Axée sur la transformée de Fourier Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

L’objectif global de cette analyse de diffraction basée sur Fourier est de caractériser la locomotion de C elegans en temps réel lorsque l’espèce se déplace librement dans un espace tridimensionnel. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie en décrivant les réponses des espèces à différentes densités de mutants de solution ou locomoteurs. Cette méthode sert de référence pour l’analyse de Fourier des espèces microscopiques.

Il a l’avantage que chaque espèce microscopique aura son propre spectre de Fourier unique. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la locomotion de C elegans, elle peut également être appliquée à d’autres micro-organismes. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à trouver le nématode dans la cuvette, sous le faisceau laser, peut être difficile.

Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode en essayant d’apprendre le comportement de nage à partir du signal de diffraction temporelle, lui-même, un signal bruyant. Pour commencer, fixez un laser à hélium au néon près du coin arrière gauche de l’établi optique et connectez-le à une source d’alimentation. Placez un filtre à densité neutre entre le laser et l’emplacement de l’échantillon, de sorte que le faisceau laser traverse le filtre avant d’atteindre l’échantillon.

À l’aide de deux rétroviseurs directionnels en aluminium à l’avant, construisez un périscope en fixant le premier miroir après le filtre à densité neutre. Ensuite, fixez le deuxième miroir à environ 10 centimètres sous le premier miroir pour laisser de la place pour diriger le faisceau laser. Insérez une cuvette entre les miroirs et alignez le faisceau laser et la cuvette de sorte que le faisceau laser se déplace verticalement à travers la cuvette.

Ensuite, fixez la photodiode directement en face du deuxième miroir afin que son capteur fasse face au miroir. Ensuite, placez une cuvette remplie d’eau sur un support. Ajustez la hauteur du support et les angles des miroirs un et deux de sorte que le faisceau laser traverse la cuvette et soit dirigé à proximité, mais pas directement, de la photodiode.

Utilisez un levier pour vous assurer que le support forme une surface plane pour la cuvette. Si le support n’est pas de niveau, effectuez les réglages appropriés jusqu’à ce qu’il soit de niveau. Enfin, connectez la photodiode à l’oscilloscope numérique à l’aide du câble USB fourni et connectez-la à l’ordinateur.

Chargez le logiciel de l’oscilloscope et réglez la fréquence d’échantillonnage sur au moins huit hertz pour résoudre suffisamment le cycle de destruction du ver. À l’aide d’un pic mince et aplati en fil de platine, transférez quatre nématodes adultes dans une plaque de Pétri fraîche remplie de gélose NGM. Ensuite, retirez une cuvette en plastique jetable de son emballage, en prenant soin de ne toucher la cuvette que par ses côtés striés.

Ensuite, à l’aide d’une micropipette, pipetez l’eau distillée dans une cuvette jusqu’à ce que la cuvette soit remplie à environ 80 % d’eau distillée. Placez la boîte de Pétri contenant le C elegans sous une lunette de dissection. Ensuite, utilisez le pic en platine pour retirer un C elegans mature de la boîte de Pétri et immergez-le dans la cuvette.

Déplacez la pioche en cercles pour déloger le nématode si nécessaire. Manipulez les nématodes avec précaution et ne secouez pas la cuvette. En secouant la cuvette, vous risquez de ne pas réagir aux vers.

Pour éviter la formation de bulles dans la cuvette, remplissez la cuvette d’eau distillée jusqu’à ce qu’elle bouge légèrement sur le dessus de la cuvette. Ensuite, remplissez le bouchon d’eau et placez-le rapidement sur la cuvette. À l’aide de papier pour lentilles, retirez toutes les gouttelettes d’eau qui auraient pu se déverser sur la cuvette.

De plus, utilisez du papier pour lentille pour éliminer les petites gouttelettes restantes. Allumez le laser au néon à hélium et ajustez le réglage de fréquence pour qu’il produise un faisceau rouge. Ensuite, allumez le capteur.

Tenez la cuvette sur ses côtés striés et inclinez-la doucement jusqu’à ce que le nématode soit à peu près au centre de la cuvette. Ensuite, placez la cuvette sur le support du système optique, en centrant la vis sans fin dans le faisceau laser se déplaçant du miroir un au miroir deux. Ensuite, placez la photodiode dans le motif de diffraction de sorte que l’emplacement de la photodiode et le maximum central du motif de diffraction ne coïncident pas.

Ensuite, faites pivoter les filtres de densité neutre de manière à ce qu’il y ait une tension de sortie notable de la photodiode. Assurez-vous de limiter la lumière à l’aide du filtre à densité neutre, pour éviter que la photodiode ne soit saturée. Une ligne plate indique une sursaturation ou un manque d’intensité.

Une fois que le motif de diffraction en mouvement est visible, collectez des données avec la photodiode en cliquant sur le bouton de démarrage du logiciel, en contrôlant l’oscilloscope tout en surveillant le mouvement du ver. Continuez à prendre des mesures jusqu’à ce que la vis sans fin se déplace hors du faisceau laser et que le motif de diffraction disparaisse. Si la cuvette est rayée, jetez-la ainsi que le ver et recommencez.

Après environ 20 secondes, arrêtez le processus de collecte de données en cliquant sur le bouton d’arrêt du logiciel de l’oscilloscope. Enregistrez les données de chaque essai au format texte, séparé par des virgules. Recueillir au moins 50 ensembles de données pour chaque phénotype et utiliser huit à 10 animaux par essai.

Des exemples de mouvement séquentiel modélisé de la vis sans fin et des modèles de diffraction correspondants sont présentés ici. Les motifs de diffraction modélisés ressemblent qualitativement aux modèles expérimentaux et indiquent que la simulation a réussi à modéliser le nématode. De plus, la signature de diffraction temporelle du rouleau et du c elegans de type sauvage peut être montrée quantitativement.

Comme on le voit ici, chaque nématode se débat à des rythmes et des amplitudes différents. Les transformées de Fourier numériques moyennes permettent d’identifier le nématode par l’amplitude de son spectre de fréquence de diffraction. Le spectre des vers sauvages est dominé par des fréquences plus basses que le spectre du mouvement des rouleaux.

Voici un exemple de l’oscillation w qui peut être considérée comme deux mouvements de mer opposés. En revanche, le rouleau formera principalement un c d’un côté et apparaîtra comme ceci. En examinant les fréquences, le mouvement w est plus complexe, révélant plus de basses fréquences secondaires que le mouvement c.

Une fois maîtrisé, un ensemble de données peut être collecté en deux minutes environ si la technique est correctement exécutée. Il faut environ 20 à 30 minutes pour configurer l’optique d’une série d’ensembles de données. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de manipuler les C elegans avec précaution, afin de préserver l’intégrité de leur locomotion.

Suite à cette procédure, nous pouvons appliquer d’autres méthodes telles qu’une reconstruction de tracteur et une analyse non linéaire pour en savoir plus sur le mouvement de C elegans. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs en neurobiologie pour étudier plus en profondeur les mutants locomoteurs chez C elegans. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une assez bonne compréhension de la façon de générer des motifs de diffraction pour les nématodes vivants et de la façon de les analyser.

N’oubliez pas que travailler avec des lasers peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que ne pas faire voyager les lasers à hauteur des yeux doivent être prises lors de l’exécution de la procédure.