Une méthode pour obtenir des coupes sériées ultraminces de micro-organismes en microscopie électronique à Transmission

L’objectif global de cette procédure est de réaliser en série des sections ultraminces en toute sécurité et facilement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, en fournissant des informations structurelles quantitatives et tridimensionnelles d’une cellule entière au niveau de la microscopie électronique. Le principal avantage de cette technique est que la section ultramince en série peut être effectuée sans machine coûteuse, et des images haute résolution peuvent être obtenues avec cette méthode.

Pour commencer cette procédure, nettoyez la surface d’une lame de verre. Trempez ensuite la moitié de la lame de verre dans une solution Formvar à 1,5 % dans la colonne supérieure de l’appareil de tournage de support Formvar en pressant la solution avec de l’air à travers le robinet d’arrêt à trois voies à l’aide d’une bille en caoutchouc. Vidangez la solution de la colonne en ouvrant le robinet d’arrêt à trois voies et en libérant de l’air pour réduire la pression.

Retirez ensuite la lame de verre de l’appareil et séchez-la à l’air pour former un film à la surface de la lame de verre. Grattez les quatre bords du film sur la lame de verre avec une lame de rasoir. Après avoir respiré sur la lame pour faciliter la séparation du film de la lame, faites flotter le film en immergeant lentement la lame de verre dans l’eau à un faible angle horizontal.

Ensuite, retirez le film Formvar de l’eau à l’aide d’une grille en aluminium percée de trous. Pour couper le bloc d’échantillon avec une lame de coupe à ultrasons et une lame de rasoir sous un stéréomicroscope, assurez-vous d’abord qu’il y a des cellules à la surface du bloc en observant la pointe du bloc avec un microscope optique. Montez ensuite le bloc d’échantillon dans le mandrin et montez le mandrin sur une platine de coupe.

Coupez les blocs à une taille de 0,7 par 1,0 millimètre. Si la résine époxy est très dure, coupez d’abord la boîte à l’aide d’une lame de coupe à ultrasons, puis coupez davantage le bloc avec une lame de rasoir. Coupez un épaulement pour marquer le sens de la coupe.

Pour couper le bloc d’échantillon à l’aide d’un couteau diamanté à l’aide du microtome, placez le mandrin de bloc d’échantillon dans le porte-échantillon de l’ultra-microtome. Coupez la surface du bloc avec un couteau à tailler en diamant. Placez le bord du couteau diamanté parallèlement à la face du bloc d’échantillon et coupez le minimum de surface de l’échantillon afin de ne perdre aucun échantillon.

Coupez le bord gauche du bloc à l’aide du couteau de coupe en tournant l’étage du couteau de 30 degrés vers la gauche. Ce bord devient la face supérieure de l’échantillon dans la coupe en série. Coupez ensuite la face du bloc à environ 100 microns du bord gauche de l’échantillon en tournant la platine du couteau de 30 degrés vers la droite.

Ce bord devient la face inférieure de l’éprouvette dans la coupe en série. Retirez le couteau de coupe et faites pivoter le bloc d’échantillon de 90 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre. Réglez un couteau à sectionner ultrafin sur le stade du couteau.

Ajustez la surface de l’échantillon et le tranchant du couteau de manière à ce qu’ils soient parallèles l’un à l’autre en utilisant la grande partie de la surface de l’échantillon. Ensuite, appliquez du ruban adhésif sur le mandrin et le support de mandrin du microtome, et coupez le ruban à la limite. Sortez le mandrin de l’échantillon du microtome et placez-le sous le stéréomicroscope.

Coupez la grande partie de l’échantillon avec une lame de rasoir en laissant la partie mince à partir de laquelle les coupes en série seront obtenues Faites adhérer les côtés de la section en utilisant une pipette Pasteur pour déposer environ un microlitre de solution de néoprène à 0,5 % sur l’échantillon à utiliser pour la coupe en série. Recouvrir ensuite l’ensemble de l’échantillon avec une solution de néoprène. Absorbez immédiatement l’excès de solution de néoprène à l’aide d’un morceau de papier filtre placé près de l’échantillon.

