Une méthode pour obtenir des coupes sériées ultraminces de micro-organismes en microscopie électronique à Transmission

L'objectif général de cette procédure est de réaliser des coupes ultraminces en série de manière sûre et facile. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, en fournissant des informations structurelles quantitatives et tridimensionnelles sur une cellule entière au niveau microscopique électronique. Le principal avantage de cette technique est que la coupe ultramince en série peut être effectuée sans machine coûteuse, et des images de haute résolution peuvent être obtenues avec cette méthode.

Pour commencer cette procédure, nettoyez la surface d'une lame de verre. Ensuite, immergez une moitié de la lame de verre dans la solution de Formvar à 1,5 % située dans la colonne supérieure de l'appareil de fabrication du film support en appuyant sur l'air à l'aide d'une poire en caoutchouc à travers le robinet à trois voies. Évacuez la solution de la colonne en ouvrant le robinet à trois voies et en relâchant l'air afin de réduire la pression.

Ensuite, retirez la lame de verre de l'appareil et laissez-la sécher à l'air pour former un film à la surface de la lame. Grattez les quatre bords du film sur la lame de verre à l'aide d'une lame de rasoir. Après avoir soufflé sur la lame afin de faciliter la séparation du film, faites flotter le film en immergeant lentement la lame de verre dans l'eau selon un faible angle horizontal.

Ensuite, récupérez le film de Formvar depuis l'eau à l'aide d'un support en aluminium percé de trous. Pour tailler le bloc d'échantillon à l'aide d'une lame de découpe ultrasonique et d'un rasoir sous microscope stéréoscopique, vérifiez tout d'abord la présence de cellules à la surface du bloc en observant l'extrémité du bloc au microscope optique. Puis, fixez le bloc d'échantillon dans le mandrin et placez le mandrin sur un dispositif de taille.

Recouper les blocs à une taille de 0,7 sur 1,0 millimètre. Si la résine époxy est très dure, recouper d'abord la boîte à l’aide d’une lame de taille ultrasonique, puis affiner le bloc avec une lame de rasoir. Couper une épaule pour indiquer le sens de la coupe.

Pour émousser le bloc d'échantillon à l'aide d'un couteau en diamant en utilisant le microtome, insérez le mandrin du bloc d'échantillon dans le porte-échantillon de l'ultramicrotome. Coupez la surface du bloc avec un couteau en diamant destiné à l'émouttage. Réglez le tranchant du couteau en diamant parallèlement à la face du bloc d'échantillon, et retirez la quantité minimale de surface d'échantillon afin de ne perdre aucun échantillon.

Couper le bord gauche du bloc à l’aide du couteau de paraffinage en tournant le porte-couteau de 30 degrés vers la gauche. Ce bord deviendra le côté supérieur de l’échantillon lors du sectionnement en série. Ensuite, couper la surface du bloc à environ 100 micromètres du bord gauche de l’échantillon en tournant le porte-couteau de 30 degrés vers la droite.

Cet bord devient le côté inférieur de l'échantillon lors de la coupe en série. Retirez le couteau de parage et faites pivoter le bloc d'échantillon de 90 degrés dans le sens horaire. Placez un couteau de microtomie ultramince sur le porte-couteau.

Régler la surface de l'échantillon et le bord du couteau de manière à ce qu'ils soient parallèles l'un à l'autre en utilisant la plus grande partie de la surface de l'échantillon. Ensuite, appliquer du ruban adhésif sur l'adaptateur et le support d'adaptateur du microtome, puis couper le ruban au niveau de la limite. Retirer l'adaptateur avec l'échantillon du microtome et le placer sous la microscopie stéréo.

Coupez la plus grande partie de l'échantillon avec une lame de rasoir, en laissant la partie fine à partir de laquelle seront obtenues les sections séries. Rendez les faces de section adhésives en déposant à l’aide d’une pipette Pasteur environ un microlitre de solution de Néoprène à 0,5 % sur l’échantillon destiné à la sectionnement en série. Ensuite, recouvrez entièrement l’échantillon de solution de Néoprène. Absorbez immédiatement l’excès de solution de Néoprène à l’aide d’un morceau de papier filtre placé près de l’échantillon.

