Simple élimination de Fluorescence de fond dans les tissus cérébraux humains fixés au formol pour la microscopie en Immunofluorescence

Un problème courant en microscopie en immunofluorescence est la présence d'une fluorescence de fond endogène pouvant interférer avec votre signal. Dans de nombreux cas, cette autofluorescence peut rendre vos résultats impossibles à interpréter. Dans ce protocole, nous démontrerons comment éliminer l'autofluorescence de prélèvements de tissu cérébral humain en utilisant un éclaircissement photochimique (photoblanchiment) avec une lampe de bureau à LED commerciale.

Les principaux avantages de cette méthode sont les économies de coûts significatives par rapport aux techniques actuelles, sans compromettre l'efficacité, et le fait qu'aucun composé exogène n'est introduit dans l'échantillon. Avant de commencer, préparez des solutions mères de tampon salin au tris à une concentration fois, TBS, et d'azoture de sodium à 10 %. Pour chaque lot de trois lames microscopiques de taille standard que vous souhaitez traiter, vous aurez besoin d'une seule boîte de Pétri carrée de 100 millimètres sur 100 millimètres servant de chambre à lames.

Pour chaque chambre à lame, préparez 50 millilitres de NaN₃ 0,5 % dans du TBS en ajoutant 25 millilitres d'azoture de sodium à 10 % à 50 millilitres de TBS 1×. Confectionnez un support permettant d'élever votre chambre à lame afin qu'une tête de lampe puisse passer en dessous. Pour une boîte de Pétri carrée de 100 millimètres, un récipient en plastique de taille similaire peut être découpé à la forme souhaitée.

Tout ce qui peut élever en toute sécurité la chambre à lame sans entraver la lumière atteignant les échantillons peut être utilisé. Procurez-vous une lampe de bureau à LED au phosphore blanc et retirez tous les diffuseurs ou plastiques opaques qui recouvrent la source lumineuse. Orientez le réseau de LED vers le haut.

À cette fin, une lampe dotée d'un col flexible est recommandée. Construisez un couvercle réflecteur en forme de dôme pour l'appareil en recouvrant l'intérieur d'une boîte assez grande pour couvrir les chambres à lame et l'échafaudage avec du papier d'aluminium. Pour une seule chambre, on peut utiliser une boîte destinée aux embouts de pipette de un millimètre.

Pour cette vidéo, un tissu cérébral humain de circonvolution frontale orbitaire atteint de FTLD-T, fixé au formol, a subi un prétraitement par photoblanchiment. La préparation du tissu et les procédures de coloration des amines peuvent varier selon la source, la fixation et l'inclusion de vos coupes de tissu. Dans une chambre froide, une armoire réfrigérée ou un réfrigérateur à quatre degrés Celsius, placez la lampe sous le support et la chambre d'échantillonnage au-dessus du support.

Remplissez la chambre d'échantillonnage avec 50 millilitres de TBS azoté. Immergez des sections de tissu de 10 micromètres d'épaisseur montées sur des lames de microscope en verre standard dans la chambre d'échantillonnage à l'aide de pinces propres. Recouvrez l'appareil avec le dôme réfléchissant et allumez la lampe LED.

Laisser les échantillons s'éclaircir à la lumière pendant 48 heures. Ce temps d'incubation peut varier selon l'intensité de la lampe et la quantité de matériau autofluorescent présent dans le tissu. Après le traitement préalable d'éclaircissement à la lumière, les lames peuvent être immunomarquées selon un protocole standard adapté à votre tissu et aux protéines d'intérêt spécifiques.

À des fins de démonstration, un tissu cérébral atteint de DTFL-T a été coloré pour la protéine tau phosphorylée à l'aide d'anticorps secondaires conjugués à l’Alexa 488 et au Texas Red. Le DAPI a été utilisé comme contre-coloration nucléaire. Préparez 500 millilitres de tampon de récupération d'antigène, 500 millilitres de Triton X-100 à 0,025 % dans du TBS, 10 millilitres d'albumine sérique bovine (BSA) à 1 % dans du TBS, et deux millilitres de solution de blocage, composée de sérum de chèvre ajouté au TBS contenant de la BSA.

Réaliser la récupération de l'antigène en immergeant les lames photodécolorées dans un tampon de récupération de l'antigène placé dans un collecteur de lames. Chauffer le collecteur à 90 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois le collecteur retiré du traitement thermique, il est important de laisser la chambre refroidir à température ambiante pendant 30 minutes.

