Name: Protocole générique pour l’optimisation de la Production de protéines hétérologues à l’aide de la technologie automatisée de MICROBIOREACTEUR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Découvrez une méthode itérative combinant le design expérimental par krigeage et la technologie de microbiobioréacteur pour optimiser les milieux de culture microbienne et améliorer la production de protéines hétérologues.

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Les activités scientifiques du Bioeconomy Science Center étaient soutenues financièrement par le ministère de l’Innovation, la Science et la recherche dans le cadre de la BioSC NRW-Strategieprojekt (no. 13 313/323-400-002). Les auteurs tiennent à remercier le ministère de l’Innovation, la Science et recherche de Rhénanie du Nord-Westphalie et l’Heinrich Heine Université Düsseldorf une bourse d’études pour Lars Freier au sein de la biotechnologie industrielle du Cluster CLIB-diplômé. Un financement supplémentaire a été reçu de l’activation du programme espaces « Helmholtz Innovation Labs » de l’Association allemande Helmholtz pour soutenir le « Microbial Bioprocess Lab – A Helmholtz Innovation Lab ».

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le caractère générique du protocole présenté permet diverses adaptations, par exemple, pour étudier d’autres expression microbienne hôtes9,47,48,49,50, 51, ou pour optimiser les autres propriétés de la protéine cible, comme les obligations de motif ou de bisulfure de glycosylation. Le protocole devrez peut-être aussi être adapté à l’équipement de laboratoire disponibles. L’intégration d’un système MBR permet d’augmenter le débit expérimental, qui permet d’importantes économies dans le temps. Cependant, lors du remplacement des bioréacteurs entièrement instrumentés et contrôlables par les systèmes MBR, évolutivité des résultats doit considérer8,37,52,53. L’utilisation de méthodologies DOE et la modélisation mathématique permet de maximiser l’information contenue dans les données de mesure en ce qui concerne l' objectif étudiés54 par efficace de planification expérimentale et interprétation de données basées sur le modèle15.
Modifications à la méthode À côté de polyvalent et extensible robotic manipulation de liquides systèmes comme celui utilisé dans cette étude, il convient de mentionner qu’il y a plusieurs liquides plus petits systèmes disponibles dans le commerce qui sont capables d’accomplir cette tâche et peuvent être placés à l’intérieur des bancs de travail à flux laminaire. Si aucun système de pipetage automatisée n’est disponible, des compositions de différents supports selon le régime DOE également peuvent être réalisées que par pipetage manuel à l’aide de pipettes unique ou multi canaux. Puisque la préparation manuelle est plus sujette aux erreurs et exigera des travaux très ciblé pour un temps assez long, il est conseillé de préparer un nombre inférieur de compositions de différents médias.
Selon les capacités du système MBR indépendant, le protocole de culture correspondant peut varier. Par exemple, si aucune mesure en ligne de formation de la biomasse est disponible, il peut être suffisant mesurer la concentration de la biomasse issue de l’expérience de la croissance. En combinaison avec un suivi en ligne du pH et l’oxygène dissous, qui est implémenté dans plusieurs systèmes de MBR, la saturation de la croissance peut être déterminée en toute sécurité. En principe, les expériences de croissance peuvent être effectuées en MTP seul placé à l’intérieur de secouer les incubateurs, sans l’utilisation d’un système MBR. Dans ce cas, les conditions de culture bon doivent être assurés : (1) cultures limitées en oxygène peuvent être évité en utilisant MTP avec des géométries adaptés, en combinaison avec bon secouant les fréquences et secouant les diamètres, par exemple, carré 96 ou 24 '' profondeur plaques bien exploité à 1 000 tr/min à 3 mm jet ou à 250 tr/min à 25 mm jet, respectivement. Ce qui est important, plus les taux de transfert d’oxygène maximale réalisable, plus la source principale de carbone devrait être concentrée. Comme