Name: RVB et l’imagerie spectrale racine pour le phénotypage de l’usine et la recherche en physiologie : montage expérimental et des protocoles d’imagerie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Découvrez le phénotypage racinaire par imagerie RVB et spectrale pour étudier l'architecture et la physiologie des racines en rhizobox. Cette méthode combine techniques d'imagerie pour analyser la dynamique racinaire et améliorer la résistance aux stress abiotiques.

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Les auteurs reconnaissent le financement de l’Austrian Science fonds FWF via le projet numéro P 25190-B16 (les racines de la résistance à la sécheresse). Mise en place de l’infrastructure d’imagerie hyperspectrale a été soutenu financièrement par le gouvernement fédéral de Basse Autriche (Land Niederösterreich) via le projet K3-F-282/001-2012. Un financement supplémentaire pour l’expérience de la betterave à sucre a été reçue de recherche AGRANA &#38; Innovation Center GmbH (ARIC). Les auteurs remercient Craig Jackson pour le support technique au cours de l’expérience et anglaise correction du manuscrit. Nous remercions également Markus Freudhofmaier qui ont contribué à la mise en place le programme d’installation d’imagerie de RVB et Josef Schodl pour la construction de l’installation de rhizobox.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les protocoles prévoient deux approches complémentaires des sols cultivés imagerie du système racinaire. Une étape cruciale pour des résultats expérimentaux fiables se remplit de la rhizoboxes qui doit s’assurer d’une couche de substrat homogène et même à la vitre avant d’offrir un contact serré racine-sol à la fenêtre d’observation et éviter les trous d’air. C’est la principale raison d’utiliser la terre tamisée relativement fine de &#60; 2 mm : agrégats plus gros aboutir à la morphologie de surface supérieure à la fenêtre d’observation avec des vides entre les agrégats. Outre un risque plus élevé de déshydratation de bout de racine, cela exige également des techniques de traitement des images plus complexes pour la cartographie de l’eau31.
Modifications du protocole est donc surtout au remplissage rapide et amélioré de rhizoboxes. Actuellement les temps de remplissage est environ 30 minutes par zone. En outre, utilisation de rhizoboxes avec deux fenêtres en verre pour l’imagerie des deux côtés et modifications pour optimiser l’homogénéité d’éclairage pour les meilleures images RVB sont testés. Prolongation de matériel peut-être aussi envisager d’intégration des optodes planaire32 mais aussi capacité d’imagerie33 dans le système de rhizobox. Cependant, c’est au-delà des activités actuelles de mise à niveau.
Modifications de logiciels se concentrent sur l’enregistrement automatique des images à fusionner le haut et en bas RBG photos34. Pour hyperspectral extraction de caractéristique sans supervision avancée d’imagerie approches28 ainsi que des méthodes de détection de cible supervisée plus sensibles tels que SVMs35 sont testés. Les données hyperspectrales potentiellement permettant ainsi que pour l’évaluation de multiples du sol, la rhizosphère et racine propriétés36. En outre, il vise à développer un (semi) automatisée de logiciels pour les images de racine rhizobox basé sur une version modifiée du système racinaire Analyzer37 à quantifier morphologiques (longueur, diamètre, surface) ainsi que des caractères architecturaux (fréquence de ramification, ramification des angles).
La principale limitation du protocole par rapport aux approches d’imagerie 3D est la restriction à la surface visible racine et les propriétés de la rhizosphère. Toutefois, il a été démontré que les traits de racines visibles sont un proxy fiable pour l' ensemble du système racinaire21. La technique de rhizobox peut se combiner aisément avec un échantillonnage destructeur traditionnel (lavage) à la fin de croissance dynamique d’imagerie afin de valider la relation entre le visible vs total système racinaire des traits. Comme cette relation pourrait varier entre espèces21, échantillonnage destructeur est recommandé pour garantir inférence fiable des caractéristiques visibles pour toute nouvelle série de phénotypage avec une espèce de cultures différentes.
Le principal avantage du protocole présenté ici est la combinaison de conditions de croissance réalistes (sol), le débit potentiel relativement élevé pour l’imagerie RVB et l’inférence sur la fonctionnalité de racine (par exemple l’absorption d’eau) via les données de racine et de la rhizosphère chimiométriques d’imagerie hyperspectrale résolues dans le temps. Ainsi les méthodes surmonte les restrictions d’inférence dans des semis à haut débit et racine de non-sol imagerie méthodes14, tandis que cela permet partiellement aperçus de phénotypage profonde des processus fonctionnels avec complexité moins expérimentale et des débits plus élevés par rapport aux méthodes 3D avancées15.
Dans les expériences à venir le protocole servira à étudier l’effet des mycorhizes sur le développement du système racinaire et la fonctionnalité des légumineuses ainsi en ce qui concerne les caractéristiques de racine de phénotypage d’espèces de cultures de couverture en ce qui concerne la structure du sol, l’azote et carbone vélo.

