Simple élimination de Fluorescence de fond dans les tissus cérébraux humains fixés au formol pour la microscopie en Immunofluorescence

Un problème courant en microscopie à immunofluorescence est la présence d’une fluorescence de fond endogène qui peut interférer avec votre signal. Dans de nombreux cas, cette autofluorescence peut rendre vos résultats ininterprétables. Dans ce protocole, nous montrerons comment éliminer l’autofluorescence d’échantillons de tissu cérébral humain en utilisant le photoblanchiment avec une lampe de bureau LED commerciale.

Les principaux avantages de ces méthodes sont les économies significatives par rapport aux techniques actuelles sans sacrifier l’efficacité et le fait qu’aucun composé exogène n’est introduit dans l’échantillon. Avant de commencer, préparez des solutions mères de solution saline tris-tamponnée, de TBS et d’azoture de sodium à 10 %. Pour chaque trois lames de microscope de taille standard que vous souhaitez traiter, vous aurez besoin d’une seule boîte de Pétri de 100 millimètres sur 100 millimètres carrés comme chambre à lames.

Pour chaque chambre de diapositives, préparez 50 millilitres d’azoture à 05 % dans du TBS en ajoutant 25 millilitres d’azoture de sodium à 50 millilitres d’une fois TBS. Créez un échafaudage pour élever votre chambre de diapositives de manière à ce qu’une tête de lampe puisse s’adapter en dessous. Pour une boîte de Pétri de 100 millimètres carrés, un récipient alimentaire en plastique de taille similaire peut être coupé à la forme.

Tout ce qui peut élever en toute sécurité la chambre des lames sans empêcher la lumière d’atteindre les échantillons peut être utilisé. Procurez-vous une lampe de bureau LED au phosphore blanc et retirez tous les diffuseurs ou le plastique opaque qui recouvrent la source lumineuse. Orientez le réseau de LED vers le haut.

À cet effet, il est recommandé d’utiliser une lampe à col flexible. Construisez un dôme réfléchissant pour l’appareil en éclairant l’intérieur d’une boîte suffisamment grande pour couvrir les chambres de diapositives et l’échafaudage avec une feuille d’aluminium. Pour une seule chambre, une boîte à pointes de pipette d’un millimètre peut être utilisée.

Pour cette vidéo, le tissu cérébral du gyri orbital orbital FTLD-T humain fixé au formol a été soumis au prétraitement de photoblanchiment. Les procédures de préparation des tissus et de coloration des acides aminés peuvent varier en fonction de la source, de la fixation et de l’enrobage de vos coupes de tissus. Dans une chambre froide, une armoire froide ou un réfrigérateur à quatre degrés Celsius, placez la lampe sous l’échafaudage et la chambre d’échantillonnage sur le dessus de l’échafaudage.

Remplissez la chambre d’échantillonnage avec 50 millilitres d’azoture TBS. Immergez des coupes de tissu de 10 micromètres d’épaisseur montées sur des lames de microscope en verre standard dans la chambre d’échantillonnage à l’aide d’une pince propre. Couvrez l’appareil avec le dôme réfléchissant et allumez la lampe LED.

Laissez les échantillons photoblanchir pendant 48 heures. Ce temps d’incubation peut varier en fonction de l’intensité de la lampe et de la quantité de matériau autofluorescent dans le tissu. Après le prétraitement de photoblanchiment, les lames peuvent être immunomarquées avec un protocole standard pour vos tissus et protéines d’intérêt spécifiques.

À des fins de démonstration, le tissu cérébral FTLD-T a été coloré pour la protéine tau phosphorylée à l’aide d’anticorps secondaires conjugués à Alexa 488 et Texas Red. Le DAPI a été utilisé comme contre-colorant nucléaire. Préparez 500 millilitres de tampon de récupération d’antigène, 500 millilitres de Triton X-100 à 0,025 % dans du TBS, 10 millilitres d’albumine sérique bovine à 1 %, BSA, dans le TBS, et deux millilitres de solution bloquante, composée de sérum de chèvre ajouté à du BSA TBS.

Effectuez le prélèvement de l’antigène en immergeant les lames photoblanchies dans un tampon de prélèvement d’antigène dans un collecteur de lames. Chauffez le collecteur à 90 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois que le collecteur a été retiré du traitement thermique, il est important de laisser la chambre refroidir à température ambiante pendant 30 minutes.