mentionné ci-dessus, pour cette étude, l’utilisation de 10 g/L de glucose a été adaptée afin d’éviter la prescription d’oxygène pour les conditions de culture indépendants ; (2) l’échantillonnage des cultures du PSG pour la quantification de la biomasse et les produits doit être réduit au minimum. Chaque fois que le PSG est retiré de l’incubateur agitateur, transfert d’oxygène sera immédiatement panne qui peut aboutir à des conditions de culture défavorables ; (3) de l’avis des auteurs, l’utilisation de lecteurs du PSG comme dispositifs de culture n’est pas recommandée car ces appareils n’a été élaborés à cet effet. Par exemple, agitation mécanique ont été construite pour le mélange occasionnelle de microplaques après l’addition de réactif et ainsi, manque souvent de robustesse pour de longues distances de continu durée secouer pendant jours. En outre, suffisamment puissance d’entrée nécessaire pour les cultures microbiennes ne peut être réalisée dans ces lecteurs. L’intégration de lectures de densité optique en bref des intervalles de temps nécessite l’arrêt de la motion secousse, résultant en des périodes répétées de limitation de l’oxygène. En outre, évaporation dans de tels systèmes sur une période longue culture faussera les résultats. Pour plus de détails sur le sujet étonnamment complexe sur l’utilisation de MTP pour cultures microbiennes, on se reportera à la littérature citée22,23,24,25,26 et références.
D’autres considérations Aux étapes d’optimisation itérative de Speed-up, il est conseillé de sélectionner avec soin la méthode d’analyse pour le dosage du produit. Rapides et simple des méthodes doivent être privilégiées au détriment de la précision et l’exactitude, comme la stratégie de conception expérimentale itératif tolère des imprécisions expérimentales. Toutefois, les résultats définitifs doivent être confrontées avec des méthodes de quantification suffisamment précise et exacte de produit qui pourraient être plus compliqués. En général, une évaluation soigneuse et prise de décisions sur les procédures d’étude nécessitent un effort au début de l’étude, mais payent à long terme, après que des méthodes de routine ont été établis.
Il est fortement recommandé de définir une expérience de référence qui est comparée à toutes les expériences pendant l’optimisation. Autrement dit, la composante moyenne appliquée concentrations ainsi que sortie mesuré est normalisée par divisant par des valeurs de référence. De cette façon, chacune appliquée et la valeur mesurée peut être interprété comme le x-giron de la valeur de référence. Afin de tenir compte des variations entre les plaques, cinq expériences de référence sont effectués sur chaque plaque. La valeur moyenne des résultats mesurés est utilisée pour la normalisation.
Il généralement ne peut être garantie que le milieu développé est également optimal pour les autres souches. Cependant, le support amélioré aussi sera probablement approprié pour la culture des souches d’expression avec de petites différences génétiques, par exemple, lors de produire des variantes de l’enzyme avec des substitutions d’acides aminés unique obtenue (études de mutagenèse même de simples mutations ponctuelles ont été décrits au métabolisme cellulaire effet et expression hétérologue performance55,,56). Dans ce cas, le protocole présenté peut être une première étape, suivie des protocoles haut débit expression projections57. Si le protocole est utilisé pour le développement moyen avec intensification ultérieure aux cultures fed-batch, le milieu optimisé doit être vérifié pour les conditions correspondantes de bioprocédés, comme clone dépistage des campagnes à la micro-échelle identifié différent haut artistes interprètes ou exécutants pour différentes stratégies d’alimentation et de la culture médiatique52,58. En outre, l’introduites KriKit36 peut généralement contribuer à optimisation améliorée bioprocédés holistique.Récemment encore, les capacités de l’outil ont été étendues pour prendre également en charge optimisation multi-objectif40, qui peut être important pour optimiser les processus en amont et en aval59,60.

