact. Dans l&#39;impression par contact, 1 à 48 broches en acier sont plongés dans une plaque source multi-puits contenant une solution de glycan et sont repérés sur des lames de verre fonctionnalisées en contactant directement la surface de glissement en verre. La quantité de la solution est deLié à la glissière est une fonction de la durée persistante sur la surface de la glissière. Habituellement, les échantillons sont d&#39;abord pré-tachés sur un bloc de verre (pour atteindre des taches homogènes) avant d&#39;être imprimés sur la surface de glissement. Dans les imprimantes sans contact ( par exemple, l&#39;imprimante piézo-électronique), les glycanes sont imprimés à partir d&#39;un capillaire en verre à l&#39;aide de signaux électriques contrôlés. Le signal électrique peut être étalonné finement pour obtenir une impression plus précise par rapport à l&#39;impression par contact. La taille et la morphologie des taches sont également relativement plus homogènes. Un avantage supplémentaire est le recyclage de l&#39;échantillon à la plaque source après l&#39;impression. Néanmoins, l&#39;inconvénient majeur des imprimantes piézoélectriques est la limitation de l&#39;impression (4 ou 8), ce qui donne une durée d&#39;impression très longue, ce qui nécessite une attention particulière à la stabilité du glissement, à la température, à l&#39;humidité et à l&#39;évaporation de l&#39;échantillon. L&#39;imprimante jet d&#39;encre sans contact nécessite des volumes d&#39;échantillons plus importants 14 . <p clasS = &quot;jove_content&quot;&gt; Contrairement aux options disponibles limitées pour les méthodes d&#39;impression, la chimie de la conjugaison du glycan est une considération plus complexe, avec de nombreuses options à choisir. La chimie d&#39;immobilisation sélectionnée doit tenir compte à la fois des groupes actifs sur les glycanes et de la réactivité de la surface coulissante. Les glycanes à immobiliser sur une surface de microarray spécifique, synthétisée synthétiquement ou naturellement isolée, nécessitent tous un groupe réactif identique. De plus, les glycans doivent être purs et homogènes. D&#39;autre part, la surface d&#39;immobilisation et la chimie devraient fournir une reproductibilité et une densité d&#39;attache fiables. Des méthodes d&#39;immobilisation multiples ont été développées avec des attaches 10 , 11 , 12 , 13 covalentes ou non covalentes (absorption physique). Pour des informations très détaillées sur la technologie de microarray glycan imprimée pour les non-initiésD enquêteur, se référer à ces excellentes critiques 13 , 15 . Il est important de noter que les récentes informations minimales requises pour une initiative Glycomics Experiment (MIRAGE) décrivent les lignes directrices pour la préparation des échantillons 16 et pour la déclaration des données des analyses de microarrays glycaniques 17 pour améliorer les normes dans ce domaine en pleine croissance. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la fabrication de microarrays de sialoglycane à l&#39;aide d&#39;une nano-imprimante de contact spécifique au format 16 puits. Chacun des glycanes possède une amine primaire qui sert de médiation à leur liaison covalente aux glissières en verre à activation époxydique. Nous décrivons également le développement et l&#39;analyse d&#39;une diapositive en utilisant divers échantillons de sérums humains, des anticorps et des lectines de plantes liant le Sia. Les tests de microarray de sialoglycane comportent plusieurs étapes importantes qui incluent la fabrication, le traitement, le développement et l&#39;analyse de la matrice. La fabrication de tableau exige la planification de l&#39;arLa disposition des rayons, la préparation des glycans et de la plaque d&#39;origine, la programmation de la nano-imprimante et l&#39;impression des diapositives. Par la suite, les diapositives sont traitées, développées et analysées ( figure 1 ).

