Name: Utilisation de capsules pour la coloration négative des échantillons viraux dans le cadre du suivi biologique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Découvrez une méthode de coloration négative pour échantillons viraux en biocontainment utilisant des capsules innovantes. Cette technique simplifie la manipulation des grilles de microscopie électronique en laboratoire BSL-2, -3 ou -4.

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Nous tenons à remercier le Dr John Carra et Rowena Schokman pour la fourniture de Nano-VLP Ebola purifiés, le Dr Rajini Mudhasani pour la fourniture du virus Chikungunya et le Dr Charles (Jason) Shoemaker pour la fourniture de VLP à la leucémie murine exprimant les glycoprotéines d&#39;Ebolavirus. Nous tenons également à remercier MAJ Carl Soffler pour avoir facilité le programme de stages d&#39;été (SIP) et le Programme d&#39;apprentissage en sciences et en génie (SEAP) et la Dre Catherine Wilhelmsen pour la formation en sécurité de laboratoire.

1. Préparation de l&#39;expérience dans un environnement BSL-2 avant de travailler avec les échantillons de virus <ol><li> Préparez ou achetez des grilles de cuivre FORMvar et revêtues de carbone, habituellement 200-400 mesh. </li><li> Insérez les grilles TEM revêtues en capsules. <ol><li> Utilisez un objectif agrandi pour rendre ce processus facile à réaliser. Une ou deux grilles peuvent être insérées dans chaque capsule. Des capsules préchargées peuvent être achetées pour éliminer cette étape si vous le souhaitez. </li></ol></li><li> Transférez les capsules avec des grilles revêtues TEM insérées, ainsi que d&#39;autres fournitures et réactifs, au biocontainment où les virus seront colorés négativement. </li></ol> 2. La méthode de la capsule pour la coloration négative dans le développement biologique en utilisant du glutaraldéhyde aqueux et 1% d&#39;inactivation de vapeur de tétraxyde d&#39;osmium <ol><li> À l&#39;intérieur du BSC de biocontainment, aspirer 40 μL de suspension de virus dans la capsule attachée à une pipette. REMARQUE: la pipette reste attachée à laE capsule jusqu&#39;à ce que le processus soit terminé. La préparation des virus est conforme à notre publication précédente 14 . </li><li> Placez la pipette sur le côté pendant 10 min avec des grilles orientées horizontalement. Il s&#39;agit de favoriser une répartition uniforme des particules virales sur les grilles revêtues. </li><li> Inactive le virus dans la capsule à l&#39;intérieur du BSC biocontainment. <ol><li> Ramenez la pipette et appuyez sur le piston pour distribuer la solution de virus dans un récipient à déchets. </li><li> Aspirer 40 μL de fixateur à 2% de glutaraldéhyde dans les capsules. Attention: Le glutaraldéhyde est un produit chimique dangereux et nécessite une protection appropriée. Le glutaraldéhyde peut être utilisé pendant de courtes périodes dans un BSC normal, mais le réactif ouvert étendu nécessite de travailler dans un BSC canalisé ou une hotte chimique. </li><li> Placez la pipette sur le côté pendant 20 min. C&#39;est pour s&#39;assurer que les échantillons sont bien réparés. </li><li> Expulser le fixateur et aspirer 40 μL d&#39;eau DI dans les capsules à wCasser le fixateur. Répétez cette étape de lavage pour un total de 3 cycles de rinçage. </li></ol></li><li> Aspirer 40 μL de 1% d&#39;acétate d&#39;uranyle (UA) ou 1% d&#39;acide phosphotungstique de potassium (PTA) dans les capsules et laisser reposer pendant 30 s. NOTE: Le temps de coloration peut varier de 10 s à 1 min en fonction de l&#39;échantillon de virus. Attention: l&#39;UA est un émetteur alpha et une toxine cumulative. Manipulez-le avec une protection appropriée. </li><li> Retirez la capsule de la pipette et essorez les grilles en appuyant sur un morceau de papier filtre vers le bord des grilles pendant que les grilles restent dans la capsule. </li><li> Osmium Tetroxide Procédure d&#39;inactivation de la vapeur. <ol><li> Placez la capsule, avec le couvercle ouvert, dans un tube de centrifugation de 50 ml contenant du papier filtre trempé dans une solution de tétraxyde d&#39;osmium à 1%. Attention: le tétroxyde d&#39;osmium est extrêmement toxique avec une faible pression de vapeur. Il doit être utilisé dans un conduit BSC ou une hotte chimique. Manipulez-le avec une protection appropriée. Message d&#39;alerteInformations dans la zone de travail. </li><li> Sceller le tube de centrifugation de 50 ml pendant 1 h pour permettre une perméation complète de la vapeur de tétroxyde d&#39;osmium. Ensuite, décontaminez ensuite et transférez le tube hors du biocontainment à l&#39;installation de BSL-2 EM. </li></ol></li><li> Retirez les grilles EM de la capsule. <ol><li> Dans l&#39;installation EM BSL-2, retirez la capsule du tube de la centrifugeuse et placez-la sur une pipette. </li><li> Aspirer 40 μL d&#39;eau DI dans la capsule et distribuer l&#39;eau dans un récipient à déchets trois fois. </li><li> Retirez la capsule de la pipette et nettoyez les grilles à l&#39;aide de papier filtre pour toucher le bord des grilles. </li><li> Après séchage à l&#39;air, rangez les grilles pour l&#39;imagerie TEM ultérieure. </li></ol></li></ol> 3. La méthode de la capsule pour l&#39;inactivation dans le développement biologique avec 2% de glutaraldéhyde, suivie d&#39;une coloration négative dans un laboratoire BSL-2 <ol><li> Procédure d&#39;inactivation de virus. <ol><lI&gt; À l&#39;intérieur du BSC de biocontainment, mélanger bien la suspension de virus avec le même volume de glutaraldéhyde à 4% pour obtenir une concentration finale de 2% de glutaraldéhyde. Attention: Le glutaraldéhyde est un produit chimique dangereux et nécessite une protection appropriée. Le glutaraldéhyde peut être utilisé pendant de courtes périodes dans un BSC normal, mais le réactif ouvert étendu nécessite de travailler dans un BSC canalisé ou une hotte chimique. </li><li> Inactive les virus avec un fixateur pendant au moins 24 h avant l&#39;emballage, la décontamination et le transfère à l&#39;installation EM BSL-2. </li></ol></li><li> Dans l&#39;installation EM BSL-2, aspirer le virus et le mélange fixatif dans la capsule, contenant deux grilles de TEM, attachées à une pipette. </li><li> Placez la pipette horizontalement pendant 10 minutes avec les grilles orientées horizontalement. REMARQUE: il s&#39;agit de promouvoir une répartition uniforme des particules virales sur les grilles TEM. </li><li> Ramassez la pipette et appuyez sur le piston pour expulser le virus vers un conteneur de déchets. Aspirer 40 μL de dIL&#39;eau dans les capsules et l&#39;expulser dans le conteneur de déchets pour 3 cycles de rinçage. </li><li> Aspirer 40 μL de 1% d&#39;UA ou 1% de PTA dans les capsules pendant 30 s. NOTE: Le temps de coloration varie de 10 s à 1 min en fonction de l&#39;échantillon de virus. Attention: l&#39;UA est un émetteur alpha et une toxine cumulative. Manipulez-le avec une protection appropriée. </li><li> Retirez la capsule de la pipette et essuyez les grilles en touchant le bord des grilles sur un papier filtre. Séchez à l&#39;air les grilles et rangez-les pour l&#39;imagerie TEM ultérieure. </li></ol>