Technologie moderne gène recombinant permet l’utilisation de techniques enzymes pour différentes applications dans l’industrie pharmaceutique, l’alimentation animale, chimie organique et l’Agroalimentaire1,2,3. La production d’enzymes techniques en vrac est un thème majeur pour la biotechnologie industrielle et la production de protéines recombinantes optimisé et les deux de la souche et génie des bioprocédés est nécessaire. Pour la génération des souches efficacement ingénierie production, différentes bibliothèques génétiques sont disponibles, par exemple, pour équilibré gene expression4 ou augmentation de la sécrétion efficacité5.
Corynebacterium glutamicum est un important producteur d’acides aminés à l’échelle industrielle6,7 et représente un hôte d’expressions non conventionnelles attrayant pour la production de sécrétion de protéines recombinantes8 ,,9. Voie de translocation à arginine (Tat) tant générales sécrétoire (s) sont présents dans c. glutamicum et ont été appliqués avec succès pour la sécrétion de protéine recombinante10. Une vaste expérience en génie des bioprocédés concernant la production d’acides aminés à l’échelle industrielle, ainsi que la capacité de sécréter des protéines g/L montants11 et grande robustesse concernant des inhomogénéités de bioprocédés trouvées à grande échelle cultures12,13, faire glutamicum c. un organisme de plate-forme prometteuse pour la production de sécrétion de protéines hétérologues à l’échelle industrielle.
Optimisation moyenne nutrition est connue pour améliorer la production de protéines recombinantes avec systèmes microbiens14,15,16,17 et par conséquent, l’adaptation du milieu la composition est une étape enrichissante en bioprocédés relativement à une productivité optimale18,19,20,21. D’intenses recherches sur l’application de plaques de microtitration (MTP) pour culture microbienne22,23,24 a ouvert la voie pour le développement et la conception de MTP pour culture microbienne25 ,26 et le développement de systèmes axés sur les MTP MICROBIOREACTEUR (MBR) avec suivi en ligne et de l’environnement de contrôle27,28. MBRs permettent une augmentation significative en matière de culture expérimentale. En outre, les systèmes MBR découlant des autres types de bioréacteurs, par exemple, les colonnes de bulles ou réservoir agité réacteurs, sont disponibles pour microbial bioprocess optimisation29,30,31, 32.
En règle générale, études d’optimisation de bénéficient d’un débit plus élevé expérimental, qui devient encore plus puissant en combinaison avec des méthodologies DOE, telles qu’évaluer les interactions entre variables de conception ou de réduire les espaces de grande dimension recherche. Par conséquent, l’utilisation combinée de systèmes MBR, l’automatisation de laboratoire et DOE s’est avérée pour être une méthode puissante en biotechnologie8,16,33,34,35.
Un protocole pour l’optimisation des médias est présenté combinant state-of-the-art lab d’automatisation, technologie MBR avec surveillance des processus en ligne et données orientées sur le krigeage analyse/experimental design. La méthodologie de krigeage est implémentée dans une boîte à outils MATLAB (« KriKit ») qui peut être téléchargé et utilisé gratuitement frais36. Comme exemple d’application, la maximisation de la production de protéine (GFP) sécrétrices ﬂuorescentes vert avec c. glutamicum est montrée en optimisant la composition d’un milieu minimal CgXII. Titre de la GFP a été choisi comme l’objectif d’optimisation car il peut être quantifié facilement et elle est largement appliquée comme protéine modèle pour les études sur le MBR systèmes37,38,39.
