RVB et l’imagerie spectrale racine pour le phénotypage de l’usine et la recherche en physiologie : montage expérimental et des protocoles d’imagerie

Un protocole expérimental est présenté pour évaluation des sols cultivés des systèmes racinaires plante avec RVB et imagerie hyperspectrale. Combinaison du temps d’image RVB scanne de série avec les informations de Chimiométrie de hyperspectral optimise les aperçus de la dynamique des racines végétales.

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des informations complètes sur les racines des plantes poussant dans des rhizoboxes remplies de sol en combinant différentes méthodes d’imagerie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la phénotypage et de la sélection végétales, telles que la contribution de différentes architectures racinaires, à une meilleure résistance au stress abiotique. Le principal avantage de cette approche est qu’elle combine l’imagerie RVB pour l’architecture racine et l’imagerie hyperspectrale pour la fonctionnalité racine.

Le potentiel de l’utilisation de l’imagerie hyperspectrale pour les racines s’étend à un large éventail de paramètres de la rhizosphère, car l’information spectrale peut révéler des changements physicochimiques à petite échelle introduits par les racines des plantes. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de remplissage de la rhizobox doivent être effectuées avec soin. Sinon, la croissance et la visibilité des racines seront affectées négativement.

Commencez cette procédure par la préparation des rhizobox pour le remplissage du substrat comme détaillé dans le protocole textuel. Pré-mouillez le sol sec à une teneur en eau gravimétrique de 0,108 gramme en ajoutant 400 grammes d’eau pour 3 705 grammes de sol sec. Mélangez doucement le sol et arrosez pour obtenir une répartition homogène de l’eau.

Perturbez manuellement les agrégats plus grands pour maintenir la taille des particules inférieure ou égale à deux millimètres. Il est essentiel d’obtenir une couche homogène de sol à côté de la fenêtre d’observation des gaz, en évitant les trous d’air. Les extrémités des racines des plantes se déshydratent rapidement, poussant dans des trous d’air.

De plus, la qualité de l’image spectrale pour la cartographie de l’eau est affectée négativement. Remplissez le sol pré-mouillé dans les rhizoboxes ouverts et compactez-le doucement à l’aide d’une feuille de polystyrène pour couvrir le volume intérieur de la boîte, ce qui permet d’obtenir une densité apparente homogène de 1,3 gramme par centimètre cube. Ajoutez la quantité d’eau restante pour atteindre la teneur en eau cible de 0,31 centimètre cube par centimètre cube en pulvérisant sur la surface avec un flacon pulvérisateur.

Assurez-vous d’une petite taille de goutte pour éviter la dégradation de la structure de surface, ainsi qu’un mouillage homogène. Gardez la boîte en équilibre pendant la pulvérisation pour surveiller la quantité d’eau réellement ajoutée au substrat. Laissez l’eau se redistribuer pendant 10 minutes, puis appuyez le verre sur la surface et fixez-le avec les rails métalliques latéraux.

Le poids final moyen des rhizoboîtes avec substrat mouillé était de 17 818 plus ou moins 68 grammes. Équipez la salle climatique de huit lampes LED fournissant un éclairage homogène de 450 micromoles par mètre carré par seconde avec des pics spectraux à 440 et 660 nanomètres pour une croissance optimale des plantes. Après avoir réglé les paramètres ambiants en fonction de la plante et des besoins expérimentaux, couvrez la fenêtre en verre avec une plaque de bois pour garder la zone racinaire dans l’obscurité et éviter la croissance d’algues due à la pénétration de la lumière à travers la surface en verre.

Ensuite, placez les rhizobox à une inclinaison de 45 degrés à l’aide d’un cadre métallique adéquat. Cela maximise la croissance des racines vers la surface du verre en raison du gravitropisme. Pour l’imagerie racinaire RVB, illuminez la rhizobox à l’aide de quatre tubes fluorescents de 24 watts fixés à une distance de 80 centimètres de la rhizobox.

Montez également quatre tubes UV de 15 watts à 20 centimètres de l’éclairage alternatif de la rhizobox, en utilisant l’autofluorescence racinaire en cas de faible contraste entre la racine et le fond de substrat de couleur vive. Allumez les lampes UV, puis montez la rhizobox à imager dans le support de la boîte d’imagerie. Ensuite, prenez deux images pour couvrir les moitiés supérieure et inférieure d’une rhizobox avec un chevauchement d’environ trois centimètres.

