Utilisation de capsules pour la coloration négative des échantillons viraux dans le cadre du suivi biologique

L’objectif global de cette méthode est de fournir une procédure simple et efficace de coloration TEM négative pour les échantillons viraux dans le cadre du bioconfinement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en virologie sur la morphologie et les structures des virus étudiés. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une manipulation facile et efficace des grilles de microscopie électronique dans des environnements de bioconfinement.

Cette technique est utilisée dans le cadre du diagnostic TEM d’un virus inconnu car elle peut être facilement appliquée à des échantillons viraux dans tous les environnements. Bien que nous ayons principalement utilisé cette méthode pour aider aux études TEM virales, elle a une application beaucoup plus large et peut être utilisée dans l’étude EM de la plupart des nanoparticules. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront de la difficulté à s’assurer qu’il faut un peu de pratique pour s’assurer que les réseaux TEM ne sont pas endommagés lors du chargement et du déchargement des capsules.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avions des problèmes pour manipuler de petits réseaux EM en bioconfinement. Pour commencer cette procédure, préparez ou achetez des grilles en cuivre TEM virales et recouvertes de carbone. Insérez les grilles TEM revêtues dans des capsules.

Ensuite, transférez les capsules chargées avec d’autres fournitures et réactifs vers le bioconfinement. Pour commencer, fixez la capsule à une pipette. Aspirez 40 microlitres d’expansion virale dans la capsule.

Placez la pipette sur le côté, avec les grilles orientées horizontalement pendant 10 minutes. Ensuite, prenez la pipette et versez la solution virale dans une enceinte de confinement. Aspirez 40 microlitres de fixateur de glutaraldéhyde à 2 % dans les capsules.

Placez la pipette sur le côté pendant 20 minutes. Après cela, expulsez le fixateur et aspirez 40 microlitres d’eau désionisée dans la capsule, pour laver le fixateur. Répétez ce lavage trois fois.

Ensuite, aspirez 40 microlitres d’acétate d’uranyle à 1 % ou d’acide phosphotungstique à 1 % de potassium dans la capsule. Laissez la capsule reposer pendant 30 secondes. Ensuite, retirez la capsule de la pipette.

Touchez un morceau de papier filtre sur le bord des grilles pour sécher. Transférer le papier filtre dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Ensuite, trempez le papier filtre dans une solution de tétroxyde d’osmium à 1 %.

Placez la capsule avec le couvercle ouvert dans le tube. Scellez le tube pendant une heure pour permettre une imprégnation complète de la vapeur de tétroxyde d’osmium. Après cela, décontaminez le tube et transférez-le hors du confinement biologique vers l’installation EM BSL-2.

Retirez la capsule du tube à centrifuger, puis placez-la sur une pipette. Aspirez 40 microlitres d’eau désionisée dans la capsule, puis distribuez l’eau dans un récipient à déchets. Répétez ce lavage à l’eau trois fois.

Ensuite, retirez la capsule de la pipette. À l’aide de papier filtre, séchez les grilles par épongement. Laissez les grilles sécher à l’air, puis rangez-les dans une boîte de grille, jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à effectuer l’imagerie TEM.

Pour commencer, mélangez la suspension virale avec un volume égal de 4 % de glutaraldéhyde, pour obtenir une concentration finale de 2 % de glutaraldéhyde. À l’aide d’un fixateur, inactivez le virus pendant au moins 24 heures. Décontaminez le tube et transférez-le dans l’installation BLS-2 EM.

Après cela, fixez une capture chargée par grille à une pipette. Aspirez le mélange dans la capsule. Placez la pipette sur le côté avec les grilles orientées horizontalement pendant 10 minutes.

Ensuite, prenez la pipette et expulsez le mélange de virus dans un conteneur à déchets. Aspirez 40 microlitres d’eau désionisée dans la capsule, puis jetez l’eau dans un conteneur à déchets. Répétez ce lavage trois fois.

Après cela, aspirez 40 microlitres de 1 % QA ou 1 % PTA dans la capsule pendant 30 secondes. Retirez la capsule de la pipette. À l’aide de papier filtre, séchez les grilles par épongement.

Ensuite, laissez les grilles sécher à l’air. Dans cette étude, les échantillons du virus Ebola du Zaïre subissent une coloration négative, en utilisant à la fois la méthode manuelle des gouttelettes et la méthode des capsules. Les images TEM générées par ces méthodes montrent toutes deux des détails clairement définis, avec des structures de nucléocapside au centre de la varion et des glycoprotéines visibles à la surface.

Ainsi, la méthode de la capsule est capable de produire des images TEM de qualité similaire à celles produites par la méthode manuelle des gouttelettes. Ensuite, différentes méthodes d’inactivation d’échantillons sont comparées à l’aide du virus Chikungunya. L’inactivation de l’échantillon est réalisée soit rapidement, en utilisant du glutaraldéhyde à 2 % pendant 20 minutes, puis à l’eau au tétroxyde d’osmium à 1 % pendant une heure, soit pendant la nuit, en utilisant du glutaraldéhyde à 2 % pendant 24 heures.

Comme on peut le voir, le processus d’inactivation plus long sans tétroxyde d’osmium permet de voir plus de détails ultrastructurels. Ensuite, en utilisant la méthode de la capsule, deux colorants ont été comparés à l’aide de particules virales fixées à l’aldéhyde. L’acétate d’uranyle et l’acide phosphotungstique affichent tous deux des résultats de haute qualité, avec des frontières clairement définies et des glycoprotéines visibles.

Une fois maîtrisée, cette technique peut se faire en environ une heure et demie, en fonction du nombre d’échantillons. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de sélectionner les réactifs de fixation et de coloration appropriés pour vos objectifs expérimentaux. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme le comptage des particules peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires en calculant les concentrations de virus.

Cette technique améliore la façon dont les virologues peuvent explorer plus facilement la morphologie du virus et structurer les informations, en particulier dans les virus de niveau BLS-3 et 4. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de gérer facilement les grilles TEM pour la coloration négative dans le cadre du bioconfinement. N’oubliez pas que travailler avec de l’aldéhyde, du tétroxyde d’osmium et de l’acétate d’uranyle peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles qu’un équipement de protection individuelle approprié et une hotte chimique doivent toujours être utilisées lors de l’exécution de cette procédure.