<ol><li>Gentile, M., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+in+rapid+viral+diagnosis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update.</a> New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).</li>
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</ol>

Les opinions, les interprétations, les conclusions et les recommandations énoncées dans l&#39;article sont celles des auteurs et ne sont pas nécessairement approuvées par l&#39;armée américaine ou le ministère de la Défense.

La coloration négative est une technique TEM précieuse pour évaluer et dimensionner les virus, les complexes protéiques et les nanoparticules. La préparation des gouttelettes de ces éprouvettes par déplacement manuel des grilles du réactif aux taches négatives a été le protocole classique depuis plus d&#39;un demi-siècle. C&#39;est un processus simple, mais nécessite une expertise acquise grâce à la formation pour réussir. Une excellente coloration négative est toujours considérée comme un ensemble de compétences à la f...

La microscopie électronique à transmission (TEM) est un outil efficace pour visualiser la morphologie et l&#39;ultrastructure des spécimens biologiques trop petits pour être vus avec un microscope optique traditionnel 1 , 2 , 3 , 4 . Les TEM tirent des électrons à travers un spécimen très mince produisant une image à résolution plus élevée puisque les électrons ont une longueur d&#39;onde beaucoup plus courte que la lumière. Les régions de l&#39;échantillon qui se plient ou bloquent des électrons apparaissent sombres, alors que les régions électronucléaires apparaissent blanches. Le manque de matière électronique dense rend les virus difficiles à voir sous un TEM car ils ne peuvent pas disperser les électrons. La coloration négative est la méthode la plus commune utilisée pour créer un contraste et afficher des virus avec TEM. La première procédure de coloration négative a été proposée par Brenner et Horne en 1959, sur la base d&#39;une expérience où Hall (1955) et Huxley (1957) ont observéL&#39;apparition de structures biologiques en contraste inverse lorsqu&#39;elles sont immergées dans une substance densément électronique 5 . Le processus de coloration négative n&#39;a pratiquement pas changé au cours du dernier demi-siècle. La coloration négative consiste à appliquer brièvement une solution de sel de métaux lourds à un échantillon sur une grille TEM afin d&#39;entourer le virus avec un matériau dense sans infiltrer le virus 6 . Cela crée une bordure sombre et révèle la forme de la particule 5 . Cette étude utilise deux réactifs pour la coloration négative, l&#39;acétate d&#39;uranyle (UA) et l&#39;acide phosphotungstique de potassium (PTA). Ces deux taches sont couramment utilisées pour tacher les petits échantillons biologiques, tels que les virus, les complexes protéiques et les nanoparticules 7 , 8 , 9 . La technique de coloration négative classique est la technologie manuelle de coloration négative des gouttelettesNique 7 . Cette méthode nécessite une manipulation précise des grilles TEM petites et fragiles avec des pinces pour appliquer de petites quantités d&#39;échantillons de virus, de taches et de rinçages. Le protocole de préparation typique implique l&#39;application d&#39;une gouttelette de suspension d&#39;échantillon sur la surface d&#39;une grille TEM revêtue de film ( figure 1A ). Après la fixation de l&#39;échantillon sur la surface du film, la grille est rincée pour éliminer les virus non adhérents et colorée avec UA ou PTA pendant quelques secondes à une minute, selon le type d&#39;échantillon. L&#39;excès de liquide est méchant de la grille en touchant un morceau de papier filtre au bord de la grille. La méthode manuelle de gouttelette exige que chaque grille soit faite individuellement. Si elles ne sont pas manipulées avec précaution, les grilles TEM revêtues sont facilement perforées, courbées ou contaminées. Le traitement de multiples échantillons peut entraîner des difficultés dans le suivi des grilles et une