Name: Une méthode pour obtenir des coupes sériées ultraminces de micro-organismes en microscopie électronique à Transmission (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-17T10:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Découvrez une méthode fiable pour obtenir des coupes sériées ultraminces de micro-organismes en microscopie électronique à transmission sans équipement coûteux. Cette technique fournit des informations structurales quantitatives tridimensionnelles de cellules entières.

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Nous remercions sincèrement Shigeo Kita pour ses précieuses suggestions et discussion. Nous remercions également John et Sumire Eckstein pour leur lecture critique du manuscrit.

Remarque : Les spécimens utilisés dans cette étude étaient des microorganismes, congelés rapidement de propane dans l’azote liquide, gel substitués dans l’acétone contenant 2 % le tétroxyde d’osmium et incorporé à l’époxy résine1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. préparation du support film (Figure 1-3)
NOTE : Le film support argenté Formvar est établi à l’aide de la méthode cast sur verre19.
<ol><li>Ajouter 100 mL de 1,5 % Formvar de dichlorure d’éthylène à un appareil de fabrication de Formvar (Figure 1). Tremper la moitié d’une lame de verre (76 x 26 x 1,3 mm) en solution de Formvar dans la colonne supérieure de l’appareil en appuyant sur la solution avec de l’air par le biais de « a » en utilisant un ballon de caoutchouc19.<ol>
<li>La solution de la colonne de vidange en ouvrant le robinet à trois voies et libérant air par « b » pour réduire la pression. Retirez la lame de verre de l’appareil et sec dans l’air pour former une pellicule à la surface de la lame de verre. Utiliser une lampe à incandescence pour accélérer le séchage du film Formvar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après racler les quatre bords du film sur la lame de verre avec une lame de rasoir (Figure 2 a) et la respiration sur le toboggan pour faciliter la séparation du film de la diapo20, flottent hors du film sur l’eau en plongeant la lame de verre dans le l’eau lentement à un angle horizontal faible (environ 10°, Figure 2 b).</li>
	<li>Ramasser le film Formvar de l’eau à l’aide d’une grille en aluminium (30 x 25 x 3 mm) avec des trous (4 mm de diamètre) (Figure 3 a). Empêchent la grille avec le film de Formvar dans un dessicateur jusqu'à utilisation (Figure 3 b).</li>
</ol>2. tailler le bloc de spécimen avec une lame de tondeuse par ultrasons et une lame de rasoir 21 sous un stéréomicroscope (Figure 4)
<ol><li>Assurez-vous qu’il y a des cellules à la surface du bloc en observant l’extrémité du bloc avec un microscope optique (Figure 4 a).</li>
	<li>Montez le bloc du spécimen dans le mandrin (titulaire de bloc) et monter le mandrin sur une coupe étape21 (Figure 4 b). Cette étape de la coupe dispose d’un mécanisme d’éclairage à l’arrière de l’échantillon.</li>
	<li>Couper le bloc à une taille de 0,7 x 1,0 mm (Figures 4 c, 5d). Étant donné que la résine époxy est très dure, tailler les blocs tout d’abord à l’aide d’une lame de tondeuse à ultrasons. Le couteau ultrasonique est une machine nouvellement introduite, et les blocs sont facilement taillés. Couper ensuite le bloc plus loin avec une lame de rasoir. Couper une épaule pour marquer la direction de coupe (voir Figure 5 d, Figure 8).</li>
</ol>3. tailler le bloc de spécimen avec couteau diamant utilisant le microtome (Figure 5)
<ol><li>Définir le bloc de spécimen chuck dans le porte-échantillon de l’ultramicrotome. Placer le spécimen 90° vers la gauche contre la position effective quand des coupes ultraminces série est effectuée (voir Figure 5 d).</li>
	<li>Couper la surface du bloc avec un couteau de coupe de diamant (voir la Figure 5 d). Mettre la lame de couteau diamant parallèle à la face du bloc spécimen et découper le montant minimum de surface de l’échantillon pour ne pas perdre tout spécimen (Figure 5 d). Remarque : Cette étape est faite pour lisser la surface de l’échantillon. La partie de la surface de l’échantillon de la partie mince est laissée intacte (c’est pourquoi cette partie ne brille pas comme un miroir, Figure 5 d), pour ne pas perdre une partie de l’échantillon pour le sectionnement serial. C’est parce que le spécimen est exposé à la surface du bloc.</li>
	<li>Placez un miroir (coupe de Mesa, M) sur la scène du couteau pour suivre la Coupe du bloc spécimen (Figure 5C).</li>
	<li>Couper le bord gauche (cela devient la face supérieure, Figure 5 d, de l’échantillon en sectionnant série) du bloc à l’aide de couteau de coupe en faisant tourner la scène couteau 30 ° vers la gauche (Figure 5 a).</li>