<table><tbody><tr><td>Sialoglycanes contenant des amines primaires</td><td>Glycohub, Inc., Davis, CA, États-Unis (http://www.glycohub.com/services)</td><td>Contactez info@glycohubusa.com pour les demandes de composés</td><td>Glycanes imprimés</td></tr><tr><td>Phosphate monosodique monohydraté</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Composant tampon d’impression</td></tr><tr><td>Phosphate disodique heptahydraté</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>Composant tampon d’impression</td></tr><tr><td>Phosphate solution saline tamponnée</td><td>Hy-Labs</td><td>BP-507/500D</td><td>Tampon d’impression / incubation / tampon de lavage</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Réactif de blocage</td></tr> de <tr><td>lames Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G-7893</td><td>Composant de tampon d’impression</td></tr><tr><td>Éthanolamine</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>0700/08</td><td>Réactif de blocage de lames</td></tr><tr><td>Ovalbumine (Grade V)</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td>Protéine bloquante de lames</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Détergent à laver à lames</td></tr><tr><td>Alexa 555-Hydrazide</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A20501MP</td><td>Marqueur sur matrice</td></tr><tr><td>ChromPure Human IgG, molécule entière</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>009-000-003</td><td>Composant d’impression</td></tr><tr><td>biotinylé - SNA</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1305</td><td>Lectine végétale &ndash ; liaison Sia-alpha2&ndash ; 6-lié</td></tr><tr><td>Biotinylated-MALII</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1265</td><td>Lectine végétale &ndash ; liaison Sia-alpha2&ndash ; 3-linked</td></tr><tr><td>Chicken-anti Neu5Gc IgY</td><td>BioLegend</td><td>146903</td><td>Détection primaire</td></tr><tr><td>Cy3-Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-0848</td><td>Liaison à la biotine</td></tr><tr><td>Cy3-anti IgG humaine</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>109-165-088</td><td>Détection secondaire contre les IgG humaines</td></tr><tr><td>Cy3-anti Chicken</td><td>IgY Jackson Immunoresearch</td><td>703-165-155</td><td>Secondaire détection contre les IgY</td></tr><tr><td>de poulet Échantillons de sérum humain</td><td>Banque</td><td></td> de sang israélienne <td>Détection primaire</td></tr><tr><td>Azote comprimé (grade 5)</td><td></td><td></td><td>Outil général de dépoussiérage/séchage</td></tr><tr><td>Lames revêtues d’époxy</td><td>Corning</td><td>40044</td><td>Lames</td></tr><tr><td>Lames revêtues d’époxy</td><td>PolyAn</td><td>2D 104-00-221</td><td>Diapositives. Dans ce type de lames, la surface est plus hydrophobe (par rapport aux lames de carottage), donc le tampon d’impression des glycanes devrait être complété par 0,005 % de Tween-20 pour obtenir 100 &micro ; Taches de taille M.</td></tr><tr><td>Plaque de microtitration à 384 puits</td><td>Genetix</td><td>2070</td><td>Plaque d’impression</td></tr><tr><td>Marqueur de laboratoire VWR</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td>Étiquetage</td></tr><tr><td>de lames Staining Tube</td><td>ArrayIt</td><td>MST</td><td>Outil de développement</td></tr><tr><td>de lames Bain de coloration</td><td>VWR</td><td>25608-904</td><td>Outil de développement de</td>diapositives</tr><tr><td>Supports de verre de diapositives</td><td>VWR</td><td>631-9321</td><td>Outil</td></tr> <tr><td>de développement de diapositivesGenePix</td><td>Scanner Molecular devices</td><td>4000B</td><td>Scanner de lames</td></tr><tr><td>LM-60 NanoPrinter</td><td>ArrayIt</td><td>LM-60</td><td></td></tr><tr><td>Array Printer Pins</td><td>ArrayIt</td><td>946MP3</td><td>Broches d’impression</td></tr><tr><td>ProPlate Module Grace</td><td>Bio-Labs</td><td>P37004</td><td>Module de développement de lames</td></tr><tr><td>Eau distillée</td><td>Bio-Lab</td><td>2321020500</td><td>Nécessaire pour arrayer et humidificateur</td></tr><tr><td>Multi Pippete électronique, 8 canaux, plage de volume 2-125 &mu ; L</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Matrix)</td><td>MA-2131 Impact2 Equalizer 384</td><td>Multi pippete pour la répartition des échantillons dans une plaque à 384 puits</td></tr></tbody></table>

profilage anti-neu5gc igg dans les sérums humains avec un dosage de microarray de sialoglycan