Le cadre présenté est divisé en quatre étapes, qui sont illustrées dans la Figure 1. Les étapes sont indiquées par des cadres de la boîte et correspondent aux sections du protocole. La première étape (Figure 1 a) est de définir les objectifs du projet et de déterminer les méthodes requises. La combinaison de méthodologies DOE, la technologie MBR et automatisation de laboratoire permet un débit accru expérimental qui exige le traitement de données puissant. La deuxième étape (Figure 1 b) a pour but de détecter les variables de conception sensible (c'est-à-direles composants moyennes) avec une forte influence sur l’objectif d’optimisation. Cela conduit à un nombre réduit de variables de conception d’intérêt. La troisième étape (Figure 1) comprend une optimisation itérative pour une étude plus détaillée de la relation fonctionnelle entre les variables restantes de la conception et l’objectif d’intérêt. En utilisant le jeu de données successivement étendu, l’approche de krigeage est appliquée pour prédire le résultat expérimental aux endroits non mesurés. Le cycle itératif s’arrête dès que le modèle de krigeage prédit un optimum ou un plateau avec une précision suffisante. Les résultats sont vérifiés dans la quatrième étape (Figure 1), commençant par une autre analyse de sensibilité autour de l’optimum identifié. Si au départ, les composants insensibles se trouvent être insensible aussi dans la région optimale, il est raisonnable de supposer que c’est le cas au cours de la procédure d’optimisation itérative dans la troisième étape. Par la suite, il est conseillé de vérifier les résultats de l’optimisation par l’application de méthodes orthogonales, comme une analyse de l’activité ou SDS-Page.
Le caractère générique du protocole présenté permet adaptation facile au matériel de laboratoire différents, autres hôtes expression et protéines cibles de choix, mais aussi des bioprocédés autres variables comme la température de culture ou de la valeur pH.En outre, les autres objectifs d’optimisation comme taux de production de protéines, le rendement spécifique ou la qualité des produits peuvent être choisies pour s’adapter à la portée des autres études d’optimisation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
Figure 1 : Flux de travail d’étude d’optimisation. Les boîtes de quatre châssis correspondent aux sections du protocole, « Concevoir l’étude et définition de méthodes » (Section 1), « Sensitivity Analysis » (article 2), « Optimisation itérative » (article 3) et « Validation » (article 4). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>BioLector</td><td>m2p-labs</td><td>G-BL-100</td><td></td></tr><tr><td>Flowerplate</td><td>m2p-labs</td><td>MTP-48-BOH</td><td>Pour la culture dans l’appareil BioLector</td></tr><tr><td>Feuille d’étanchéité</td><td>m2p-labs</td><td>F-GP-10</td><td>Étanchéité stérile pour Flowerplate</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>2016b</td><td></td></tr><tr><td>KriKit</td><td>Forschungszentrum J&uuml ; lich</td><td>n/a</td><td>Libre accès, installation MATLAB requise</td></tr><tr><td>Robot de pipetage Janus</td><td>Perkin Elmer</td><td>n/a</td><td>Comprend l’installation du logiciel « WinPrep »</td></tr><tr><td>Microplaque à puits profond à 12 colonnes</td><td>E& K Scientific</td><td>EK-2034</td><td>Conteneur pour solutions mères moyennes</td></tr><tr><td>microplaques à 96 puits, transparentes,</td><td>655101 Greiner</td><td></td> à fond F <td>Pour le dosage des protéines Bradford</td></tr><tr><td>&micro ; microplaques transparentes à 96 puits, corps noir, fond F transparent</td><td></td><td>655087</td><td>pour la mesure de la fluorescence dans les surnageants acellulaires</td></tr><tr><td>Pipette Research&nbsp ; plus pipettes multicanaux</td><td>Eppendorf</td><td>n/a</td><td>Facilite la manipulation manuelle des liquides avec des microplaques</td></tr><tr><td>TruPAG&nbsp ; Gels préfabriqués</td><td>Sigma</td><td>PCG2002</td><td>Pour l’analyse SDS-Page des surnantants acellulaires</td></tr><tr><td>Bradford Reagent</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td><td>n/a</td><td>n/a Porte</td><td>le plasmide pEKEx2 avec fusion du gène GFP et du peptide signal PhoD de B. subtilis en tant qu’insert d’expression. Le plasmide fournit une résistance à la kanamycine. Décrit et publié par Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&ndash ; 42 (2007)</td></tr></tbody></table>

protocole générique pour l’optimisation de la production de protéines hétérologues à l’aide de la technologie automatisée de microbioreacteur

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Des aspects essentiels en matière de biotechnologie industrielle utilisant des usines de cellules de production microbienne sont le processus itératif de l’ingénierie de la souche et l’optimisation des conditions de bioprocédés. Un aspect important est l’amélioration du milieu de culture pour fournir un environnement optimal pour la formation microbienne du produit d’intérêt. Il est bien établi que la composition de médias peut influencer considérablement la performance globale de bioprocédés. Optimisation moyenne nutrition est connue pour améliorer la protéine recombinante production avec les systèmes microbiens et donc, c’est une étape enrichissante dans le développement de bioprocédés. Toutefois, les recettes des médias très souvent standard proviennent de littérature, depuis la conception sur mesure de la milieu de culture est une tâche fastidieuse qui exige la technologie MICROBIOREACTEUR pour un débit suffisant culture, analytique rapide produit, ainsi que soutien par robotique de laboratoire pour permettre la fiabilité dans les étapes de manipulation de liquides. En outre, des méthodes mathématiques avancées sont nécessaires pour analyser rationnellement les données de mesure et concevoir efficacement des expériences parallèles comme pour atteindre le contenu de l’information optimale.
