RVB et l’imagerie spectrale racine pour le phénotypage de l’usine et la recherche en physiologie : montage expérimental et des protocoles d’imagerie

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des informations complètes sur les racines de plantes poussant dans des rhizoboxes remplies de sol, en combinant différentes méthodes d'imagerie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du phénotypage et de l'amélioration des plantes, telles que la contribution de différentes architectures racinaires à une meilleure résistance au stress abiotique. Le principal avantage de cette approche réside dans le fait qu'elle combine l'imagerie RVB pour l'architecture racinaire et l'imagerie hyperspectrale pour la fonctionnalité racinaire.

Le potentiel de l'imagerie hyperspectrale appliquée aux racines s'étend à un large éventail de paramètres de la rhizosphère, car les informations spectrales peuvent révéler des changements physico-chimiques à petite échelle induits par les racines des plantes. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de remplissage de la rhizoboîte doivent être effectuées avec soin. Sinon, la croissance racinaire et la visibilité des racines seront négativement affectées.

Commencez cette procédure par la préparation des rhizoboxes pour le remplissage du substrat, comme indiqué dans le protocole écrit. Humidifiez préalablement le sol sec jusqu'à une teneur en eau gravimétrique de 0,108 gramme par gramme en ajoutant 400 grammes d'eau pour 3 705 grammes de sol sec. Mélangez délicatement le sol et l'eau afin d'obtenir une distribution homogène de l'humidité.

Disruptez manuellement les agrégats plus gros afin de maintenir la taille des particules inférieure ou égale à deux millimètres. Il est essentiel d'obtenir une couche homogène de sol contre la fenêtre d'observation du gaz, en évitant les poches d'air. Les extrémités des racines des plantes se dessèchent rapidement lorsqu'elles poussent dans des poches d'air.

De plus, la qualité de l'image spectrale pour la cartographie de l'eau est également affectée négativement. Remplir les rhizoboîtes ouvertes avec le sol pré-humidifié et le tasser délicatement à l’aide d’une feuille de polystyrène recouvrant le volume intérieur de la boîte, afin d’obtenir une densité apparente homogène de 1,3 gramme par centimètre cube. Ajouter la quantité restante d’eau nécessaire pour atteindre la teneur en eau cible de 0,31 centimètre cube par centimètre cube en pulvérisant à la surface à l’aide d’un flacon pulvérisateur.

Veillez à une taille de gouttelette réduite afin d'éviter la dégradation de la structure de surface, ainsi qu'un mouillage homogène. Maintenez la boîte sur une balance pendant la pulvérisation afin de surveiller la quantité d'eau réellement ajoutée au substrat. Laissez l'eau se redistribuer pendant 10 minutes, puis appuyez le verre contre la surface et fixez-le avec les rails métalliques latéraux.

Le poids final moyen des rhizoboxes avec le substrat humidifié était de 17 818 ± 68 grammes. Équiper la chambre climatique de huit lampes DEL fournissant une illumination homogène de 450 micromoles par mètre carré par seconde, avec des pics spectraux à 440 et 660 nanomètres, pour une croissance végétale optimale. Après avoir réglé les paramètres ambiants selon les besoins de la plante et de l'expérience, couvrir la fenêtre en verre avec une plaque en bois afin de maintenir la zone racinaire à l’obscurité et d’éviter la croissance d’algues due à la pénétration de la lumière à travers la surface en verre.

Ensuite, placer les rhizoboxes en inclinaison à 45 degrés à l'aide d'un cadre métallique adéquat. Cela maximise la croissance racinaire vers la surface en verre grâce à la gravitropie. Pour l'imagerie racinaire RGB, éclairer le rhizobox à l'aide de quatre tubes fluorescents de 24 watts fixés à une distance de 80 centimètres du rhizobox.

Montez également quatre tubes UV de 15 watts à 20 centimètres du rhizobox pour une illumination alternative, en exploitant l'autofluorescence racinaire en cas de faible contraste entre la racine et le fond du substrat de couleur claire. Allumez les lampes UV, puis fixez le rhizobox à imager dans le support de la boîte d'imagerie. Ensuite, prenez deux images pour couvrir la moitié supérieure et la moitié inférieure d'un rhizobox, avec un recouvrement d'environ trois centimètres.