	<li>Couper la face du bloc à environ 100 µm entre le bord gauche de l’échantillon (cela devient la face inférieure de l’échantillon en sectionnant serial, Figure 5 d) en tournant la scène couteau 30 ° vers la droite (Figure 5 b). Remarque : Les coupes sériées seront coupés de la partie mince de l’échantillon d’environ 90 nm x taille d’environ 1 mm. La grande partie servira à ajuster la surface de l’échantillon et le bord de couteau, tels qu’ils sont parallèles. Après avoir ajusté la surface de l’échantillon pour être parallèle à la lame de couteau, la grande partie est enlevée avec une lame de rasoir. En coupant les côtés supérieures et inférieures de l’échantillon à l’aide du microtome, les deux côtés de l’échantillon devient lisse et parfaitement parallèles les uns aux autres (Figure 5 d), qui est nécessaire pour obtenir des sections droites et ininterrompue de ruban.</li>
</ol>4. réglage du bord de surface et couteau de spécimen afin qu’ils doivent faire face parallèle à l’autre : 21
<ol><li>Retirer le couteau de parage et font tourner le spécimen dans le sens horaire de 90°.</li>
	<li>Réglé un couteau coupe ultra-mince au niveau du couteau.</li>
	<li>Ajuster la surface de l’échantillon et la lame de couteau pour qu’ils doivent faire face parallèlement les uns aux autres à l’aide d’une partie importante de la surface de l’échantillon. Remarque : Une partie importante de l’échantillon est utilisée pour l’ajustement parce que le visage de découpage de sectionnement série est si petit, rendant difficile d’ajuster le bord à l’aide de cette partie seulement, en particulier dans le sens vertical de la surface et couteau spécimen. Ainsi, à l’aide de la grande partie de l’échantillon, réglage facile.</li>
</ol>5. matelassage en néoprène sur le bloc de l’échantillon (Figure 6)
<ol><li>Pour placer le mandrin de spécimen à exactement la même position que la position d’origine, appliquer du ruban adhésif sur le mandrin et le détenteur de mandrin du microtome et coupées à la limite (Figure 6 a).</li>
	<li>Retirez le spécimen mandrin du microtome et placez-le sous le stéréomicroscope (Figure 6 b). Couper une partie importante de l’échantillon avec une lame de rasoir, laissant la partie mince, d'où proviendra coupes sériées.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette Pasteur, déposer environ 1 µL 0,5 % de solution de néoprène (Figure 6 b) sur le spécimen à être utilisée pour le sectionnement de série, pour faire l’adhésif de côtés de section. Couvrir le spécimen entier avec solution de néoprène. Absorber la solution néoprène excès immédiatement avec un morceau de papier filtre placé près de l’échantillon. Obtenir un ruban de sections est essentiel pour prendre des photos des sections de la série de cellules, et la colle néoprène est très utile pour coller les sections.</li>
	<li>Préparer la fente 3 grilles (tailles des fentes : milieu, 0,4 mm x 2,2 mm, les deux côtés de 0,2 mm x 2,2 mm) (Figure 6C) pour ramasser les coupes sériées par la poignée des grilles de flexion à 60 °, traiter les grilles solution à 0.5 % néoprène et rendant les grilles hydrophile par lueur décharge22.</li>
</ol>6. faire des coupes sériées (Figure 7-9)
<ol><li>Place le bloc de spécimen chuck dans le microtome à la même position que le 5.1 (Figure 6 a) en alignant les pièces collées. Ceci maintient la face du bloc et la lame de couteau parfaitement parallèles les uns aux autres. Puis mettre le couteau à proximité de l’échantillon.</li>
	<li>Le bateau de couteau remplissez-le d’eau.</li>
	<li>Couvrir le microtome avec un couvercle en plastique pour empêcher la circulation de l’air (Figure 7). NOTE : Débit d’air pendant les coupes ultraminces et de récupération des articles souvent causer des problèmes. Le couvercle en plastique a trois trous : un trou est pour les lentilles binoculaires, et les deux autres trous sont pour les bras permettre un fonctionnement lorsque le couvercle est en marche. L’accoudoir en bois est utilisée pour placer les bras tout en faisant un travail délicat, tels que des coupes sériées avec grilles de récupération. L’accoudoir en bois est placé sur une table différente de la table microtome (Figure 7, flèches), donc de ne pas transmettre la vibration des mains de l’utilisateur pour le microtome.</li>
	<li>Commencer à couper l’échantillon à l’épaisseur de coupe 200 nm (Figure 8). Réglage à 200 épaisseur nm gagnerez du temps en apportant le couteau sur la surface de l’échantillon.</li>
	<li>Après la première section est coupée, définissez l’épaisseur de coupe à 70 nm (Figure 8).</li>
	<li>Lorsque le nombre de coupes sériées atteint 20 (précisément parlant, après les tronçons de ruban environ 1,8 mm ; le nombre de sections varie en fonction de la largeur des sections), définissez l’épaisseur de coupe à 10 nm (Figure 8) tout en continuant à couper. NOTE : Puisque le microtome ne coupes 10 nm d’épaisseur, aucun nouvel article n’apparaît, et les sections précédemment coupées sont séparent de la lame de couteau. Il est important d’obtenir des groupes de sections séparées (Figure 9) pour ramasser les coupes sériées afin d’éviter des difficultés à séparer les sections manuellement à l’aide d’une paire de mèches de cheveux. Étant donné que le champ de vision dans le microscope électronique en transmission est à 2,0 mm, sections doivent être au maximum 1,8 mm de long.</li>