Le caractère générique du protocole présenté permet une adaptation facile au matériel de laboratoire différents hôtes de l’expression et autres protéines cibles d’intérêt, ainsi que d’autres paramètres de bioprocédés. En outre, autres objectifs d’optimisation comme taux de production de protéines, le rendement spécifique ou la qualité des produits peuvent être choisies pour s’adapter à la portée des autres études d’optimisation. La Toolbox de krigeage appliquée (KriKit) est un outil général pour conception d’expériences (DOE) qui contribue à l’optimisation de bioprocédés globale améliorée. Il soutient également l’optimisation multi-objectif qui peut être importante dans l’optimisation des processus en amont et en aval.

Ce manuscrit décrit une approche générique pour une conception sur mesure de supports de culture microbienne. Cette option est activée par un flux de travail itératif combinant krigeage experimental design et MICROBIOREACTEUR technologie pour un débit suffisant la culture, qui est pris en charge par robotics lab pour augmenter la fiabilité et la rapidité dans la manipulation des médias de liquides préparation.

Protocole générique pour l’optimisation de la Production de protéines hétérologues à l’aide de la technologie automatisée de MICROBIOREACTEUR

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

L’objectif global de ce flux de travail itératif combinant un plan expérimental basé sur Kringing et la technologie des microbioréacteurs pour un débit de culture suffisant est de décrire une approche générique pour la conception sur mesure de milieux de culture microbiens. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement de bioprocédés microbiens, telles que l’optimisation des milieux de culture, les conditions des bioprocédés, ainsi que le phénotypage des souches. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous nous sommes demandé si les milieux de culture optimisés pour la production de petits métabolites étaient également les mieux adaptés à la production de protéines hétérologues.Le principal avantage de cette technique est qu’elle accélère les temps de développement globaux grâce à une combinaison intelligente d’expérimentation et de modélisation. La démonstration de cette procédure sera faite par Roman Jansen, un doctorant de mon laboratoire. Commencer cette procédure par l’étude, la conception et la définition des méthodes telles que détaillées dans le protocole texte.Stérilisez les plaques à puits profonds pour le stockage de la solution mère sur une table de travail en essuyant les plaques avec de l’éthanol à 70 %, puis en les séchant dans une hotte à flux laminaire. Commencer la culture des graines en inoculant 50 millilitres de milieu BHI contenant 25 milligrammes par litre de kanamycine avec une aliquote de la banque de cellules de travail. Placez tout le matériel de laboratoire nécessaire sur la table de travail du robot et versez les solutions mères dans le matériel de laboratoire correspondant.Ensuite, démarrez le flux de travail robotique pour la préparation du milieu afin que la dernière étape, qui est l’inoculation, soit atteinte à temps pour le début de la culture des graines. Prélevez l’échantillon de la culture de graines après environ deux heures pour surveiller la croissance en mesurant la densité optique à 600 nanomètres ou O-D-600. Continuez à surveiller la croissance à chaque heure.Après environ cinq heures, la culture atteint un O-D-600 entre trois et quatre, et est utilisée pour inoculer les cultures principales. Placez la culture de semences sur la table de travail du manipulateur de liquides et poursuivez le protocole de préparation du milieu. Sceller les plaques de microtitration de culture après