Retirer immédiatement les lames provoquera le dessèchement des sections. Préparez le mélange d'anticorps primaire selon les recommandations du fabricant. Dans ce cas, l'anticorps anti-phospho PHF tau p-sérine 202 et thréonine 205 AT8 a été dilué au 1/100 dans du TBS contenant de l'albumine de sérum bovin (BSA) et placé sur de la glace.

150 microlitres de mélange d'anticorps sont nécessaires par section. Après que les sections aient refroidi pendant 30 minutes, transférez les lames depuis le récipient de récupération d'antigène vers un bocal de coloration rempli de TBS Triton. Lavez les lames dans cette solution pendant cinq minutes avec un agitation douce.

Videz et remplacez le Triton TBS pour répéter cette étape de lavage une deuxième fois. Après le lavage, retirez les lames du bocal de coloration et absorbez tout excès de tampon. À l’aide d’un stylo hydrophobe, tracez un contour autour du tissu.

Cela empêchera vos solutions de s'écouler hors de la lame. Veillez à ne pas laisser les lames sécher. Bloquez le tissu en ajoutant 200 microlitres de solution de blocage sur les lames à l’aide d’une pipette et placez-les dans une chambre humidifiée.

Cette chambre peut être aussi simple qu'un porte-lame placé à l'intérieur d'une boîte de pointes de pipette contenant une serviette en papier humide. Veillez à ce que l'échantillon de tissu entier soit recouvert de la solution de blocage. Incuber à température ambiante pendant deux heures.

Éliminer la solution de blocage à l’aide d’un aspirateur ou d’une pipette. Déposer 100 à 150 microlitres de mélange d’anticorps primaire sur les lames. Veiller à ce que l’échantillon entier soit recouvert de la solution d’anticorps et à ce que les coupes soient maintenues sur une surface plane afin d’éviter une accumulation inégale d’anticorps.

Incuber avec l'anticorps primaire à quatre degrés Celsius toute la nuit dans une chambre humide. Le lendemain, préparer le mélange d'anticorps secondaire. Dans ce cas, les anticorps secondaires anti-souris provenant de chèvre Alexa 488 et anti-souris provenant de chèvre Texas Red ont été dilués au 1/100 à l'aide de BSA TBS.

Récupérez les sections de tissu et retirez la solution d'anticorps primaire à l'aide d'un aspirateur ou d'une pipette. Lavez les lames deux fois de la même manière qu'auparavant, en utilisant un bocal de coloration rempli de TBS Triton pendant cinq minutes par lavage. Après le lavage, éliminez tout excès de tampon par mèche.

Prélève 100 à 150 microlitres de solution d'anticorps secondaire, en veillant une fois de plus à ce que l'échantillon de tissu soit entièrement recouvert. Incube pendant deux heures à température ambiante dans une chambre humide à l'abri de la lumière. Prépare une contre-coloration au DAPI à 0,1 microgramme par millilitre dans du TBS selon les recommandations du fabricant ou par dilution sérielle.

Veillez à bien mélanger la solution mère de DAPI en raison d'une éventuelle insolubilité. Récupérez les lames et éliminez le mélange d'anticorps secondaire. Lavez les échantillons deux fois, mais utilisez du TBS simple au lieu du TBS Triton.

Aspirez ou pipetez le reste de la solution de lavage et ajoutez 100 à 150 microlitres de colorant DAPI sur vos sections de tissu. Incubez à l’abri de la lumière à température ambiante pendant 10 minutes. Récupérez les échantillons et effectuez trois lavages avec du TBS simple au lieu de deux.

Après le lavage, retirez soigneusement la solution de lavage restante. Appliquez le milieu de montage. Terminez le montage de la lame en recouvrant les échantillons avec des lamelles en verre.

Évitez les bulles en posant un bord de la lame couvre-objet et en abaissant très lentement le bord opposé à l’aide de pinces. Laissez sécher le milieu de montage avant de stocker à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. Les lames sont maintenant prêtes à être visualisées.

Les paramètres de la microscopie à fluorescence varieront selon les fluorochromes utilisés pour la coloration et le microscope. Allumez la lampe à fluorescence, le microscope et l'ordinateur, puis laissez la lampe chauffer pendant 15 minutes. Placez les lames de tissu colorées dans le microscope à fluorescence.

Utilisez le champ clair pour localiser le tissu à un grossissement de 10 fois. Une fois qu'une région appropriée du tissu est localisée, ajoutez une goutte d'eau sur la lame couvre-objet de l'échantillon. Passez à un objectif à immersion dans l'eau avec un grossissement de 20 fois.

