Isolement et caractérisation des primaires de Rat vanne cellules interstitielles : un nouveau modèle pour étudier la Calcification de la Valve aortique

L’objectif global de ce protocole est d’isoler les cellules interstitielles de la valve du rat ou VIC afin d’étudier les mécanismes de la maladie calcifiante de la valve aortique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la calcification valvulaire, telles que pourquoi les CIV se calcifient-ils et ce que nous pouvons pour empêcher ces cellules de se calcifier. Les principaux avantages de cette technique sont l’accessibilité et le potentiel de transformation en lignées cellulaires pour des études ultérieures.

Effectuer toutes les dissections dans une hotte ventilée préalablement désinfectée à 70 % d’éthanol pour assurer la stérilité des échantillons et des réactifs. Stérilisez les outils de dissection en les autoclave, puis immergez les pointes des outils dans un bécher contenant 70 % d’éthanol avant utilisation. Faites tremper les outils de dissection dans des béchers de tampon de lavage avant d’entrer en contact avec l’animal ou les tissus.

Après avoir abattu les rats comme décrit dans le protocole de texte, placez l’animal en décubitus dorsal sur une planche de dissection en verre et désinfectez la peau en pulvérisant de l’éthanol à 70 %. Pour disséquer le cœur, faites une incision de quatre centimètres dans la ligne médiane du rat à l’aide de ciseaux de dissection pour exposer la cavité abdominale, et retirez soigneusement la cage thoracique et les poumons pour exposer le cœur. Retirez le cœur à l’aide d’une paire de ciseaux bien aiguisés.

Conservez le cœur disséqué dans un tampon de lavage glacé jusqu’à ce que toutes les dissections grossières des rats soient terminées. Pour microdisséquer chaque cœur, transférez le cœur disséqué dans une boîte de Pétri recouverte d’un tampon de lavage. Coupez le muscle cardiaque avec une paire de ciseaux droits à ressort pour être un gauche avec une petite zone entourant l’aorte ascendante et la racine aortique.

À l’aide des mêmes ciseaux droits à ressort, ouvrez soigneusement l’aorte ascendante vers le ventricule gauche et exposez les feuillets de la valve aortique. Ensuite, transférez l’aorte ouverte dans une boîte de Pétri fraîche et stérile remplie de la solution saline équilibrée de Hank. Disséquez les feuillets de la valve aortique marqués par leur forme en U unique à la base de l’aorte avec une paire de ciseaux Vannas.

Conservez tous les feuillets dans un millilitre de tampon de lavage glacé dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre jusqu’à ce que toutes les dissections soient terminées. Une fois que toutes les folioles ont été récoltées, centrifugez-les à 100 g pendant une minute à quatre degrés Celsius pour éliminer le tampon de lavage. Pour éliminer les cellules endothéliales valvulaires ou VEC, digérez les feuillets dans 100 microlitres de 425 unités par millilitre de Collagénase II pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Perturbez la digestion en pipetant doucement de haut en bas à l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres. Centrifuger à 100g pendant 30 secondes pour granuler les feuillets. Après avoir soigneusement jeté le surnageant, lavez les feuillets avec 500 microlitres de tampon de lavage et granulez à nouveau les cellules par centrifugation à 100 g pendant 30 secondes.

Pour récolter les CIV des folioles, digérer avec 100 microlitres de Collagenase II pendant 1,5 à deux heures à 37 degrés Celsius. Relâchez ensuite les VIC en pipetant doucement de haut en bas à l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres. Diluez la collagénase II dans 19 millilitres de milieu de culture et centrifugez-la à 670 g pendant cinq minutes pour granuler les CIV et les débris restants de la valve Leaf.

Après avoir jeté le surnageant, transférez les feuillets et les CIV dans des plaques ou des flacons de culture. Cultivez les CIV pendant cinq à sept jours dans un milieu de culture jusqu’à ce que la confluence soit atteinte à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de CO2, en changeant le milieu après 72 heures. Pour préparer des CIV primaires de rat pour des expériences de calcification in vitro, ensemencez les cellules à une densité de 150 000 cellules par puits dans des plaques à six puits.

Maintenir les cellules dans le milieu de culture jusqu’à ce que la confluence soit supérieure à 90 %. Traitez les CIV avec un agent de calcification par rapport au milieu témoin et incubez à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de CO2 pendant 72 heures supplémentaires. Pour étudier les CIV primaires calcifiées du rat en vue d’analyses ultérieures en aval, retirez le milieu de calcification ou de contrôle.

Laver les monocouches avec un tampon de lavage pour éliminer les ions calcium et phosphate non liés avant d’effectuer la caractérisation CIV du rat, comme indiqué dans le protocole de texte. Pour les études de calcification de la CIV chez le rat, colorez les monocouches cellulaires avec une solution de rouge d’alizarine S à 5 %, en les balançant doucement sur un agitateur pendant 20 minutes. Ensuite, lavez-vous trois fois à l’eau distillée pendant cinq minutes à chaque fois.

Pour quantifier les dépôts de calcium, utilisez un kit de dosage biochimique du calcium. Imprégnez les ions calcium de l’acide chlorhydrique 0,6 molaire pendant 24 heures à quatre degrés Celsius avec une légère agitation. Récoltez le surnageant et mesurez la concentration de calcium à l’aide d’une trousse de dosage du calcium en suivant les directives du fabricant.

Enfin, calculez la concentration de calcium en fraction de la protéine cellulaire totale, comme décrit dans le protocole textuel. Le phénotype VIC des cellules isolées a été confirmé par immunofluorescence, en sondant les marqueurs VIC, la vimentine et l’actine alpha du muscle lisse. De plus, l’expression du régulateur de croissance de la VIC, les facteurs de croissance tissulaire bêta-1 et 2, a été confirmée par analyse PCR.

Une analyse par transfert Western a également été effectuée pour vérifier que les CIV de rat étaient négatives pour le marqueur de cellules endothéliales CD 31, en utilisant les VEC mitrales canines comme témoin positif. Les CIV de rats ont été exposés à des niveaux élevés de calcium et de phosphate, qui imitent des conditions pathologiques d’hypercalcémie et d’hyperphosphatémie. Le traitement des CIV avec une calcification induite par le calcium et le phosphate, déterminée par coloration au rouge d’alizarine pour le dépôt de calcium et détermination colorimétrique des niveaux de calcium après lixiviation à l’acide chlorhydrique.

Le traitement des CIV avec du calcium et du phosphate a induit une augmentation significative de l’expression de l’ARNm des marqueurs ostéogéniques MSX2, ALPL et PHOSPHO1. Une fois maîtrisée, cette technique peut se faire en une à deux heures, hors digestion pour 18 feuillets valvulaires. Lors de cette procédure, il est important d’assurer la stérilité pendant la dissection et la digestion.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les CIV primaires de rat et de les utiliser pour étudier les mécanismes à l’origine de la calcification des CIV. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la cytométrie en flux et l’analyse microscopique peuvent être effectuées afin d’étudier la physiologie et le comportement des VIC. Après son développement, cette technique peut ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche cardiovasculaire pour explorer les mécanismes de classification des valves aortiques chez l’homme à l’aide du modèle du rat.