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay 

Les cellules sont recouvertes d&#39;un manteau de chaînes de glucides (glycans) qui est couramment modifié dans le cancer et qui comprend des variations dans l&#39;expression de l&#39;acide sialique (Sia). Ce sont des sucres acides qui ont un squelette à 9 atomes de carbone et qui captent des glycans vertébrés sur les surfaces cellulaires. Deux des principales formes de Sia chez les mammifères sont l&#39;acide N- acétylneuraminique (Neu5Ac) et sa forme hydroxylée, l&#39;acide N- glycolylneuraminique (Neu5Gc). Les humains ne peuvent pas produire Neu5Gc endogène en raison de l&#39;inactivation du gène codant pour l&#39;hydroxylase de la cytidine 5&#39;monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) (CMAH). L&#39;étranger Neu5Gc est acquis par les cellules humaines grâce à la consommation alimentaire de viande rouge et de produits laitiers et apparaît par la suite sur des glycans divers sur la surface de la cellule, s&#39;accumulant principalement sur les carcinomes. Par conséquent, les humains ont des anticorps anti-Neu5Gc circulants qui jouent divers rôles dans le cancer et d&#39;autres maladies chroniques menées par l&#39;inflammation et qui deviennent potentiellement diagnostiques et thérapeutiquesRgets. Ici, nous décrivons un dosage de microarray de sialoglycane à haut débit pour évaluer ces anticorps anti-Neu5Gc dans les sérums humains. Les glycans contenant Neu5Gc et leurs paires de témoins appariés (glycans contenant Neu5Ac), chacun avec une amine primaire centrale, sont liés de manière covalente aux glissières en verre revêtues d&#39;époxy. Nous illustrons l&#39;impression de 56 diapositives dans un format de 16 puits à l&#39;aide d&#39;une nano-imprimante spécifique capable de générer jusqu&#39;à 896 tableaux par impression. Chaque diapositive peut être utilisée pour cribler 16 échantillons de sérums humains différents pour l&#39;évaluation de la spécificité, de l&#39;intensité et de la diversité des anticorps anti-Neu5Gc. Le protocole décrit la complexité de cet outil robuste et fournit une ligne directrice de base pour ceux qui cherchent à étudier la réponse à l&#39;antigène carbohydrate alimentaire de Neu5Gc dans divers échantillons cliniques dans un format de tableau.

Impression, développement et analyse de tableaux: L&#39;impression d&#39;un microarray de sialoglycane avec de multiples échantillons de glycan et des courbes d&#39;IgG STD humaines dans 16 blocs différents nécessite un étalonnage complet pour s&#39;assurer que tous les échantillons sont imprimés aussi uniformément que possible dans les 16 blocs par diapositive et à toutes les diapositives dans le même tirage. Par conséquent, des...

Un dosage de microarray de sialoglycane peut être utilisé pour évaluer les anticorps anti-Neu5Gc dans des sérums humains, ce qui en fait un test de diagnostic potentiel à haut débit pour le cancer et d&#39;autres maladies chroniques à médiation par inflammation chronique.

Profilage anti-Neu5Gc IgG dans les sérums humains avec un dosage de microarray de sialoglycan

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

L’objectif global du test de micropuce à sialoglycane est d’évaluer les IgG anti-Neu5Gc dans le sérum humain à haut débit contre une collection diversifiée de sialoglycanes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la glycoimmunologie, telles que l’implication des anticorps anti-Neu5Gc dans diverses maladies humaines, notamment le cancer, les maladies cardiaques et la xénotransplantation. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un profilage à haut débit des anticorps anti-Neu5Gc contre une myriade d’antigènes sialoglycanes.La démonstration de la procédure sera assurée par Sharon Yehuda, une étudiante en master de mon laboratoire. Une planification minutieuse et détaillée de la fabrication et de l’agencement du réseau est importante pour assurer le succès. Ce processus est détaillé dans le protocole texte et les informations supplémentaires.Diluez chaque glycane à 100 micromolaires dans un volume total de 100 microlitres de tampon d’impression de glycanes dans des tubes de microcentrifugation. Ensuite, préparez l’amine primaire contenant un colorant fluorescent à un milligramme par millimètre avec un tampon de marqueur. Ensuite,

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Dans cette étude, nous décrivons un protocole amélioré pour une puce anticorps à haut débit multiplexées avec la méthode de détection lectine qui peut être utilisé dans le profilage de glycosylation des protéines spécifiques. Ce protocole propose de nouveaux réactifs fiables et réduit considérablement le temps, le coût et les besoins en équipement de laboratoire par rapport à la procédure précédente.