	<li>Définir l’épaisseur de coupe à 60 nm (Figure 8). Cela produira 70 sections nm (Figure 8) parce que la machine va ajouter l’épaisseur des nm 10 du précédent.</li>
	<li>Définir l’épaisseur de la section retour à 70 nm (Figure 8) et continuer la coupe jusqu'à obtient des sections de 1,8 mm-long.</li>
	<li>Répétez de 6,6 à 6,8 jusqu'à obtient des cinq sections de long de 1,8 mm (Figure 9). Nous faisons généralement cinq groupes de sections puisqu’il y a cinq porte-spécimens dans le microscope électronique à transmission disponible dans notre laboratoire, mais cinq n’est pas la limite.</li>
</ol>7. ramasser les coupes sériées (Figure 10-12)
<ol><li>Placer la « boucle de la porte-Section »23 (diamètre intérieur de la boucle : 5,0 mm) (Figure 10 a) sur le troisième groupe de sections (Figure 10 b). Remarque : Il faut récupérer les sections de l’ordre de leur coupe pour prendre des photos dans l’ordre approprié. Cependant, puisqu’il y a cinq groupes de sections sur le bateau de couteau, il souvent obtient déroutant quels groupes sont qui. En plaçant la boucle sur le troisième groupe, il devient évident que les deux groupes près de l’opérateur sont le premier et deuxième et les deux éloignés de l’opérateur sont les quatrième et cinquième groupes (Figure 10 b). Cela évitera de mélanger vers le haut de l’ordre.</li>
	<li>Placer « boucle d’eau de surface-sensibilisation »23 (WSRL, diamètre intérieur de la boucle : 4,0 mm) (Figure 11 a) sur la scène de couteau (Figure 11 b). La WSRL tiendrai fermement sur la scène de couteau parce qu’il est équipé d’un aimant au fond.<ol>
<li>Placer la boucle de la WSRL juste au-dessus des coupes sériées en déplaçant son arbre et la poignée. Abaissez la boucle de la WSRL sur la surface de l’eau pour que la boucle entoure les sections.</li>
		<li>Poussez la boucle vers le bas en tournant la vis vers le bas afin que la surface de l’eau augmentera de tension superficielle (Figures 11c-d). Déplacer la section vers le centre de la boucle, positionnez-le sur l’apex de l’eau et ajuster la direction de la section en utilisant une mèche de cheveux21.</li>
		<li>Ramasser les groupes de sections par le toucher avec une fente nue-grid, qui est tenu par une pince à épiler et reste parallèle à la surface de l’eau (Figure 11d). Il est important pour les sections de toucher la grille tout d’abord, pas l’eau, pour déposer les éléments avec précision sur le centre de la grille (Figure 11d).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez les grilles avec des sections ainsi qu’une petite goutte d’eau sur la Formvar support film16 (Figure 12) et enlever l’excès d’eau à l’aide de papier filtre. Remarque : Le froissement du support film est souvent un problème lorsque les sections sont captées à l’aide d’une grille avec film support car membrane (sections) touche la membrane (film support) directement. Le problème d’avoir des rides sur le film support est considérablement réduit en plaçant une grille section portant ainsi qu’une petite goutte d’eau sur la Formvar support film16.</li>
</ol>8. coloration des sections16,24 (Figure 13)
<ol><li>Après que les sections sont complètement séchées, déchirer le film de Formvar de près les grilles et enlevez les grilles portant les sections.</li>
	<li>Définir les grilles dans la gorge de la coloration de tube16 dans l’ordre approprié (Figure 13) et tacher les sections avec uranyle acétate et plomb citrate24. Remarque : Il y a une rainure de 0,6 mm de profondeur le long de l’axe longitudinal du tube coupé avec une lame de rasoir. Le tube est utile pour empêcher un bris accidentel des films de prise en charge lorsque vous utilisez la pince à épiler, car la manipulation directe des grilles n’est pas nécessaire pendant le processus de coloration et lavage16.</li>
</ol>9. l’observation de coupes sériées (Figure 14)
<ol><li>Définissez les 5 grilles dans le porte-échantillon multiples dans l’ordre approprié (Figure 14 a), orientant l’axe long de la fente de grille perpendiculaire à l’axe de support du spécimen. Les poignées (flèches) des grilles n’ont pas à être coupé, parce que les « grille-fixateurs » ne touchent pas les poignées.</li>
	<li>Fixer les grilles avec « grille-fixateurs » (Figure 14 b) et insérez le porte-échantillon dans le microscope électronique à transmission. Remarque : Il est souvent utile de prendre des images de faible grossissement de toutes les sections de la cellule (Figure 15) pour trouver intéressant de micro-organismes ou de cellules en bon état sans la contamination et à la bonne fixation, avant de prendre des photos de la cellule cible.</li>
	<li>Photographier les cellules cibles dans toutes les sections de la cellule à fort grossissement.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode présentée ici ne nécessite aucun équipement coûteux. Il nécessite seulement un rack en aluminium (Figure 3), trois-fente grilles (Figure 6C), section porte-boucles (Figure 10 a), eau de surface-sensibilisation boucle (Figure 11 a) et un tube de coloration (Figure 13). Il y a plusieurs caractéristiques de la méthode actuelle. La grande partie de l’échantillon est ...