Racines offrent plusieurs fonctions essentielles pour les plantes telles que le stockage des assimilats, ancrage des plantes terrestres dans le sol et l’absorption et le transport de l’eau et les nutriments1. Du point de vue évolutif, la formation des axes racine est considérée comme une condition préalable fondamentale à l’origine des plantes de terre2. Malgré ce rôle important, historiquement les racines ont occupé seulement une position marginale dans la recherche biologique. Plus ces derniers temps, cependant, il est scientifique un intérêt croissant dans des systèmes de racine de plante comme en témoigne la Figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig1.jpg"> 
Figure 1 : Importance des racines plant sciences. Nombre de racines des études en pourcentage de toutes les études de plantes publiés dans des revues SCI connexes au cours des dernières décennies. Résultat de Scopus en utilisant les mots-clés « plante » et « des plantes et racines » de recherche. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Deux raisons principales peuvent être hypothétiquement sous-tendent les récentes avancées dans la recherche de la racine. Première végétation terrestre est exposée à des stress environnementaux plus fréquents à la suite de changements mondiaux3. Dans le contexte de la production agricole végétale, on estime que dans le monde environ 30 % de la surface agricole sont limitées par l’eau et phosphore4,5. Réduction du stress du rendement des cultures sont des raisons principales pour les écarts de rendement importantes qui sont estimés dans le monde au moins 50 % de la productivité potentielle pour les cultures pluviales agro-écosystèmes6. En plus de la disponibilité des ressources faibles, cela est également liée à l’efficacité d’utilisation de ressources pauvres, c'est-à-dire insuffisante capacité d’une usine d’exploiter les ressources disponibles7. Cela se traduit par des pertes de ressources mobiles tels que le nitrate qui peut affecter négativement les autres écosystèmes. L’efficacité d’utilisation globale d’azote actuel par exemple est estimée à 47 %8. Meilleure ressource efficience grâce à des méthodes de gestion améliorée de l’utilisation et des cultivars est donc d’une grande importance pour les deux une croissance de la production agricole aussi bien en ce qui concerne la durabilité de l’environnement. Dans cette usine de contexte racines sont considérés comme un objectif clé pour l’amélioration des cultures et culture systèmes9,10.
Un deuxième fond important pour l’intérêt récent pour les racines des plantes est une avancée technologique dans les méthodes de mesure. Méthodes de racine ont longtemps été limités par deux grands défis : pour la mesure des racines de plantes qui poussent dans le sol, ils devaient être isolés pour la quantification, pour la plupart en lavant11, ainsi déranger la disposition architecturale des axes de racine. Observation de racine in situ à l’aide d’excavation méthodes, conservant ainsi la situation naturelle des racines dans le sol, ont été utilisés pour la description botanique12. Encore, ils sont très coûteuses en temps et donc ne répondent pas aux exigences de débit d’analyse comparative système structural-fonctionnelle de la racine. D’autre part haut débit des méthodes pour la mesure d’architecture de racine ont été faites principalement sur des milieux artificiels et pour des semis de plantes13 où l’extrapolation à l’environnement naturel de croissance des plantes est discutable14.
Le boom récent de recherche de la racine est intimement lié à l’avance en imagerie méthodes15. Imagerie des approches en études de racine peut être grossièrement regroupé en trois types. Tout d’abord il y a des méthodes 3D haute résolution tels que CT et IRM16. Ces méthodes sont plus aptes à étudier les processus d’interaction des racines avec le sol, tels que la sécheresse provoquée par le xylème embolie17. En général, ils sont appliqués aux échantillons relativement petits où ils permettent des observations détaillées. Une comparaison de CT et MRI pour pots de tailles différente et l’imagerie de radicelles est fournie en18. Deuxièmement, il y a de19,des méthodes d’imagerie haut débit20. Ces méthodes sont pour la plupart sur la base commune 2D RGB imagerie des racines qui poussent sur des milieux artificiels (gel, papier de germination) où contraste élevé permettant une dissection relativement simple entre racines et l’arrière-plan. Elles sont appropriées pour la comparaison à haut débit entre traits racine des plantules de génotypes de cultures différentes en vertu de conditions artificielles normalisés croissant13. Entre ces deux approches sont rhizobox méthodes : ils utilisent l’imagerie 2D des racines qui poussent dans le sol sur longue période et ont un débit moyen de21,22. Un défi récent à l’imagerie de la racine (2D) consiste à capturer également indicateurs de fonctionnalité de racine en plus de la description de la structure23.
Dans le présent document, nous présentons les protocoles expérimentaux d’imagerie rhizobox cultivé le système racinaire à l’aide de (i) une simple et peu coûteuse sur mesure RVB d’imagerie configuration et (ii) une installation d’imagerie de NIR plus complexe. Exemple résultats obtenus de ces deux configurations sont montrés et discutés dans le contexte de phénotypage de plante et de la recherche en physiologie végétale.