Ensuite, préparez trois grilles à fentes pour ramasser les coupes sérielles. Pour ce faire, courbez la poignée des grilles à 60 degrés et traitez les grilles avec une solution de néoprène à 0,5 %. Rendez ensuite les grilles hydrophiles par décharge luminescente.

Replacer le bloc-échantillon sur la microtome à la même position en alignant les parties collées. Cela maintient la surface du bloc et le tranchant du couteau parfaitement parallèles l'un par rapport à l'autre. Ensuite, approcher le couteau de l'échantillon.

Après avoir rempli le bac du couteau avec de l'eau, couvrez le microtome avec un couvercle en plastique afin d'éviter les courants d'air. Commencez à couper l'échantillon avec une épaisseur de section de 200 nanomètres. Après la coupe de la première section, réglez l'épaisseur de section à 70 nanomètres.

Lorsque le nombre de coupes sérielles atteint 20, réglez l'épaisseur des sections à 10 nanomètres. Étant donné que le microtome ne peut pas découper des sections de 10 nanomètres d'épaisseur, aucune nouvelle section n'apparaît et les sections précédemment coupées se détachent du bord du couteau. Ensuite, réglez l'épaisseur des sections à 60 nanomètres.

Cela produira des sections de 70 nanomètres car la machine ajoutera l'épaisseur précédente de 10 nanomètres. Enfin, réglez à nouveau l'épaisseur des sections sur 70 nanomètres et poursuivez la coupe jusqu'à l'obtention de sections de 1,8 millimètre de longueur. Pour prélever les sections en série, placez d'abord la boucle de maintien des sections sur le troisième groupe de sections.

Ensuite, placer la boucle de remontée de la surface de l'eau sur la platine du couteau. Placer la boucle de la WSRL juste au-dessus des sections en série en déplaçant son manche et son support. Abaisser la boucle de la WSRL jusqu'à la surface de l'eau afin que la boucle entoure les sections.

Abaissez la boucle en tournant la vis vers le bas afin que la surface de l’eau s’élève par tension superficielle. Déplacez la section au centre de la boucle. Placez-la au sommet de la surface de l’eau et ajustez l’orientation de la section à l’aide d’un brin de cheveu.

Prendre les groupes de sections en les touchant avec une grille fendue nue, à l’aide de pinces, et en maintenant la grille parallèle à la surface de l’eau. Placer les grilles avec les sections, accompagnées d’une petite goutte d’eau, sur le film de support Formvar. Retirer l’excès d’eau à l’aide de papier filtre.

Une fois les sections complètement séchées, déchirez le film de Formvar autour des grilles et retirez les grilles portant les sections. Placez les grilles dans la rainure du tube de coloration dans le bon ordre, puis colorez les sections avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb. Placez les cinq grilles dans le porte-échantillons multiple dans le bon ordre, en orientant l'axe long de la fente de la grille perpendiculairement à l'axe du porte-échantillons.

Fixer la grille avec des fixateurs de grille et insérer le porte-échantillon dans le microscope électronique en transmission. Procéder à la prise d'images des cellules cibles et de toutes les sections cellulaires à fort grossissement. On observe ici une vue à faible grossissement de cinq grilles portant des sections sérielles.

De 18 à 25 sections ont été montées sur une même grille. Remarquez que les sections sont reliées entre elles et ont la même épaisseur. Des sections sériées de myogenèse du péricarine sont présentées ici.

La figure montre 12 des 67 sections complètes. On a observé que cette cellule possède un grand nucléïde composé de fibres d'ADN nu, d'une membrane nucléïde unique et d'endosymbiotes ressemblant à des bactéries, mais sans mitochondries. Ainsi, cet organisme semble être une forme de vie intermédiaire en cours d'évolution d'un procaryote vers un eucaryote.

Des sections sérielles d'Escherichia coli sont montrées ici. La figure présente 12 sections complètes. Fait intéressant, on a découvert que cette cellule contenait 21 700 ribosomes.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser des coupes ultraminces en série. Une fois maîtrisée, cette technique peut être effectuée en trois heures si elle est réalisée correctement.