Technique de sectionnement ultramince série appropriée est indispensable pour étudier les cellules et les composants de la cellule en trois dimensions à l’échelle microscopique de l’électron. Nous avons étudié la dynamique du corps polaire du fuseau dans le cycle cellulaire des cellules de levure et révèle des changements morphologiques de leur ultrastructure au cours du cycle cellulaire et l’heure de répétition1,2,3, 4,,5. En 2006, nous avons inventé un nouveau mot « structome » en combinant la « structure » et '-ome' et défini comme le « informations structurelles quantitatives et en trois dimensions d’une cellule entière à l’échelle microscopique de l’électron » 6,7.
Par l’analyse structome, qui requiert la technique sérielle de sectionnement ultramince, il a été constaté qu’une cellule de levure de Saccharomyces cerevisiae et Exophiala dermatitidis avait environ 200 000 ribosomes7,8, un Escherichia coli cellule avait 26 000 ribosomes9, une cellule de Mycobacterium tuberculosis a 1 700 ribosomes10 et Myojin spirale bactéries avaient seulement 300 ribosomes11. Cette information est utile pour évaluer non seulement le taux de croissance dans chaque organisme, mais aussi dans l’identification des espèces9.
En outre, structome analyse conduit à la découverte d’un nouvel organisme ; Parakaryon myojinensis a été trouvé dans l’eaux profondes au large des côtes du Japon, dont la structure cellulaire étaient intermédiaires entre ceux des procaryotes et des eucaryotes12,13,14,15. À l’heure actuelle, série technique sectionnement ultramince est considérée comme si difficile qu’il faudrait beaucoup de temps à maîtriser. Dans cette étude, nous avons développé une méthode fiable dans lequel n’importe qui peut effectuer des coupes ultraminces série sans difficulté.