<table><tbody><tr><td>Rhizobox</td><td>Technisches B&uuml ; ro f&uuml ; r Bodenkultur</td><td>Constructeur</td><td></td>expérimental</tr><tr><td>Lampes LED ATUM HORTI 600</td><td>Klutronic</td><td>AHI10600F</td><td></td></tr><tr><td>Tube fluorescent HiLite T5 Day</td><td>Juwel Aquarium</td><td>86324</td><td></td></tr><tr><td>Tube lumineux UV Eurolite 45cm slim 15 W</td><td>Conrad</td><td>593384 - 62</td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS 6D</td><td>Canon Austria GmbH</td><td>8035B024</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5 Extended Version 12.0 x 32</td><td>Adobe Systems Software Ireland Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WinRhizo Pro c. 2013</td><td>Regent Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xeva-1.7-320 Caméra SWIR</td><td>Xenics</td><td>XEN-000105</td><td></td></tr><tr><td>Spectrographe Imspector N25E</td><td>Specim</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanner d’imagerie hyperspectrale</td><td>Carinthian Tech Research AG</td><td>Constructeur expérimental</td><td>Conception et assemblage de scanner d’imagerie hyperspectrale et de logiciel</td></tr><tr><td>Matlab R2106a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Y compris les boîtes à outils pour le traitement d’images, le traitement du signal et les statistiques et l’apprentissage automatique</td></tr><tr><td>AP4 Poromoeter</td><td>Delta-T-Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-3100C Compteur de surface</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BASF Feuilles de polystyrène Styradur</td><td>Obi Baumarkt</td><td>9706318</td><td>Différents types de feuilles de polystyrène ou d’autres matériaux séparant différemment le sol humidifié peuvent être utilisés</td></tr></tbody></table>

rvb et l’imagerie spectrale racine pour le phénotypage de l’usine et la recherche en physiologie : montage expérimental et des protocoles d’imagerie

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Meilleure compréhension des dynamiques de racine de plante est indispensable pour améliorer l’utilisation efficace des ressources des systèmes agricoles et augmenter la résistance des cultivars de contre les stress environnementaux. Un protocole expérimental est présenté pour RVB et imagerie hyperspectrale des systèmes racinaires. L’approche utilise rhizoboxes où les plantes poussent dans les sols naturels au cours de plus de temps pour observer des systèmes racinaires entièrement développées. Les paramètres expérimentaux sont illustrées pour évaluer rhizobox des plantes sous stress hydrique et d’étudier le rôle des racines. Une installation d’imagerie RVB est décrite pour la quantification rapide et bon marchée du développement racinaire au fil du temps. Imagerie hyperspectrale améliore la segmentation de la racine de l’arrière-plan du sol par rapport au Seuillage couleur RVB. La force particulière de l’imagerie hyperspectrale est l’acquisition d’informations chimiométriques sur le système de racine-sol pour compréhension fonctionnelle. Cela est démontré avec cartographie contenu eau de haute résolution. Imagerie spectrale est toutefois plus complexe dans l’acquisition d’images, de traitement et d’analyse par rapport à l’approche de RVB. Une combinaison des deux méthodes peut optimiser une évaluation détaillée du système racinaire. Exemples d’applications intégrant les traits au-dessus du sol et racine sont donnés dans le contexte de la recherche en physiologie végétale phénotypage et plante. Amélioration de l’imagerie de la racine peut être obtenue en optimisant la qualité de l’image RVB avec le meilleur éclairage à l’aide de différentes sources de lumière et par extension des méthodes d’analyse image à déduire sur les propriétés de la zone racine de données spectrales.

Un protocole expérimental est présenté pour évaluation des sols cultivés des systèmes racinaires plante avec RVB et imagerie hyperspectrale. Combinaison du temps d’image RVB scanne de série avec les informations de Chimiométrie de hyperspectral optimise les aperçus de la dynamique des racines végétales.