Acquérir et traiter les images RBG comme indiqué dans le protocole texte. Enfin, exécutez l’analyse des images racines RBG acquises et contrôlez ensuite s’il existe des régions non concordantes. Dans ce cas, définissez une région d’exclusion et relancez l’analyse.

Pour les racines non classées, ajoutez des classes de couleurs supplémentaires et relancez l’analyse. Pour les éléments classés à tort comme racines, activez ou augmentez les options de filtrage des débris et des bords rugueux. Effectuez l’acquisition d’images en déterminant d’abord les temps d’intégration de la caméra pour le balayage rhizobox et la norme blanche dans le logiciel de la caméra.

Pour ce faire, ouvrez l’interface graphique d’imagerie et déplacez la caméra à une position de la rhizobox où les racines sont présentes. Ajustez le temps d’intégration de la caméra ciblant un objet lumineux de manière à ce qu’environ 85 % de la plage dynamique complète de la caméra soit utilisée sur l’histogramme affiché par le logiciel. Il est essentiel de régler correctement le temps d’intégration pour différents substrats et tissus racinaires afin d’exploiter pleinement la plage dynamique de la caméra infrarouge en évitant toute perte d’information en dépassant sa portée.

Répétez le processus pour l’étalon blanc en déplaçant le système de positionnement de l’appareil photo pour cibler l’étalon blanc avant de fermer le logiciel de l’appareil photo. Ensuite, ouvrez l’interface graphique d’imagerie Matlab et entrez tous les paramètres à partir de l’analyse actuelle de la rhizobox. Acquérez les étalons sombre et blanc avant chaque exécution d’imagerie une fois par jour.

La norme sombre représente le bruit de la caméra, tandis que la norme blanche donne la réflectivité maximale. Ces données sont nécessaires à la normalisation de l’image pendant le prétraitement. Définissez si la rhizobox entière ou seulement une partie de celle-ci est scannée.

Dans le cas présent, des rhizobox entières sont imagées. Lancez ensuite l’analyse. Pour la mesure spectrale de la teneur en eau, une rhizobox d’étalonnage est nécessaire.

Subdivisez une rhizobox en compartiments de cinq centimètres à l’aide de feuilles de polystyrène pour les remplir de terre à différentes teneurs en eau. Scannez la rhizobox d’étalonnage avec les mêmes paramètres que ceux utilisés pour les rhizobox plantées. À titre d’exemple, pour combiner les traits racinaires et aériens, procurez-vous le poromètre foliaire pour mesurer la conductance des stomates.

Équilibrez l’appareil aux conditions ambiantes pendant au moins une heure dans la chambre climatique. Prenez des mesures à partir d’au moins trois feuilles par plante. Une image représentative de la croissance des racines d’un cultivar de betterave sucrière, Ferrare, basée sur l’imagerie RVB est présentée ici.

35 jours après le semis, les racines des plantes se sont allongées pour atteindre le fond de la rhizobox. Certains axes racines en haut de la rhizobox n’ont pas pu être segmentés à partir d’images RVB. La sénescence des racines basales les plus anciennes change de couleur en brun.

Par conséquent, la séparation entre ces racines et le fond du sol basée sur un seuil de couleur échoue. À l’aide de l’imagerie hyperspectrale, la segmentation est basée sur différentes caractéristiques spectrales de l’avant-plan des racines et de l’arrière-plan du sol. Cela améliore le résultat de la segmentation.

Les différences de longueur de racine mesurée par rapport à une image de référence suivie manuellement ne sont que de 1,5 %. De plus, l’imagerie spectrale permet une cartographie fine de la teneur en eau autour de la racine pour déduire l’absorption d’eau. Ici, le squelette de la racine est représenté en noir. Les zones plus claires montrent des régions d’appauvrissement en eau plus élevé près des axes racinaires.

Alors que les zones bleu plus foncé représentent les régions où la teneur en eau du sol est plus élevée, hors de portée des racines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de remplir correctement les rhizoboxes afin d’assurer une croissance et une visibilité satisfaisantes des racines. C’est la base de l’imagerie ultérieure et des résultats représentatifs du phénotypage radiculaire.

En suivant cette procédure, d’autres méthodes de classification spectrale, telles que le clustering de K-means ou les machines à vecteurs de support, peuvent être utilisées pour obtenir des informations approfondies sur les propriétés de la racine et de la rhizosphère telles que la sénescence et la décomposition de la racine. Une fois établie, cette technique vous permet de phénotyper de manière exhaustive les systèmes racinaires et la réponse au stress abiotique. Un ensemble de 10 cultivars peut être caractérisé avec une durée expérimentale totale de moins de trois mois.