<table><tbody><tr><td>Appareil de fabrication Formvar</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>652</td><td>W 180 x P 180 x H 300 mm</td></tr><tr><td>Lame en verre</td><td>Matsunami Co. Ltd., Osaka-76</td><td></td> <td>x 26 x 1,3 mm</td></tr><tr><td>Rack en aluminium avec trous de 4 mm</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>658</td><td>W 30 x P 25 x H 3 mm, Reportez-vous à cet article</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd., </td><td></td><td>Tokyo-SMZ 645</td></tr><tr><td>Eclairage LED pour stéréomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd.,</td><td></td> <td>Tokyo-SM-LW 61 Ji</td></tr><tr><td>Platine de coupe</td><td>Sunmag Co.Ltd.,</td> <td>Tokyo-Mécanisme</td> <td>d’inclinaison équipé, Référez-vous à cet article</td></tr><tr><td>Eclairage LED pour platine de coupe</td><td>Sunmag Co.Ltd.,</td> <td>Tokyo-Référez-vous</td> <td>à cet article</td></tr><tr><td>Lame de coupe à ultrasons</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>5240</td><td>EM-240, Reportez-vous à ce papier</td></tr><tr><td>Couteau diamanté pour la taille</td><td>Diatome Co. Ltd.,</td> <td>Suisse-45</td><td>&deg ;</td></tr><tr><td>Couteau diamanté pour le sectionnement ultramince</td><td>Diatome Co. Ltd.,</td> <td>Suisse-45</td><td>&deg ;</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems,</td> <td>Vienne-Ultracut</td> <td>S</td></tr><tr><td>Mesa cut</td><td>Leica Microsystems, Vienna-Mirror</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0,5 % néoprène W solution</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>605</td><td></td></tr><tr><td>Grille spéciale en nickel à 3 fentes</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2458</td><td>Reportez-vous à ce document</td></tr><tr><td>Grille spéciale en cuivre à 3 fentes</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2459</td><td>Reportez-vous à cet article</td></tr><tr><td>Boucle de maintien de section</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>526</td><td>Reportez-vous à cet article</td></tr><tr><td>Boucle d’élévation de la surface de l’eau</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>527</td><td>Reportez-vous à cet article</td></tr><tr><td>Tube de coloration</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>463</td><td>Reportez-vous à cet article</td></tr><tr><td>Porte-échantillon multiple</td><td>JEOL Co. Ltd.,</td><td></td> <td>Tokyo-EM-11170</td></tr><tr><td>JEM-1400</td><td>JEOL Co. Ltd.,</td> <td>Tokyo-Microscope</td> <td>électronique à transmission</td></tr></tbody></table>