coloration uniforme pour chaque échantillon. Cette procédure de coloration manuelle est beaucoup plus dSi difficile lorsqu&#39;ils sont effectués dans des laboratoires de biocotour (BSL) -3 et -4 biocontainment, en raison de l&#39;équipement de protection individuelle nécessaire (EPI) requis pour ces environnements. L&#39;EPI est lourd et l&#39;environnement biocontainment est beaucoup plus turbulent par rapport à un laboratoire régulier. Le personnel travaillant dans les laboratoires de bioconfinement BSL-3 doit porter 2 paires de gants et travailler dans un cabinet de biosécurité (BSC). Cette double couche de gants réduit la sensibilité tactile et limite le mouvement du moteur. Le flux d&#39;air du BSC qui protège l&#39;utilisateur et contribue à prévenir la contamination de l&#39;échantillon peut provoquer une séchage trop rapide des échantillons et des taches, ce qui affecte la qualité de la tache. Le fort flux d&#39;air turbulent dans le BSC peut également épuiser rapidement une grille qui n&#39;est pas bien sécurisée. Dans les laboratoires de biocontainment BSL-4, il existe des exigences de sécurité supplémentaires. Le personnel doit porter une combinaison de pression positive, ce qui limite davantage le mouvement physique et la capacité de visualiser et de manipuler clairementGrilles ulateuses. Le technicien travaillant dans BSL-4 porte également au moins 2 paires de gants, la paire extérieure étant un gant épais qui réduit considérablement la dextérité et la sensation tactile. Enfin, les pinces utilisées pour traiter les grilles TEM sont nettes, ce qui pose un risque pour le technicien en raison de leur capacité à perforer les gants. Avec des capsules contenant des grilles, les pinces ne sont pas nécessaires, fournissant ainsi une alternative sans danger pour la manipulation des grilles dans le biocontainment. Enfin, les capsules fournissent également un moyen efficace de stocker les grilles pendant le traitement, la décontamination de la vapeur d&#39;osmium et pendant le stockage; Ce qui permet de garder les grilles organisées et à l&#39;abri des dégâts. Dans ce rapport, nous introduisons une nouvelle méthode pour les grilles TEM de coloration négative dans les laboratoires de biocontainment qui utilisent des capsules mPrep / g, un dispositif à base de capsules pour la manipulation du réseau et la coloration 10 , 11 , 12 . La capsule accomMode deux grilles de TEM, minimise la manipulation directe et réduit le risque de dégâts du réseau. La capsule s&#39;attache directement à une pipette à une ou plusieurs canaux de la même manière qu&#39;une pointe de pipette, ce qui permet l&#39;application de divers liquides dans des grilles contenues à l&#39;intérieur. Ceci permet la préparation simultanée d&#39;échantillons multiples avec des réseaux en double ( figure 1B ). Pour une coloration négative avec des capsules, l&#39;échantillon de virus est aspiré dans la capsule et maintenu pendant 10 minutes pour permettre aux virus d&#39;adsorber sur les surfaces de la grille. Les grilles avec le virus adsorbé sont ensuite lavées avec de l&#39;eau désionisée (DI) et colorées avec UA ou PTA pendant quelques secondes à 1 min. Ce processus utilise les mêmes étapes de protocole et réactifs que la méthode de gouttelettes manuelle; La différence étant que tous les travaux se produisent à l&#39;intérieur de la capsule sans manipulation physique des grilles. ( Figures 1C , 1D ). Le but de cette étude était d&#39;évaluer les capsules commeUne nouvelle méthode pour la coloration négative des échantillons de virus dans les environnements de biocontainment. Cette étude a également examiné la qualité des images TEM produites à partir de deux procédures d&#39;inactivation de virus différentes: 1) inactivation rapide, avec 1% de vapeur de tétroxyde d&#39;osmium, et 2) une inactivation de 24 h avec 2% de glutaraldéhyde. Les deux ont été conduits en utilisant les capsules. Enfin, nous avons évalué deux taches négatives couramment utilisées, UA et PTA, pour une utilisation dans la capsule. 13