Le retrait immédiat des lames entraînera le dessèchement des sections. Préparez votre mélange d’anticorps primaires selon les recommandations du fabricant. Dans ce cas, l’anticorps anti-phospho PHF tau p-sérine 202 plus thréonine 205 AT8 a été dilué un sur 100 avec BSA TBS et laissé sur la glace.

150 microlitres de mélange d’anticorps sont nécessaires par section. Une fois que les sections ont refroidi pendant 30 minutes, transférez les lames du collecteur de récupération d’antigène dans un bocal de coloration rempli de TBS Triton. Lavez les lames dans cette solution pendant cinq minutes en les secouant doucement.

Videz et remplacez le TBS Triton pour répéter cette étape de lavage une deuxième fois. Après le lavage, retirez les lames du pot de coloration et évacuez tout excès de tampon. À l’aide d’un stylo hydrophobe, tracez un contour autour du tissu.

Cela empêchera vos solutions de s’écouler de la glissière. Veillez à ne pas laisser les lames se dessécher. Bloquez le tissu en pipetant 200 microlitres de solution de blocage sur les lames et placez-les à l’intérieur d’une chambre humidifiée.

Cette chambre peut être quelque chose d’aussi simple qu’un support coulissant à l’intérieur d’une boîte à pointes de pipette contenant une serviette en papier humide. Assurez-vous que tout l’échantillon de tissu est recouvert d’une solution de blocage. Incuber à température ambiante pendant deux heures.

Retirer la solution bloquée à l’aide d’un aspirateur ou d’une pipette. Pipeter 100 à 150 microlitres de mélange d’anticorps primaires sur les lames. Assurez-vous que tout l’échantillon est recouvert d’une solution d’anticorps et que les sections sont maintenues sur une surface plane pour éviter une accumulation inégale d’anticorps.

Incuber avec l’anticorps primaire à quatre degrés Celsius pendant la nuit dans une chambre humidifiée. Le lendemain, préparez le mélange d’anticorps secondaires. Dans ce cas, l’anti-souris caprine Alexa 488 et l’anti-souris chèvre Texas Red ont été dilués une sur 100 à l’aide de BSA TBS.

Récupérez les coupes de tissu et retirez la solution d’anticorps primaire à l’aide d’un aspirateur ou d’une pipette. Lavez les lames deux fois de la même manière qu’auparavant à l’aide d’un pot de coloration rempli de TBS Triton pendant cinq minutes à chaque lavage. Après le lavage, évacuez tout excès de tampon.

Pipeter 100 à 150 microlitres de solution secondaire d’anticorps, en s’assurant une fois de plus que l’échantillon de tissu est complètement couvert. Incuber pendant deux heures à température ambiante dans la chambre humidifiée dans l’obscurité. Préparez une contre-coloration DAPI de 0,1 microgramme par millilitre dans le TBS selon les recommandations du fabricant ou une dilution en série.

Assurez-vous de bien mélanger la solution mère DAPI en raison d’une éventuelle insolubilité. Récupérez les lames et retirez le mélange d’anticorps secondaires. Lavez les échantillons deux fois, mais au lieu d’utiliser du TBS Triton, utilisez du TBS ordinaire.

Aspirez ou pipetez la solution de lavage restante et pipetez 100 à 150 microlitres de colorant DAPI sur vos sections de tissus. Incuber à l’obscurité à température ambiante pendant 10 minutes. Récupérez les échantillons et lavez-les trois fois avec du TBS ordinaire au lieu de deux.

Après le lavage, retirez soigneusement la solution de lavage restante. Appliquer le support de montage. Complétez le montage des diapositives en recouvrant les échantillons avec des lamelles de verre.

Évitez les bulles en plaçant un bord du couvercle glisser vers le bas et en abaissant très lentement le bord opposé à l’aide d’une pince. Laissez sécher le support de montage avant de le stocker à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Les diapositives sont maintenant prêtes à être visualisées.

Les paramètres de la microscopie à fluorescence varient en fonction des fluorophores utilisés pour la coloration et du microscope. Allumez la lampe à fluorescence, le microscope et l’ordinateur, et laissez la lampe se réchauffer pendant 15 minutes. Placez les lames de tissu coloré dans le microscope à fluorescence.

Utilisez le champ clair pour localiser le tissu à un grossissement de 10 fois. Une fois qu’une région appropriée du tissu est localisée, ajoutez une goutte d’eau sur le couvercle de l’échantillon. Passez à un objectif à immersion dans l’eau 20 fois.