une méthode pour obtenir des coupes sériées ultraminces de micro-organismes en microscopie électronique à transmission

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observer les cellules et les composants de la cellule en trois dimensions à fort grossissement en microscopie électronique à transmission nécessite préparation ultraminces sériées du spécimen. Bien que la préparation des coupes sériées ultraminces est considéré comme très difficile, il est assez facile si on utilise la méthode appropriée. Dans cet article, nous montrons une procédure étape par étape pour obtenir en toute sécurité séries ultraminces de micro-organismes. Les points essentiels de cette méthode sont : 1) d’utiliser une partie importante de l’échantillon et ajuster les bords de surface et couteau de spécimen afin qu’ils soient parallèles entre eux ; 2) de la coupe des coupes sériées dans les groupes et éviter des difficultés à séparer les sections à l’aide d’une paire de mèches de cheveux lors de la récupération d’un groupe de coupes sériées sur les grilles de la fente ; 3) à utiliser une « boucle de Section-holding » et éviter de mélanger l’ordre des groupes de section ; 4) à utiliser une « boucle de l’eau de surface-sensibilisation » et s’assurer que les sections sont positionnées sur l’apex de l’eau et qu’ils touchent la grille en premier lieu, afin de les mettre dans la position désirée sur les grilles ; 5) d’utiliser le film support sur un rack en aluminium et rendre plus facile de récupérer les sections sur les grilles et pour éviter les plis du film soutien ; et 6) à utiliser un tube de coloration et d’éviter de casser accidentellement les films de soutien avec des pincettes. Cette nouvelle méthode permet d’obtenir des coupes sériées ultraminces sans difficulté. La méthode permet d’analyser les structures cellulaires des microorganismes à haute résolution en 3D, qui ne peut être atteint en utilisant la méthode d’ultramicrotome collecte ruban automatique et la série îlot ou le faisceau ionique focalisé, microscopie électronique à balayage.

Dans le présent protocole, les grilles de trois-fente ont été utilisés pour ramasser les coupes sériées. Les grilles sont en nickel ou cuivre. Les coupes sériées sont placés sur la fente centrale. Les fentes des deux côtés sont nécessaires pour afficher les sections en les ramassant avec la grille. Pour garder les grilles en parallèle avec les coupes sériées en les ramassant avec des pincettes (Figure 11d), la poignée est courbée (Figure ...

Cette étude présente des procédures fiables et faciles pour obtenir des coupes sériées ultraminces d’un micro-organisme sans matériel coûteux en microscopie électronique à transmission.

Une méthode pour obtenir des coupes sériées ultraminces de micro-organismes en microscopie électronique à Transmission