RVB et l’imagerie spectrale racine pour le phénotypage de l’usine et la recherche en physiologie : montage expérimental et des protocoles d’imagerie

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des informations complètes sur les racines de plantes poussant dans des rhizoboxes remplies de sol, en combinant différentes méthodes d'imagerie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du phénotypage et de l'amélioration des plantes, telles que la contribution de différentes architectures racinaires à une meilleure résistance au stress abiotique. Le principal avantage de cette approche réside dans le fait qu'elle combine l'imagerie RVB pour l'architecture racinaire et l'imagerie hyperspectrale pour la fonctionnalité racinaire.Le potentiel de l'imagerie hyperspectrale appliquée aux racines s'étend à un large éventail de paramètres de la rhizosphère, car les informations spectrales peuvent révéler des changements physico-chimiques à petite échelle induits par les racines des plantes. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de remplissage de la rhizoboîte doivent être effectuées avec soin. Sinon, la croissance racinaire et la visibilité des racines seront négativement affectées.Commencez cette procédure par la préparation des rhizoboxes pour le remplissage du substrat, comme indiqué dans le protocole écrit. Humidifiez préalablement le sol sec jusqu'à une teneur en eau gravimétrique de 0,108 gramme par gramme en ajoutant 400 grammes d'eau pour 3 705 grammes de sol sec. Mélangez délicatement le sol et l'eau afin d'obtenir une distribution homogène de l'humidité.Disruptez manuellement les agrégats plus gros afin de maintenir la taille des particules inférieure ou égale à deux millimètres. Il est essentiel d'obtenir une couche homogène de sol contre la fenêtre d'observation du gaz, en évitant les poches d'air. Les extrémités des racines des plantes se dessèchent rapidement lorsqu'elles poussent dans des poches d'air.De plus, la qualité de l'image spectrale pour la cartographie de l'eau est également affectée négativement. Remplir les rhizoboîtes ouvertes avec le sol pré-humidifié et le tasser délicatement à l’aide d’une feuille de polystyrène recouvrant le volume intérieur de la boîte, afin d’obtenir une densité apparente homogène de 1,3 gramme par centimètre cube. Ajouter la quantité restante d’eau nécessaire pour atteindre la teneur en eau cible de 0,31 centimètre cube par centimètre cube en pulvérisant à la surface à l’aide d’un flacon pulvérisateur.Veillez à une taille de gouttelette réduite afin d'éviter la dégradation de la structure de surface, ainsi qu'un mouillage homogène. Maintenez la boîte sur une balance pendant la pulvérisation afin de surveiller la quantité d'eau réellement ajoutée au substrat. Laissez l'eau se redistribuer pendant 10 minutes, puis appuyez le verre contre la surface et fixez-le avec les rails métalliques latéraux.Le poids final moyen des rhizoboxes avec le substrat humidifié était de 17 818 ± 68 grammes. Équiper la chambre climatique de huit lampes DEL fournissant une illumination homogène de 450 micromoles par mètre carré par seconde, avec des pics spectraux à 440 et 660 nanomètres, pour une croissance végétale optimale. Après avoir réglé les paramètres ambiants selon les besoins de la plante et de l'expérience, couvrir la fenêtre en verre avec une plaque en bois afin de maintenir la zone racinaire à l’obscurité et d’éviter la croissance d’algues due à la pénétration de la lumière à travers la surface en verre.Ensuite, placer les rhizoboxes en inclinaison à 45 degrés à l'aide d'un cadre métallique adéquat. Cela maximise la croissance racinaire vers la surface en verre grâce à la gravitropie. Pour l'imagerie racinaire RGB, éclairer le rhizobox à l'aide de quatre tubes fluorescents de 24 watts fixés à une distance de 80 centimètres du rhizobox.Montez également quatre tubes UV de 15 watts à 20 centimètres du rhizobox pour une illumination alternative, en exploitant l'autofluorescence racinaire en cas de faible contraste entre la racine et le fond du substrat de couleur claire. Allumez les lampes UV, puis fixez le rhizobox à imager dans le support de la boîte d'imagerie. Ensuite, prenez deux images pour couvrir la moitié supérieure et la moitié inférieure d'un rhizobox, avec un recouvrement d'environ trois centimètres.Acquérez et traitez les images RVB conformément au protocole décrit dans le texte. Enfin, effectuez l'analyse des images racinaires RVB acquises, puis vérifiez s'il existe des régions non correspondantes. Dans ce cas, définissez une région d'exclusion et relancez l'analyse.Pour les racines non classifiées, ajoutez des classes de couleur supplémentaires et redémarrez l'analyse. Pour les éléments classés