<table><tbody><tr><td>Grilles TEM Formvar/carbone</td><td>SPI</td><td>3420C-MB</td><td>200 mesh Cu Pk/100</td></tr><tr><td>mPrep/g capsules</td><td>EMS</td><td>85010-01</td><td>boîte</td></tr><tr><td>mPrep/f coupleurs</td><td>EMS</td><td>85010-11</td><td>standard 16/Pk</td></tr><tr><td>glutaraldehdyde</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>solution à 50 %,</td></tr><tr><td>tétroxyde d’osmium</td> de qualité <td>EMS</td><td>19190</td><td>solution</td></tr> <tr>aqueuse à 4 %<td>Acétate d’uranyle</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>poudre</td></tr><tr><td>Acide phosphotungstique de potassium</td><td>EMS</td><td>19500</td><td></td></tr><tr><td>papier filtre</td> en poudre <td>Whatman</td><td>1450-090</td><td>taille 50</td></tr><tr><td>Microscope électronique à transmission</td><td>JEOL</td><td>JEM-1011</td><td>TEM</td></tr></tbody></table>

utilisation de capsules pour la coloration négative des échantillons viraux dans le cadre du suivi biologique

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

La microscopie électronique par transmission (TEM) est utilisée pour observer l&#39;ultrastructure des virus et d&#39;autres agents pathogènes microbiens avec une résolution nanométrique. La plupart des matériaux biologiques ne contiennent pas d&#39;éléments denses capables de diffuser des électrons pour créer une image; Par conséquent, une tache négative, qui place des sels de métaux lourds denses autour de l&#39;échantillon, est nécessaire. Afin de visualiser les virus en suspension sous TEM, ils doivent être appliqués sur de petites grilles revêtues d&#39;une surface transparente de seulement des nanomètres d&#39;épaisseur. En raison de leur faible taille et de leur fragilité, ces réseaux sont difficiles à manipuler et facilement déplacés par les courants d&#39;air. La surface mince est facilement endommagée, laissant l&#39;échantillon difficile ou impossible à l&#39;image. Les virus infectieux doivent être manipulés dans un cabinet de prévention des risques biotechnologiques (BSC) et certains nécessitent un environnement de laboratoire de biocontainment. La coloration des virus dans les niveaux de biosécurité (BSL) -3 et -4 est particulièrement difficile car ces environnements sont plus turbulents et des techniciens sont nécessaires tO porter un équipement de protection individuelle (EPI), ce qui diminue la dextérité. Dans cette étude, nous avons évalué un nouveau dispositif pour aider à la coloration négative des virus dans le biocontainment. L&#39;appareil est une capsule qui fonctionne comme une pointe de pipette spécialisée. Une fois que les grilles sont chargées dans la capsule, l&#39;utilisateur élimine simplement les réactifs dans la capsule pour délivrer le virus et les taches à la grille encapsulée, éliminant ainsi la manipulation par l&#39;utilisateur des grilles. Bien que cette technique ait été conçue spécifiquement pour une utilisation dans BSL-3 ou -4 biocontainment, elle peut faciliter la préparation des échantillons dans n&#39;importe quel environnement de laboratoire en permettant une coloration négative facile du virus. Cette même méthode peut également être appliquée pour préparer des échantillons TEM colorés négatifs de nanoparticules, de macromolécules et de spécimens semblables.

La méthode de la capsule produit une coloration négative de bonne qualité pour l&#39;imagerie TEM: Tout d&#39;abord, nous avons évalué la qualité des images générées en utilisant à la fois la méthode de gouttelette manuelle et les méthodes de capsule pour la coloration négative du ebolavirus Zaire. Les ebolavirus sont membres de la famille Filoviridae , ainsi que le virus de Marburg. L&#39;ebolavirus a généralement un di...

Ce protocole fournit des instructions pour les échantillons de virus à coloration négative qui peuvent être facilement utilisés dans les laboratoires BSL-2, -3 ou -4. Il comprend l&#39;utilisation d&#39;une capsule de traitement innovante, qui protège la grille de microscopie électronique de transmission et fournit à l&#39;utilisateur une manipulation plus facile dans les environnements les plus turbulents au sein du biocontainment.

Utilisation de capsules pour la coloration négative des échantillons viraux dans le cadre du suivi biologique