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser des coupes ultraminces en série de manière sûre et facile. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, en fournissant des informations structurelles quantitatives et tridimensionnelles sur une cellule entière au niveau microscopique électronique. Le principal avantage de cette technique est que la coupe ultramince en série peut être effectuée sans machine coûteuse, et des images de haute résolution peuvent être obtenues avec cette méthode.Pour commencer cette procédure, nettoyez la surface d'une lame de verre. Ensuite, immergez une moitié de la lame de verre dans la solution de Formvar à 1,5 % située dans la colonne supérieure de l'appareil de fabrication du film support en appuyant sur l'air à l'aide d'une poire en caoutchouc à travers le robinet à trois voies. Évacuez la solution de la colonne en ouvrant le robinet à trois voies et en relâchant l'air afin de réduire la pression.Ensuite, retirez la lame de verre de l'appareil et laissez-la sécher à l'air pour former un film à la surface de la lame. Grattez les quatre bords du film sur la lame de verre à l'aide d'une lame de rasoir. Après avoir soufflé sur la lame afin de faciliter la séparation du film, faites flotter le film en immergeant lentement la lame de verre dans l'eau selon un faible angle horizontal.Ensuite, récupérez le film de Formvar depuis l'eau à l'aide d'un support en aluminium percé de trous. Pour tailler le bloc d'échantillon à l'aide d'une lame de découpe ultrasonique et d'un rasoir sous microscope stéréoscopique, vérifiez tout d'abord la présence de cellules à la surface du bloc en observant l'extrémité du bloc au microscope optique. Puis, fixez le bloc d'échantillon dans le mandrin et placez le mandrin sur un dispositif de taille.Recouper les blocs à une taille de 0,7 sur 1,0 millimètre. Si la résine époxy est très dure, recouper d'abord la boîte à l’aide d’une lame de taille ultrasonique, puis affiner le bloc avec une lame de rasoir. Couper une épaule pour indiquer le sens de la coupe.Pour émousser le bloc d'échantillon à l'aide d'un couteau en diamant en utilisant le microtome, insérez le mandrin du bloc d'échantillon dans le porte-échantillon de l'ultramicrotome. Coupez la surface du bloc avec un couteau en diamant destiné à l'émouttage. Réglez le tranchant du couteau en diamant parallèlement à la face du bloc d'échantillon, et retirez la quantité minimale de surface d'échantillon afin de ne perdre aucun échantillon.Couper le bord gauche du bloc à l’aide du couteau de paraffinage en tournant le porte-couteau de 30 degrés vers la gauche. Ce bord deviendra le côté supérieur de l’échantillon lors du sectionnement en série. Ensuite, couper la surface du bloc à environ 100 micromètres du bord gauche de l’échantillon en tournant le porte-couteau de 30 degrés vers la droite.Cet bord devient le côté inférieur de l'échantillon lors de la coupe en série. Retirez le couteau de parage et faites pivoter le bloc d'échantillon de 90 degrés dans le sens horaire. Placez un couteau de microtomie ultramince sur le porte-couteau.Régler la surface de l'échantillon et le bord du couteau de manière à ce qu'ils soient parallèles l'un à l'autre en utilisant la plus grande partie de la surface de l'échantillon. Ensuite, appliquer du ruban adhésif sur l'adaptateur et le support d'adaptateur du microtome, puis couper le ruban au niveau de la limite. Retirer l'adaptateur avec l'échantillon du microtome et le placer sous la microscopie stéréo.Coupez la plus grande partie de l'échantillon avec une lame de rasoir, en laissant la partie fine à partir de laquelle seront obtenues les sections séries. Rendez les faces de section adhésives en déposant à l’aide d’une pipette Pasteur environ un microlitre de solution de Néoprène à 0,5 % sur l’échantillon destiné à la sectionnement en série. Ensuite, recouvrez entièrement l’échantillon de solution de Néoprène. Absorbez immédiatement l’excès de solution de Néoprène à l’aide d’un morceau de papier filtre placé près de l’échantillon.Ensuite, préparez trois grilles à fentes pour ramasser les coupes sérielles. Pour ce faire, courbez la poignée des grilles à 60 degrés et traitez les grilles avec une solution de néoprène à 0,5 %. Rendez ensuite les grilles hydrophiles par décharge luminescente.Replacer le bloc-échantillon sur la microtome à la même position en alignant les parties collées. Cela maintient la surface du bloc et le tranchant du couteau parfaitement parallèles l'un par rapport à l'autre. Ensuite, approcher le couteau de l'échantillon.Après avoir rempli le bac du couteau avec de l'eau, couvrez le microtome avec un couvercle en plastique afin d'éviter les courants