Une méthode Standard pour examiner la mutagénicité sur place en fonction de la Mutation ponctuelle de réparation catalysée par CRISPR/Cas9 et SsODN dans les cellules humaines

L’objectif global de cette procédure expérimentale est de définir une approche fondamentale dans une méthodologie détaillée pour mesurer l’hétérogénéité génétique au site cible de manière fiable et robuste. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’édition génomique, telles que : comment la mutagenèse sur site peut-elle être analysée et mesurée. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthodologie standardisée pour la réparation dirigée par homologie ou la correction génique à l’aide d’oligonucléotides simple brin.

Pour commencer le protocole, cultivez HTT11619 cellules dans 25 millilitres de milieu préalablement préparé pour la culture de cellules HTT116 dans une fiole T-175. Aspirez le milieu et lavez les cellules avec la solution saline tamponnée au phosphate de dulbecco ou PBS, sans calcium ni magnésium, puis aspirez le PBS. Ensuite, ajoutez la trypsine goutte à goutte dans la fiole T-175, à l’aide d’une pipette de cinq millilitres.

Laissez les cellules se détacher dans un incubateur. Tapotez le ballon pour déloger les alvéoles, puis trempez-les avec les huit millilitres de milieu complet sur toute la surface du ballon. Ensuite, pipetez le mélange de haut en bas plusieurs fois pour briser les amas de cellules et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres.

Avant de faire tourner les cellules, prenez 10 microlitres du tube conique de 15 millilitres et combinez-le avec 10 microlitres de bleu trypan pour compter les cellules, puis granulez les cellules. Transférez 10 microlitres de cellules mélangées à du bleu de trypan dans l’hémocytomètre et comptez les quatre grilles autour de l’extérieur. Pour chaque plaque de 10 centimètres de cellules à synchroniser, ajoutez cinq millilitres de milieu complet et six micromolaires d’aphidicoline.

Ensuite, transférez 100 microlitres de pastille de cellule remise en suspension dans chaque plaque d’un centimètre et faites tourner doucement la plaque pour mélanger. Incuber les plaques pour synchroniser les cellules à la frontière G1S. Quatre heures avant le ciblage, aspirez le support, lavez-le avec du PBS.

Aspirez le PBS et ajoutez cinq millilitres de milieu complet. Remettez l’assiette dans l’incubateur pendant quatre heures. Entrez la séquence du gène EGFP mutant dans le générateur en ligne Zane Labs et choisissez les séquences guides CRISPR qui se lient à proximité du site cible.

Mélangez l’ARN à des concentrations molaires égales à 45 micromolaires. Ajoutez 6,75 microlitres d’un stock de 200 micromolaires d’ARN CR et 6,75 microlitres d’un stock de 200 micromolaires d’ARN traceur dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 16,50 microlitres de tampon IDT pour obtenir un volume final de 30 microlitres.

Ensuite, chauffez le mélange à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, dans une machine PCR. Laissez les échantillons refroidir à température ambiante. Pour chaque échantillon, diluez 2,22 microlitres d’ARN CR en complexe d’ARN traceur et 2,78 microlitres de tampon IDT pour obtenir un volume final de cinq microlitres.

Diluer 1,67 microlitre de protéine Cas9 à partir d’un stock de 60 micromolaires dans 3,33 microlitres de milieu à faible sérum, jusqu’à un volume final de cinq microlitres. Mélangez cinq microlitres de protéine Cas9 avec cinq microlitres d’ARN complexe. Aspirez le milieu, lavez avec cinq millilitres de PBS.

Aspirez le PBS et ajoutez un millilitre de trypsine préchauffée dans chaque plaque de 10 centimètres. Mettez les plaques dans l’incubateur. Ensuite, tapotez sur la plaque de 10 centimètres pour vous assurer que toutes les cellules sont délogées, puis trempez-les avec quatre millilitres de milieu complet, en le dispersant sur toute la surface de la plaque.