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

L'objectif général de cette méthode est de proposer une procédure simple et efficace de coloration négative en microscopie électronique en transmission (MET) pour des échantillons viraux en milieu de confinement biologique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles en virologie concernant la morphologie et la structure des virus étudiés. Le principal avantage de cette technique réside dans la facilité et l'efficacité avec lesquelles les grilles de microscopie électronique peuvent être manipulées en milieu de confinement biologique. Cette technique s'avère utile dans le cadre du diagnostic en MET d'un virus inconnu, car elle peut être facilement appliquée à des échantillons viraux dans tous les environnements. Bien que nous ayons principalement utilisé cette méthode pour faciliter l'étude des virus par MET, ses applications sont beaucoup plus larges et elle peut être employée dans l'analyse en microscopie électronique de la plupart des nanoparticules. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car il faut un certain entraînement pour s'assurer que les grilles de MET ne soient pas endommagées lors de leur chargement et de leur déchargement des capsules.Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous rencontrions des difficultés à manipuler de petites grilles de microscopie électronique en confinement biologique. Pour commencer cette procédure, préparez ou achetez des grilles en cuivre pour MET recouvertes de Formvar et de carbone. Insérez les grilles recouvertes dans des capsules. Ensuite, transférez les capsules chargées ainsi que les autres fournitures et réactifs vers une enceinte de confinement biologique. Commencez par fixer la capsule à une pipette. Aspirez 40 microlitres de suspension virale dans la capsule. Placez la pipette sur le côté, avec les grilles orientées horizontalement pendant 10 minutes. Ensuite, reprenez la pipette et éliminez la solution virale dans un récipient pour déchets. Aspirez 40 microlitres de fixateur au glutaraldéhyde à 2 % dans les capsules. Placez la pipette sur le côté pendant 20 minutes. Après cela, éjectez le fixateur et aspirez 40 microlitres d’eau déionisée dans la capsule afin d’éliminer le fixateur. Répétez ce lavage trois fois.Ensuite, aspirez 40 microlitres de diacétate d'uranyle à 1 % ou d'acide phosphotungstique de potassium à 1 % dans la capsule. Laissez la capsule en contact pendant 30 secondes. Puis, retirez la capsule de la pipette.Toucher un morceau de papier filtre sur le bord des grilles pour les sécher. Transférer le papier filtre dans un tube centrifuge de 15 millilitres. Ensuite, imbiber le papier filtre dans une solution d'osmium tétraoxyde à 1 %.Placer la capsule avec le couvercle ouvert dans le tube. Sceller le tube pendant une heure afin de permettre une pénétration complète de la vapeur d'osmium tétraoxyde. Ensuite, décontaminer le tube et le transférer de la zone de confinement biologique vers l'installation de microscopie électronique de niveau BSL-2.Retirez la capsule du tube de centrifugeuse, puis placez-la sur une pipette. Aspirez 40 microlitres d'eau déionisée dans la capsule, puis versez l'eau dans un récipient de déchets. Répétez ce rinçage à l'eau trois fois.Ensuite, retirez la capsule de la pipette. À l'aide de papier filtre, séchez les grilles par absorption. Laissez les grilles sécher à l'air, puis rangez-les dans une boîte à grilles jusqu'au moment de réaliser l'imagerie en microscopie électronique en transmission (TEM).Pour commencer, mélangez la suspension virale avec un volume égal de glutaraldéhyde à 4 % afin d'obtenir une concentration finale de glutaraldéhyde à 2 %. À l'aide du fixateur, inactiver le virus pendant au moins 24 heures. Désinfectez le tube et transférez-le dans l'installation de microscopie électronique de niveau de biosécurité 2 (BLS-2). Ensuite, fixez une grille chargée de capture à une pipette. Aspirez le mélange dans la capsule. Placez la pipette sur le côté, les grilles orientées horizontalement, pendant 10 minutes.Ensuite, prenez la pipette et expulsez le mélange viral dans un contenant pour déchets. Aspirez 40 microlitres d'eau déionisée dans la capsule, puis jetez l'eau dans un contenant pour déchets. Répétez ce lavage trois fois.Après cela, aspirez 40 microlitres de 1 % d'acide uranyle (UA) ou de 1 % de tungstophosphorique (PTA) dans la capsule pendant 30 secondes. Retirez la capsule de la pipette. À l’aide de papier filtre, séchez les grilles par tamponnement.Ensuite, laissez sécher les grilles à l'air libre. Dans cette étude, des échantillons du virus Ebola du Zaïre subissent une coloration négative, selon deux méthodes : la méthode manuelle par goutte et la méthode par capsule. Les images de microscopie électronique en transmission (MET) obtenues par ces deux méthodes montrent des détails nettement définis, avec des structures de nucléocapside situées au centre du virion et des glycoprotéines visibles à la surface. Ainsi, la méthode par capsule permet d'obtenir des images de MET d'une qualité comparable à celle obtenue par la méthode manuelle par goutte. Ensuite, différentes méthodes d'inactivation des échantillons sont comparées à l'aide du virus chikungunya. L'inactivation des échantillons est réalisée soit rapidement, en utilisant du glutaraldéhyde à 2 % pendant 20 minutes, suivi d'une exposition à l'osmotétraoxyde à 1 % pendant une heure, soit pendant une nuit, en utilisant du glutaraldéhyde à 2 % pendant 24 heures. Comme on peut le voir, le processus d'inactivation plus long, sans osmotétraoxyde, permet de visualiser davantage de détails ultrastructuraux. Ensuite, en utilisant la méthode de la capsule, deux colorants ont été comparés à l'aide de particules pseudo-virales fixées par l'aldehyde. L'acétate d'uranyle et l'acide phosphotungstique fournissent tous deux des résultats de haute qualité, avec des bords bien définis et des glycoprotéines visibles.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure et demie, selon le nombre d'échantillons. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien choisir le fixateur et les réactifs de coloration adaptés à vos objectifs expérimentaux. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que le comptage de particules, peuvent être effectuées afin de répondre à d'autres questions en calculant les concentrations virales.Cette technique améliore la manière dont les virologues peuvent explorer la morphologie virale et les informations structurelles plus facilement, en particulier pour les virus des niveaux BSL-3 et 4. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manipulation simple des grilles de MET pour la coloration négative en milieu de confinement biologique. N’oubliez pas que le travail avec l’aldéhyde, le tétraoxyde d’osmium et l’acétate d’uranyle peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l’utilisation d’équipements de protection individuelle adéquats et d’une hotte de chimie doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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