Microarray Anticorps chimiquement bloqué pour multiplexée à haut débit de profilage de glycosylation des protéines spécifiques dans les échantillons complexes

Cette vidéo présente la technologie de matrice de glycanes imprimée pour l’analyse des anticorps antiglycanes circulants dans le sérum de souris. Les anticorps contenus dans le sérum interagissent avec des glycanes spécifiques sur la puce, ce qui est confirmé par immunomarquage suivi d’un balayage par fluorescence.

Détection d’anticorps antiglycanes circulants à l’aide d’une matrice de glycanes imprimée

À l’aide d’une stratégie de microréseau de glycanes imprimée, un test conventionnel sur plaque à 96 puits a été miniaturisé pour l’analyse de l’avidité de l’hémagglutinine du virus de la grippe A et de la spécificité des récepteurs contenant de l’acide sialique.

A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l&#39;évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

Nous décrivons ici une méthode pour générer des microréseaux d’antigènes personnalisables qui peuvent être utilisés pour la détection simultanée d’auto-anticorps IgG et IgM sériques chez l’homme et la souris. Ces réseaux permettent une détection quantitative et à haut débit d’anticorps contre tout antigène ou épitope d’intérêt.

Génération de deux couleurs Antigène Microarrays pour la détection simultanée des IgG et IgM autoanticorps

Une approche modulaire de la synthèse des N- glycans à fixer sur un verre recouvert d’oxyde d’aluminium glisser (slide NOC) comme un microréseau glycane a été mis au point et son utilisation pour la détermination des caractéristiques d’un VIH largement anticorps neutralisant a été démontrée.

Synthèse de chimio-enzymatique des N- glycans pour le développement de la baie et anticorps anti-VIH de profilage

Ce travail montre le potentiel de la technologie de baies (PGA) de glycan imprimées pour l’analyse des anticorps anti-glucides chez de petits animaux en circulation.

Tableau de Glycan imprimé : Une Technique sensible pour l’analyse du répertoire des anticorps anti-glucides chez de petits animaux en circulation

Immunoglobulin G (IgG) N-glycanest caractérisé en utilisant la chromatographie d'interaction hydrophile UPLC. En outre, la structure de IgG N-glycan est clairement séparée. Présenté ici est une introduction à cette méthode expérimentale afin qu'il puisse être largement utilisé dans les milieux de recherche.

Immunoglobuline G N-Glycan Analysis par Ultra-Performance Liquid Chromatography

Le schéma de glycosylation d’un anticorps détermine ses performances cliniques, de sorte que les efforts industriels et académiques pour contrôler la glycosylation persistent. Étant donné que les campagnes typiques de glyco-ingénierie nécessitent beaucoup de temps et de main-d’œuvre, la génération d’un protocole rapide pour caractériser l’impact des gènes de glycosylation à l’aide d’un silence transitoire s’avérerait utile.

Glycoingénierie rapide des anticorps dans les cellules ovaires du hamster chinois

Le profilage des polymères par puces à ADN (MAPP) est une technique à haut débit pour l’analyse de la composition des glycanes dans les échantillons biologiques.

Profilage des polymères par puce à ADN (MAPP) pour l’analyse des glycanes à haut débit

Le critère de jugement principal dans les essais cliniques pour les maladies neuromusculaires est généralement amélioré la fonction musculaire. Par conséquent, l'évaluation de l'effet des composés thérapeutiques potentiels sur la performance musculaire pré clinique dans des modèles de souris est d'une grande importance. Nous décrivons ici plusieurs tests fonctionnels pour y remédier.

Évaluation de la performance fonctionnelle dans le<em&gt; MDX</em&gt; Modèle de souris

Découvrez le profilage des IgG anti-Neu5Gc dans les sérums humains par dosage de microarray de sialoglycan. Cette méthode à haut débit permet d'étudier le rôle de ces anticorps dans le cancer et l'inflammation chronique.

Profilage anti-Neu5Gc IgG dans les sérums humains avec un dosage de microarray de sialoglycan

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