Pipette de haut en bas plusieurs fois pour briser les amas de cellules et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Réservez 10 microlitres du tube conique de 15 millilitres et combinez-le avec 10 microlitres de bleu trypan pour compter les cellules. Granulez les cellules en les faisant tourner pendant cinq minutes à 125 x G à température ambiante.

Aspirez le milieu et lavez-le avec cinq millilitres de PBS. Écorchez les cellules en faisant tourner 125 x G pendant cinq minutes à température ambiante. Transférez 100 microlitres de suspension de cellule dans chaque cuvette d’électroporation à quatre millimètres d’espace.

Ajoutez 10 microlitres du complexe RNP à 100 microlitres de cellules, à une densité de cellules de 5 x 10 à la cinquième cellule. Ajoutez deux ODN micromolaires à chaque échantillon. Ensuite, apportez le rack à une machine d’électroporation.

Effleurez légèrement chacun des échantillons et placez-les dans la chambre. Remettez le support dans la hotte et transférez chaque échantillon dans un puits contenant deux millilitres de milieu complet dans une plaque à six puits. Incuber la plaque avant de vérifier les niveaux de correction.

Aspirez le milieu et lavez les cellules avec deux millilitres de PBS. Remplacez le PBS par 500 microlitres de trypsine préchauffée dans chaque puits de la plaque à six puits. Placez les plaques dans l’incubateur.

Ensuite, tapotez la plaque pour vous assurer que toutes les cellules sont délogées, puis trempez avec un millilitre de milieu complet en le dispersant sur toute la surface du puits. Passez les cellules dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre et des granulés. Après avoir granulé les cellules, aspirez le fluide, puis remettez en suspension la pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon FACS.

Électroporez les cellules HTT11619 synchronisées et libérées à une concentration de 5 x 10 à la cinquième cellule par 100 microlitres, avec le complexe RNP à 100 picomoles et 100 picomole de 72 NTODN à 2,0 micromolaires. Transférez les cellules dans une plaque à six puits et laissez-les récupérer pendant 72 heures. Ensuite, triez les cellules individuellement en plaques à 96 puits, à l’aide d’un trieur à fac avec un laser de 488 nanomètres pour EGFP plus moins.

À partir des puits qui ont de la croissance, isolez l’ADNg cellulaire à l’aide d’un kit d’isolement d’ADN disponible dans le commerce. Amplifiez les régions entourant la base cible via la PCR. Enfin, effectuez une analyse de séquençage de l’ADN sur les échantillons.

72 heures après l’analyse cytométrique en flux d’incubation, confirmer la réparation fonctionnelle de la protéine fluorescente verte. Une dose-réponse progressive a été observée à mesure que les niveaux coordonnés de RNP et de 72NT augmentent. Une réaction d’édition de gènes en l’absence de la particule RNP a corrigé environ 1 % des cellules ciblées lorsqu’une concentration 10 fois plus élevée de l’oligonucléotide 72NT est utilisée dans la réaction d’édition de gènes à agent unique.

16 clones des échantillons positifs à l’EGFP ont été sélectionnés et l’intégrité génétique entourant le site cible a été analysée par séquenceur d’ADN. Les 16 cellules EGFP positives contenaient l’échange de nucléotides prédit au site cible. 15 isolats clonaux non verts ont été analysés pour déterminer leur hétérogénéité au site cible.

Aucun échange de bases d’ADN n’a été observé dans environ la moitié des échantillons. Le reste des expansions clonales examinées ont montré une population hétérogène de mutations de délétion. La taille de la suppression variait d’une base à 19 bases.

CRISPR, Cas9 et les molécules d’ADN donneur d’oligonucléotides simple brin travaillant en tandem peuvent conduire à la réparation précise de la mutation ponctuelle dans le gène EGFP, comme démontré dans ce nouveau modèle de réparation des mutations ponctuelles, une voie moléculaire, dans laquelle l’ADN du donneur accède au modèle de réplication pour la réparation de la base mutante. Un processus que nous avons appelé ExACT. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’édition génomique pour explorer le degré d’hétérogénéité au site cible, à la suite de l’activité d’édition génomique dans les lignées cellulaires.