Protocole générique pour l’optimisation de la Production de protéines hétérologues à l’aide de la technologie automatisée de MICROBIOREACTEUR

L’objectif global de ce flux de travail itératif combinant un plan expérimental basé sur Kringing et la technologie des microbioréacteurs pour un débit de culture suffisant est de décrire une approche générique pour la conception sur mesure de milieux de culture microbiens. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement de bioprocédés microbiens, telles que l’optimisation des milieux de culture, les conditions des bioprocédés, ainsi que le phénotypage des souches. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous nous sommes demandé si les milieux de culture optimisés pour la production de petits métabolites étaient également les mieux adaptés à la production de protéines hétérologues.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle accélère les temps de développement globaux grâce à une combinaison intelligente d’expérimentation et de modélisation. La démonstration de cette procédure sera faite par Roman Jansen, un doctorant de mon laboratoire. Commencer cette procédure par l’étude, la conception et la définition des méthodes telles que détaillées dans le protocole texte.

Stérilisez les plaques à puits profonds pour le stockage de la solution mère sur une table de travail en essuyant les plaques avec de l’éthanol à 70 %, puis en les séchant dans une hotte à flux laminaire. Commencer la culture des graines en inoculant 50 millilitres de milieu BHI contenant 25 milligrammes par litre de kanamycine avec une aliquote de la banque de cellules de travail. Placez tout le matériel de laboratoire nécessaire sur la table de travail du robot et versez les solutions mères dans le matériel de laboratoire correspondant.

Ensuite, démarrez le flux de travail robotique pour la préparation du milieu afin que la dernière étape, qui est l’inoculation, soit atteinte à temps pour le début de la culture des graines. Prélevez l’échantillon de la culture de graines après environ deux heures pour surveiller la croissance en mesurant la densité optique à 600 nanomètres ou O-D-600. Continuez à surveiller la croissance à chaque heure.

Après environ cinq heures, la culture atteint un O-D-600 entre trois et quatre, et est utilisée pour inoculer les cultures principales. Placez la culture de semences sur la table de travail du manipulateur de liquides et poursuivez le protocole de préparation du milieu. Sceller les plaques de microtitration de culture après l’inoculation.

Ensuite, placez la culture scellée M-T-P dans l’appareil Biolector. Ensuite, démarrez le protocole de culture prédéfini. Éliminez les solutions mères restantes conformément aux réglementations en matière de biosécurité, si nécessaire.

Ensuite, ensemencez la culture à partir de la table de travail robotisée. Nettoyez le matériel de laboratoire réutilisable avant de commencer le protocole de décontamination du manipulateur de liquides. Arrêtez la culture principale après une durée d’exécution de 17 heures et traitez les données comme décrit dans le protocole texte.

Pour quantifier le titre G-F-P, transférez d’abord les suspensions cellulaires de tous les puits de culture dans des tubes de réaction pré-étiquetés. Ensuite, centrifugez les suspensions cellulaires pendant 10 minutes à vitesse maximale à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse pour obtenir le surnageant acellulaire. Ensuite, transférez 200 microlitres de chaque surnageant acellulaire dans un M-T-P noir de 96 puits avec un fond transparent.

Lire la fluorescence spécifique G-F-P à 488 nanomètres pour l’excitation et 520 nanomètres pour la longueur d’onde d’émission à l’aide d’un lecteur de microplaques approprié. Après avoir mesuré la fluorescence G-F-P, la microplaque peut être directement utilisée pour déterminer la teneur en protéines des surnageants acellulaires avec des protocoles standard tels qu’un test Bradford ou B-C-A. Enfin, procédez à l’analyse des données comme décrit dans le protocole texte.

La procédure démontrée constitue une série d’expériences, les résultats sont utilisés pour concevoir d’autres séries avec l’amélioration maximale attendue du signal G-F-P. Des expériences de référence sont placées dans chaque tour pour analyser la variabilité des données et détecter les valeurs aberrantes expérimentales. Ce graphique de contour donne un aperçu de la procédure d’optimisation.

L’analyse de l’ensemble des données collectées au cours de la troisième itération a révélé une limitation de l’effet positif du magnésium, en identifiant une plage de concentration optimale. Il a donc été décidé d’élargir davantage la plage de concentration uniquement pour le calcium dans la quatrième itération. La procédure a été répétée deux fois dans les itérations cinq et six jusqu’à ce qu’une saturation du signal G-F-P soit trouvée.

Cette saturation s’explique par la précipitation du sel de calcium pour les concentrations appliquées de calcium, qui ne sont pas disponibles pour la cellule. La septième itération a été utilisée pour explorer les limites plus en détail. Les plages de concentration optimales des composants du fluide pour le signal G-F-P saturé peuvent être identifiées de manière fiable à l’aide d’un test Z statistique.

Il montre le plateau identifié tel qu’il est déterminé et visualisé à l’aide de la boîte à outils du kit Kringing. La boîte à outils du kit Kringing est disponible gratuitement et est accompagnée d’un tutoriel détaillé qui explique comment utiliser ses fonctionnalités. La nature générique du protocole présenté permet diverses adaptations, telles que l’étude d’autres hôtes d’expression microbienne ou l’optimisation d’autres propriétés de la protéine cible, comme le modèle de glycosylation ou les liaisons disulfure.

L’intégration d’un système embrion augmente le débit expérimental, ce qui permet de réaliser de grands gains de temps Lors du remplacement de bioréacteurs entièrement contrôlables et influents par des systèmes amniar, l’évolutivité des résultats doit être prise en compte. La modélisation mathématique et la conception d’expériences permettent de maximiser le contenu informatif des données de mesure par rapport à l’objectif étudié.