l’inoculation.Ensuite, placez la culture scellée M-T-P dans l’appareil Biolector. Ensuite, démarrez le protocole de culture prédéfini. Éliminez les solutions mères restantes conformément aux réglementations en matière de biosécurité, si nécessaire.Ensuite, ensemencez la culture à partir de la table de travail robotisée. Nettoyez le matériel de laboratoire réutilisable avant de commencer le protocole de décontamination du manipulateur de liquides. Arrêtez la culture principale après une durée d’exécution de 17 heures et traitez les données comme décrit dans le protocole texte.Pour quantifier le titre G-F-P, transférez d’abord les suspensions cellulaires de tous les puits de culture dans des tubes de réaction pré-étiquetés. Ensuite, centrifugez les suspensions cellulaires pendant 10 minutes à vitesse maximale à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse pour obtenir le surnageant acellulaire. Ensuite, transférez 200 microlitres de chaque surnageant acellulaire dans un M-T-P noir de 96 puits avec un fond transparent.Lire la fluorescence spécifique G-F-P à 488 nanomètres pour l’excitation et 520 nanomètres pour la longueur d’onde d’émission à l’aide d’un lecteur de microplaques approprié. Après avoir mesuré la fluorescence G-F-P, la microplaque peut être directement utilisée pour déterminer la teneur en protéines des surnageants acellulaires avec des protocoles standard tels qu’un test Bradford ou B-C-A. Enfin, procédez à l’analyse des données comme décrit dans le protocole texte.La procédure démontrée constitue une série d’expériences, les résultats sont utilisés pour concevoir d’autres séries avec l’amélioration maximale attendue du signal G-F-P. Des expériences de référence sont placées dans chaque tour pour analyser la variabilité des données et détecter les valeurs aberrantes expérimentales. Ce graphique de contour donne un aperçu de la procédure d’optimisation.L’analyse de l’ensemble des données collectées au cours de la troisième itération a révélé une limitation de l’effet positif du magnésium, en identifiant une plage de concentration optimale. Il a donc été décidé d’élargir davantage la plage de concentration uniquement pour le calcium dans la quatrième itération. La procédure a été répétée deux fois dans les itérations cinq et six jusqu’à ce qu’une saturation du signal G-F-P soit trouvée.Cette saturation s’explique par la précipitation du sel de calcium pour les concentrations appliquées de calcium, qui ne sont pas disponibles pour la cellule. La septième itération a été utilisée pour explorer les limites plus en détail. Les plages de concentration optimales des composants du fluide pour le signal G-F-P saturé peuvent être identifiées de manière fiable à l’aide d’un test Z statistique.Il montre le plateau identifié tel qu’il est déterminé et visualisé à l’aide de la boîte à outils du kit Kringing. La boîte à outils du kit Kringing est disponible gratuitement et est accompagnée d’un tutoriel détaillé qui explique comment utiliser ses fonctionnalités. La nature générique du protocole présenté permet diverses adaptations, telles que l’étude d’autres hôtes d’expression microbienne ou l’optimisation d’autres propriétés de la protéine cible, comme le modèle de glycosylation ou les liaisons disulfure.L’intégration d’un système embrion augmente le débit expérimental, ce qui permet de réaliser de grands gains de temps Lors du remplacement de bioréacteurs entièrement contrôlables et influents par des systèmes amniar, l’évolutivité des résultats doit être prise en compte. La modélisation mathématique et la conception d’expériences permettent de maximiser le contenu informatif des données de mesure par rapport à l’objectif étudié.

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