d'air. Commencez à couper l'échantillon avec une épaisseur de section de 200 nanomètres. Après la coupe de la première section, réglez l'épaisseur de section à 70 nanomètres.Lorsque le nombre de coupes sérielles atteint 20, réglez l'épaisseur des sections à 10 nanomètres. Étant donné que le microtome ne peut pas découper des sections de 10 nanomètres d'épaisseur, aucune nouvelle section n'apparaît et les sections précédemment coupées se détachent du bord du couteau. Ensuite, réglez l'épaisseur des sections à 60 nanomètres.Cela produira des sections de 70 nanomètres car la machine ajoutera l'épaisseur précédente de 10 nanomètres. Enfin, réglez à nouveau l'épaisseur des sections sur 70 nanomètres et poursuivez la coupe jusqu'à l'obtention de sections de 1,8 millimètre de longueur. Pour prélever les sections en série, placez d'abord la boucle de maintien des sections sur le troisième groupe de sections.Ensuite, placer la boucle de remontée de la surface de l'eau sur la platine du couteau. Placer la boucle de la WSRL juste au-dessus des sections en série en déplaçant son manche et son support. Abaisser la boucle de la WSRL jusqu'à la surface de l'eau afin que la boucle entoure les sections.Abaissez la boucle en tournant la vis vers le bas afin que la surface de l’eau s’élève par tension superficielle. Déplacez la section au centre de la boucle. Placez-la au sommet de la surface de l’eau et ajustez l’orientation de la section à l’aide d’un brin de cheveu.Prendre les groupes de sections en les touchant avec une grille fendue nue, à l’aide de pinces, et en maintenant la grille parallèle à la surface de l’eau. Placer les grilles avec les sections, accompagnées d’une petite goutte d’eau, sur le film de support Formvar. Retirer l’excès d’eau à l’aide de papier filtre.Une fois les sections complètement séchées, déchirez le film de Formvar autour des grilles et retirez les grilles portant les sections. Placez les grilles dans la rainure du tube de coloration dans le bon ordre, puis colorez les sections avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb. Placez les cinq grilles dans le porte-échantillons multiple dans le bon ordre, en orientant l'axe long de la fente de la grille perpendiculairement à l'axe du porte-échantillons.Fixer la grille avec des fixateurs de grille et insérer le porte-échantillon dans le microscope électronique en transmission. Procéder à la prise d'images des cellules cibles et de toutes les sections cellulaires à fort grossissement. On observe ici une vue à faible grossissement de cinq grilles portant des sections sérielles.De 18 à 25 sections ont été montées sur une même grille. Remarquez que les sections sont reliées entre elles et ont la même épaisseur. Des sections sériées de myogenèse du péricarine sont présentées ici.La figure montre 12 des 67 sections complètes. On a observé que cette cellule possède un grand nucléïde composé de fibres d'ADN nu, d'une membrane nucléïde unique et d'endosymbiotes ressemblant à des bactéries, mais sans mitochondries. Ainsi, cet organisme semble être une forme de vie intermédiaire en cours d'évolution d'un procaryote vers un eucaryote.Des sections sérielles d'Escherichia coli sont montrées ici. La figure présente 12 sections complètes. Fait intéressant, on a découvert que cette cellule contenait 21 700 ribosomes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser des coupes ultraminces en série. Une fois maîtrisée, cette technique peut être effectuée en trois heures si elle est réalisée correctement.

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Ingénierie

Source : Lutz, D., et.al.  Évaluation des paramètres de neuroplasticité ultrastructurale après transduction in utero du cerveau et de la moelle épinière de souris en développement. J. Vis. Exp. (2019). Cette vidéo montre la préparation et l’analyse en microscopie électronique à transmission (MET) d’une section du cerveau d’un bébé souris. Le protocole commence par un tissu fixé au tétroxyde d’osmium intégré dans de la résine, suivi d’un découpage précis pour isoler la région d’intérêt et d’une...

Analyse ultrastructurale d’une section de cerveau de souris à l’aide de la microscopie électronique à transmission

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Découvrez une méthode fiable pour obtenir des coupes sériées ultraminces de micro-organismes en microscopie électronique à transmission sans équipement coûteux. Cette technique fournit des informations structurales quantitatives tridimensionnelles de cellules entières.

Une méthode pour obtenir des coupes sériées ultraminces de micro-organismes en microscopie électronique à Transmission

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