incorrectement comme des racines, activez ou augmentez les options de filtrage des débris et des bords irréguliers. Effectuez l'acquisition d'images en déterminant d'abord les temps d'intégration de la caméra pour l'analyse de la rhizoboîte et pour l'étalon blanc dans le logiciel de la caméra.Pour ce faire, ouvrez l'interface graphique d'imagerie et déplacez la caméra à une position du rhizobox où des racines sont présentes. Réglez le temps d'intégration de la caméra en visant un objet lumineux de manière à utiliser environ 85 % de la plage dynamique totale de la caméra, tel qu'indiqué par l'histogramme affiché par le logiciel. Le réglage correct du temps d'intégration pour différents substrats et tissus racinaires est essentiel afin d'exploiter pleinement la plage dynamique de la caméra infrarouge et d'éviter toute perte d'information due à un dépassement de cette plage.Répétez le processus pour l'étalon blanc en déplaçant le système de positionnement de la caméra afin de cibler l'étalon blanc avant de fermer le logiciel de la caméra. Ensuite, ouvrez l'interface graphique d'imagerie Matlab et saisissez tous les paramètres du scan actuel de la rhizobox. Acquérez les étalons noir et blanc avant chaque série d'acquisition, une fois par jour.L'étalon noir représente le bruit de la caméra, tandis que l'étalon blanc donne la réflectivité maximale. Ces données sont nécessaires pour la normalisation des images pendant le prétraitement. Définir si l'ensemble du rhizobox ou seulement une partie de celui-ci est scanné.Dans le cas présent, l'ensemble des rhizoboxes est imagé. Ensuite, lancez la numérisation. Pour la mesure spectrale de la teneur en eau, une rhizobox d'étalonnage est nécessaire.Divisez une rhizoboîte en compartiments de cinq centimètres à l’aide de feuilles de polystyrène afin de les remplir avec du sol à différentes teneurs en eau. Analysez la rhizoboîte de calibration avec les mêmes paramètres que ceux utilisés pour les rhizoboîtes plantées. À titre d'exemple, pour combiner les caractéristiques racinaires et aériennes, utilisez le poromètre foliaire afin de mesurer la conductance stomatique.Équilibrez l'appareil aux conditions ambiantes pendant au moins une heure dans la chambre climatique. Effectuez les mesures sur au moins trois feuilles par plante. Une image représentative de la croissance racinaire du cultivar de betterave sucrière, Ferrara, basée sur une imagerie RVB, est présentée ici.À 35 jours après le semis, les racines des plantes se sont allongées jusqu'à atteindre le fond de la rhizoboîte. Certains axes racinaires situés en haut de la rhizoboîte n'ont pas pu être segmentés à partir des images RVB. La sénescence des racines basales les plus anciennes modifie leur couleur, qui devient brune.Par conséquent, la séparation entre ces racines et le fond du sol basée sur un seuil de couleur échoue. En utilisant l'imagerie hyperspectrale, la segmentation repose sur des caractéristiques spectrales différentes entre le premier plan racinaire et le fond du sol. Cela améliore le résultat de la segmentation.Les différences de longueur racinaire mesurée par rapport à une image de référence suivie manuellement sont de seulement 1,5 %. De plus, l'imagerie spectrale permet une cartographie fine de la teneur en eau autour de la racine afin de déduire l'absorption hydrique. Ici, le squelette racinaire est représenté en noir. Les zones plus claires montrent des régions de plus grande déplétion en eau près des axes racinaires.Alors que les zones d'un bleu plus foncé représentent des régions ayant une teneur en eau du sol plus élevée, hors de portée des racines. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment remplir correctement les rhizoboxes afin d'assurer une croissance et une visibilité satisfaisantes des racines. Ceci constitue la base pour des images ultérieures et des résultats représentatifs de phénotypage racinaire.Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes de classification spectrale, telles que le regroupement par K-moyennes ou les machines à vecteurs de support, peuvent être effectuées afin d'obtenir des informations approfondies sur les propriétés des racines et du rhizosphère, comme la sénescence et la décomposition racinaires. Une fois mise en place, cette technique permet de phénotyper de manière exhaustive les systèmes racinaires ainsi que la réponse au stress abiotique. Un ensemble de 10 cultivars peut être caractérisé avec une durée expérimentale totale inférieure à trois mois.

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RVB et l’imagerie spectrale racine pour le phénotypage de l’usine et la recherche en physiologie : montage expérimental et des protocoles d’imagerie

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