Sélectionnez des longueurs d'onde d'excitation laser et d'émission adaptées à chaque fluorophore sur des pistes séparées pour obtenir le meilleur signal. Des détails supplémentaires sur les paramètres et les longueurs d'onde utilisés sont disponibles dans l'article accompagnant ce manuscrit. Ajustez la puissance du laser et les réglages de gain pour optimiser l'intensité du signal pour chaque piste.

Une fois les paramètres appropriés et le champ de vision trouvés, enregistrez une image composite contenant les données de fluorescence de chaque piste. Pour visualiser l'intensité de fluorescence dans chaque canal, installez la macro RGB Profile Tools pour ImageJ. Ouvrez le fichier d'image confocale lsm dans ImageJ et convertissez les images composites des trois piles en RVB en allant dans Image, Couleur, Outil des canaux.

Sélectionnez Composite et cochez les trois canaux. Ensuite, accédez à Image, Type et Couleur RVB. Sélectionnez l'icône Outils de profil RVB et tracez une ligne à travers la section de l'image à profiler.

Dans cette vidéo, les étapes nécessaires pour effectuer un traitement préalable par photobléaching d'échantillons de tissus afin de produire une fluorescence de fond ont été décrites. Cette procédure peut être ajoutée à tout protocole standard de fluorescence au niveau des amines avant la récupération de l'antigène et la coloration amine. L'appareil utilisé pour le photobléaching est peu coûteux et facilement accessible, composé d'éléments disponibles dans le commerce.

Les DEL à phosphore blanc émettent de la lumière sur un large spectre de longueurs d'onde, ce qui les rend très adaptées à la photoblanchiment sur large gamme. À l'aide d'une lampe de bureau DEL facilement disponible, des échantillons de tissu cérébral humain atteint de FTLD-T non colorés ont été photoblanchis et imagés en utilisant les longueurs d'onde appropriées si ces échantillons avaient été colorés avec du Texas Red et de l’Alexa 488. Les échantillons non traités présentaient de fortes quantités d'autofluorescence.

En revanche, le photoblanchiment a entraîné une réduction significative de l'intensité des taches de fluorescence spontanée ressemblant à de la lipofuscine, ainsi qu'une diminution générale de la fluorescence de fond. Pour une validation supplémentaire de cette technique, des échantillons de tissu cérébral atteint de FTLD-T ont été marqués pour la protéine tau hyperphosphorylée, une protéine qui se replie de manière anormale et s'accumule dans cette maladie sous forme de corps d'inclusion distincts. Deux anticorps secondaires différents ont été utilisés afin de mieux distinguer le marquage de la protéine tau de la fluorescence non spécifique.

Dans ces images composites, la colocalisation d'Alexa 488 et de Texas Red est montrée en jaune, ce qui représente la protéine tau correctement marquée. L'apparition de régions rouges ou vertes indique soit une fluorescence non spécifique, soit l'extinction de l'un des chromophores. Dans l'échantillon témoin non traité, un fond important et un signal non spécifique sont visibles, particulièrement dans le canal Texas Red.

Le prétraitement par photobléaching, ainsi que l'application d'un inhibiteur chimique, entraînent une réduction importante du signal de fond. Si nous séparons les canaux de fluorescence et observons les images à un grossissement plus élevé, des observations plus détaillées peuvent être effectuées. Le témoin non traité présente une fluorescence de fond dans tous les canaux, ainsi que des signaux non spécifiques, principalement dans le canal Texas Red, dont l'intensité est similaire à celle du marquage spécifique de la protéine tau.

Si les corps d'inclusion de la protéine tau n'avaient pas une morphologie distincte et prévisible, ces résultats obtenus avec le Texas Red auraient pu être interprétés de façon erronée en raison de la présence de ces caractéristiques autofluorescentes. Le prétraitement par photoblanchiment élimine complètement ces signaux non spécifiques du Texas Red, tout en préservant la majorité des signaux spécifiques de la protéine tau marquée au Texas Red et à l’Alexa 488. Toutefois, le photoblanchiment semble avoir peu d'effet sur la fluorescence de fond du DAPI.

Le réducteur chimique a diminué la fluorescence de fond dans le canal Alexa 488 aussi efficacement que le photoblanchiment. Toutefois, il a également réduit les intensités de fluorescence du DAPI et du Texas Red, suggérant la présence d'un effet de réduction contre-productif. La quantification de ces effets est visible dans les profils de signal.

Comme vous pouvez le constater, cette méthode produit des images nettes, exemptes de caractéristiques perturbatrices. Ce prétraitement par photoblanchiment peut être intégré à n'importe quel protocole standard de fluorescence aminée afin d'éliminer l'autofluorescence et d'obtenir des résultats de haute qualité, sans ambiguïté.