Sélectionnez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission laser appropriées pour chaque fluorophore dans des pistes séparées pour un meilleur signal. Vous trouverez de plus amples détails sur les paramètres et les longueurs d’onde utilisés dans le manuscrit ci-joint. Ajustez les paramètres de puissance et de gain du laser pour optimiser l’intensité du signal pour chaque piste.

Une fois que les paramètres et le champ de vision appropriés sont trouvés, enregistrez une image composite contenant les données de fluorescence de chaque piste. Pour visualiser l’intensité de la fluorescence dans chaque canal, installez la macro Outils de profil RVB pour ImageJ. Ouvrez le fichier d’image confocale lsm dans ImageJ et convertissez les images composites des trois piles en RVB en allant dans l’outil Image, Couleur, Canal.

Sélectionnez Composite et vérifiez les trois canaux. Ensuite, allez dans Image, Type et Couleur RVB. Sélectionnez l’icône Outils de profil RVB et tracez une ligne sur la section de l’image à profiler.

Dans cette vidéo, les étapes pour effectuer un prétraitement par photoblanchiment d’échantillons de tissus afin de produire une fluorescence de fond ont été décrites. Cette procédure peut être ajoutée à n’importe quel protocole standard d’aminofluorescence avant la récupération de l’antigène et la coloration des aminés. L’appareil utilisé pour le photoblanchiment est peu coûteux et facile à obtenir, composé de composants prêts à l’emploi.

Les LED au phosphore blanc émettent de la lumière sur un large spectre de longueurs d’onde, ce qui les rend parfaitement adaptées au photoblanchiment à large plage. À l’aide d’une lampe de bureau LED facilement disponible, des échantillons de tissus cérébraux humains FTLD-T non colorés ont été photoblanchis et imagés en utilisant les longueurs d’onde qui seraient appropriées si ces échantillons étaient colorés avec Texas Red et Alexa 488. Les échantillons non traités présentaient de grandes quantités d’autofluorescence.

En revanche, le photoblanchiment a entraîné une réduction significative de l’intensité des taches d’autofluorescence qui ressemblaient à de la lipofuscine, ainsi que de la fluorescence de fond générale. Pour une validation plus poussée de cette technique, des échantillons de tissu cérébral FTLD-T ont été colorés pour la protéine tau hyperphosphorylée, une protéine qui se replie mal et s’accumule dans cette maladie sous forme de corps d’inclusion distincts. Deux anticorps secondaires différents ont été appliqués pour mieux distinguer le marquage tau et la fluorescence non spécifique.

Dans ces images composites, la colocalisation d’Alexa 488 et de Texas Red est représentée en jaune, ce qui représente la protéine tau correctement colorée. L’apparition de régions rouges ou vertes indique soit une fluorescence non spécifique, soit une extinction de l’un des chromophores. Dans l’échantillon témoin non traité, un bruit de fond significatif et un signal non spécifique peuvent être observés, en particulier dans le canal Texas Red.

Le prétraitement par photoblanchiment ainsi que l’application d’un produit chimique permettent de réduire considérablement le signal de fond. Si nous divisons les canaux de fluorescence et regardons les images sous un grossissement plus élevé, des observations plus détaillées peuvent être faites. Le témoin non traité possède une fluorescence de fond dans tous les canaux, ainsi que des caractéristiques non spécifiques, principalement dans le canal Texas Red, qui ont une intensité similaire à celle du marquage spécifique de la protéine tau.

Si les corps d’inclusion tau n’avaient pas une morphologie distincte et prévisible, ces résultats de Texas Red auraient pu être mal interprétés en raison de la présence de ces caractéristiques autofluorescentes. Le prétraitement par photoblanchiment abolit complètement ces caractéristiques non spécifiques du Texas Red, tout en préservant la majorité des signaux spécifiques au Texas Red et à l’Alexa 488. Le photoblanchiment, cependant, semble avoir peu d’effet sur la fluorescence de fond DAPI.

L’extinction chimique a réduit la fluorescence de fond dans le canal Alexa 488 tout aussi efficacement que le photoblanchiment. Cependant, il a également réduit les intensités de fluorescence du DAPI et du Texas Red, suggérant la présence d’une extinction contre-productive. La quantification de ces effets peut être observée dans les profils de signaux.

Comme vous pouvez le constater, cette méthode produit des images nettes sans caractéristiques confondantes. Ce prétraitement de photoblanchiment peut être incorporé dans n’importe quel protocole d’aminofluorescence standard pour éliminer l’autofluorescence et générer des résultats de haute qualité et sans ambiguïté.