Utilisation de capsules pour la coloration négative des échantillons viraux dans le cadre du suivi biologique

L'objectif général de cette méthode est de proposer une procédure simple et efficace de coloration négative en microscopie électronique en transmission (MET) pour des échantillons viraux en milieu de confinement biologique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles en virologie concernant la morphologie et la structure des virus étudiés. Le principal avantage de cette technique réside dans la facilité et l'efficacité avec lesquelles les grilles de microscopie électronique peuvent être manipulées en milieu de confinement biologique. Cette technique s'avère utile dans le cadre du diagnostic en MET d'un virus inconnu, car elle peut être facilement appliquée à des échantillons viraux dans tous les environnements. Bien que nous ayons principalement utilisé cette méthode pour faciliter l'étude des virus par MET, ses applications sont beaucoup plus larges et elle peut être employée dans l'analyse en microscopie électronique de la plupart des nanoparticules. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car il faut un certain entraînement pour s'assurer que les grilles de MET ne soient pas endommagées lors de leur chargement et de leur déchargement des capsules.

Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous rencontrions des difficultés à manipuler de petites grilles de microscopie électronique en confinement biologique.

Pour commencer cette procédure, préparez ou achetez des grilles en cuivre pour MET recouvertes de Formvar et de carbone. Insérez les grilles recouvertes dans des capsules. Ensuite, transférez les capsules chargées ainsi que les autres fournitures et réactifs vers une enceinte de confinement biologique. Commencez par fixer la capsule à une pipette. Aspirez 40 microlitres de suspension virale dans la capsule. Placez la pipette sur le côté, avec les grilles orientées horizontalement pendant 10 minutes. Ensuite, reprenez la pipette et éliminez la solution virale dans un récipient pour déchets. Aspirez 40 microlitres de fixateur au glutaraldéhyde à 2 % dans les capsules. Placez la pipette sur le côté pendant 20 minutes. Après cela, éjectez le fixateur et aspirez 40 microlitres d’eau déionisée dans la capsule afin d’éliminer le fixateur. Répétez ce lavage trois fois.

Ensuite, aspirez 40 microlitres de diacétate d'uranyle à 1 % ou d'acide phosphotungstique de potassium à 1 % dans la capsule. Laissez la capsule en contact pendant 30 secondes. Puis, retirez la capsule de la pipette.

Toucher un morceau de papier filtre sur le bord des grilles pour les sécher. Transférer le papier filtre dans un tube centrifuge de 15 millilitres. Ensuite, imbiber le papier filtre dans une solution d'osmium tétraoxyde à 1 %.

Placer la capsule avec le couvercle ouvert dans le tube. Sceller le tube pendant une heure afin de permettre une pénétration complète de la vapeur d'osmium tétraoxyde. Ensuite, décontaminer le tube et le transférer de la zone de confinement biologique vers l'installation de microscopie électronique de niveau BSL-2.

Retirez la capsule du tube de centrifugeuse, puis placez-la sur une pipette. Aspirez 40 microlitres d'eau déionisée dans la capsule, puis versez l'eau dans un récipient de déchets. Répétez ce rinçage à l'eau trois fois.

Ensuite, retirez la capsule de la pipette. À l'aide de papier filtre, séchez les grilles par absorption. Laissez les grilles sécher à l'air, puis rangez-les dans une boîte à grilles jusqu'au moment de réaliser l'imagerie en microscopie électronique en transmission (TEM).

Pour commencer, mélangez la suspension virale avec un volume égal de glutaraldéhyde à 4 % afin d'obtenir une concentration finale de glutaraldéhyde à 2 %. À l'aide du fixateur, inactiver le virus pendant au moins 24 heures. Désinfectez le tube et transférez-le dans l'installation de microscopie électronique de niveau de biosécurité 2 (BLS-2). Ensuite, fixez une grille chargée de capture à une pipette. Aspirez le mélange dans la capsule. Placez la pipette sur le côté, les grilles orientées horizontalement, pendant 10 minutes.

Ensuite, prenez la pipette et expulsez le mélange viral dans un contenant pour déchets. Aspirez 40 microlitres d'eau déionisée dans la capsule, puis jetez l'eau dans un contenant pour déchets. Répétez ce lavage trois fois.

Après cela, aspirez 40 microlitres de 1 % d'acide uranyle (UA) ou de 1 % de tungstophosphorique (PTA) dans la capsule pendant 30 secondes. Retirez la capsule de la pipette. À l’aide de papier filtre, séchez les grilles par tamponnement.

Ensuite, laissez sécher les grilles à l'air libre.

Dans cette étude, des échantillons du virus Ebola du Zaïre subissent une coloration négative, selon deux méthodes : la méthode manuelle par goutte et la méthode par capsule. Les images de microscopie électronique en transmission (MET) obtenues par ces deux méthodes montrent des détails nettement définis, avec des structures de nucléocapside situées au centre du virion et des glycoprotéines visibles à la surface. Ainsi, la méthode par capsule permet d'obtenir des images de MET d'une qualité comparable à celle obtenue par la méthode manuelle par goutte. Ensuite, différentes méthodes d'inactivation des échantillons sont comparées à l'aide du virus chikungunya. L'inactivation des échantillons est réalisée soit rapidement, en utilisant du glutaraldéhyde à 2 % pendant 20 minutes, suivi d'une exposition à l'osmotétraoxyde à 1 % pendant une heure, soit pendant une nuit, en utilisant du glutaraldéhyde à 2 % pendant 24 heures. Comme on peut le voir, le processus d'inactivation plus long, sans osmotétraoxyde, permet de visualiser davantage de détails ultrastructuraux.

Ensuite, en utilisant la méthode de la capsule, deux colorants ont été comparés à l'aide de particules pseudo-virales fixées par l'aldehyde. L'acétate d'uranyle et l'acide phosphotungstique fournissent tous deux des résultats de haute qualité, avec des bords bien définis et des glycoprotéines visibles.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure et demie, selon le nombre d'échantillons. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien choisir le fixateur et les réactifs de coloration adaptés à vos objectifs expérimentaux. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que le comptage de particules, peuvent être effectuées afin de répondre à d'autres questions en calculant les concentrations virales.

Cette technique améliore la manière dont les virologues peuvent explorer la morphologie virale et les informations structurelles plus facilement, en particulier pour les virus des niveaux BSL-3 et 4. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manipulation simple des grilles de MET pour la coloration négative en milieu de confinement biologique. N’oubliez pas que le travail avec l’aldéhyde, le tétraoxyde d’osmium et l’acétate d’uranyle peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l’utilisation d’équipements de protection individuelle adéquats et d’une hotte de chimie doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.