Ensuite, préparez trois grilles fendues pour ramasser des sections en série. Pour ce faire, pliez la poignée des grilles à 60 degrés et traitez les grilles avec une solution de néoprène à 0,5 %. Rendez ensuite les grilles hydrophiles par décharge luminescente.

Replacez le mandrin du bloc d’échantillon dans le microtome au même endroit en alignant les pièces collées. Cela permet de maintenir la face du bloc et le tranchant du couteau parfaitement parallèles l’un à l’autre. Approchez ensuite le couteau de l’échantillon.

Après avoir rempli le bateau à couteaux avec de l’eau, couvrez le microtome avec un couvercle en plastique pour empêcher la circulation de l’air. Commencez à couper l’échantillon à une épaisseur de section de 200 nanomètres. Une fois la première section coupée, réglez l’épaisseur de la section sur 70 nanomètres.

Lorsque le nombre de sections en série atteint 20, réglez l’épaisseur de la section sur 10 nanomètres. Étant donné que le microtome ne peut pas couper des sections de 10 nanomètres d’épaisseur, aucune nouvelle section n’apparaît et les sections précédemment coupées se séparent du tranchant du couteau. Ensuite, réglez l’épaisseur de la section sur 60 nanomètres.

Cela produira des sections de 70 nanomètres car la machine ajoutera l’épaisseur précédente de 10 nanomètres. Enfin, réglez l’épaisseur de la section à 70 nanomètres et continuez à couper jusqu’à l’obtention de sections de 1,8 millimètre de long. Pour récupérer les sections en série, placez d’abord la boucle de maintien de section sur le troisième groupe de sections.

Placez ensuite la boucle d’élévation de la surface de l’eau sur la platine du couteau. Placez la boucle du WSRL juste au-dessus des sections de série en déplaçant son arbre et sa poignée. Abaissez la boucle du WSRL sur la surface de l’eau de manière à ce qu’elle entoure les sections.

Poussez la boucle vers le bas en tournant la vis vers le bas de sorte que la surface de l’eau soit soulevée par la tension superficielle. Déplacez la section au centre de la boucle. Positionnez-le sur le sommet de l’eau et ajustez la direction de la section à l’aide d’une mèche de cheveux.

Prenez des groupes de sections en les touchant avec une grille à fente nue, qui est aidée par une pince à épiler et maintenue parallèle à la surface de l’eau. Placez les grilles avec des sections avec une petite goutte d’eau sur le film de support Formvar. Enlevez l’excès d’eau à l’aide de papier filtre.

Une fois les sections complètement sèches, déchirez le film Formvar autour des grilles ; et retirer les grilles portant les sections. Placez les grilles dans la rainure du tube de coloration dans le bon ordre et colorez les sections avec de l’acétate d’uranyle et du citrate de plomb. Placez les cinq grilles du porte-échantillon multiple dans le bon ordre, en orientant l’axe long de la fente de la grille perpendiculairement à l’axe du porte-échantillon.

Fixez la grille à l’aide de fixateurs de grille et insérez le porte-échantillon dans le microscope électronique à transmission. Procédez à la prise de photos des cellules cibles et de toutes les sections de cellules à fort grossissement. Voici une vue à faible grossissement de cinq grilles qui portent des sections en série.

18 à 25 sections ont été montées sur une grille. Notez que les sections sont attachées ensemble et ont la même épaisseur. Des coupes en série de myogenèse péricarionique sont présentées ici.

La figure montre 12 sections complètes sur 67. On a découvert que cette cellule avait un grand nucléoïde composé de fibres d’ADN nues avec une seule membrane nucléoïde et des endosymbiontes qui ressemblent à des bactéries mais pas de mitochondries. Ainsi, cet organisme semble être une forme de vie intermédiaire évoluant du procaryote à l’eucaryote.

Voici des coupes en série d’Escherichia coli. La figure montre 12 sections complètes. Il est intéressant de noter que cette cellule contenait 21 700 ribosomes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire des sections ultraminces en série. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est correctement exécutée.