Acquérez et traitez les images RVB conformément au protocole décrit dans le texte. Enfin, effectuez l'analyse des images racinaires RVB acquises, puis vérifiez s'il existe des régions non correspondantes. Dans ce cas, définissez une région d'exclusion et relancez l'analyse.

Pour les racines non classifiées, ajoutez des classes de couleur supplémentaires et redémarrez l'analyse. Pour les éléments classés incorrectement comme des racines, activez ou augmentez les options de filtrage des débris et des bords irréguliers. Effectuez l'acquisition d'images en déterminant d'abord les temps d'intégration de la caméra pour l'analyse de la rhizoboîte et pour l'étalon blanc dans le logiciel de la caméra.

Pour ce faire, ouvrez l'interface graphique d'imagerie et déplacez la caméra à une position du rhizobox où des racines sont présentes. Réglez le temps d'intégration de la caméra en visant un objet lumineux de manière à utiliser environ 85 % de la plage dynamique totale de la caméra, tel qu'indiqué par l'histogramme affiché par le logiciel. Le réglage correct du temps d'intégration pour différents substrats et tissus racinaires est essentiel afin d'exploiter pleinement la plage dynamique de la caméra infrarouge et d'éviter toute perte d'information due à un dépassement de cette plage.

Répétez le processus pour l'étalon blanc en déplaçant le système de positionnement de la caméra afin de cibler l'étalon blanc avant de fermer le logiciel de la caméra. Ensuite, ouvrez l'interface graphique d'imagerie Matlab et saisissez tous les paramètres du scan actuel de la rhizobox. Acquérez les étalons noir et blanc avant chaque série d'acquisition, une fois par jour.

L'étalon noir représente le bruit de la caméra, tandis que l'étalon blanc donne la réflectivité maximale. Ces données sont nécessaires pour la normalisation des images pendant le prétraitement. Définir si l'ensemble du rhizobox ou seulement une partie de celui-ci est scanné.

Dans le cas présent, l'ensemble des rhizoboxes est imagé. Ensuite, lancez la numérisation. Pour la mesure spectrale de la teneur en eau, une rhizobox d'étalonnage est nécessaire.

Divisez une rhizoboîte en compartiments de cinq centimètres à l’aide de feuilles de polystyrène afin de les remplir avec du sol à différentes teneurs en eau. Analysez la rhizoboîte de calibration avec les mêmes paramètres que ceux utilisés pour les rhizoboîtes plantées. À titre d'exemple, pour combiner les caractéristiques racinaires et aériennes, utilisez le poromètre foliaire afin de mesurer la conductance stomatique.

Équilibrez l'appareil aux conditions ambiantes pendant au moins une heure dans la chambre climatique. Effectuez les mesures sur au moins trois feuilles par plante. Une image représentative de la croissance racinaire du cultivar de betterave sucrière, Ferrara, basée sur une imagerie RVB, est présentée ici.

À 35 jours après le semis, les racines des plantes se sont allongées jusqu'à atteindre le fond de la rhizoboîte. Certains axes racinaires situés en haut de la rhizoboîte n'ont pas pu être segmentés à partir des images RVB. La sénescence des racines basales les plus anciennes modifie leur couleur, qui devient brune.

Par conséquent, la séparation entre ces racines et le fond du sol basée sur un seuil de couleur échoue. En utilisant l'imagerie hyperspectrale, la segmentation repose sur des caractéristiques spectrales différentes entre le premier plan racinaire et le fond du sol. Cela améliore le résultat de la segmentation.

Les différences de longueur racinaire mesurée par rapport à une image de référence suivie manuellement sont de seulement 1,5 %. De plus, l'imagerie spectrale permet une cartographie fine de la teneur en eau autour de la racine afin de déduire l'absorption hydrique. Ici, le squelette racinaire est représenté en noir. Les zones plus claires montrent des régions de plus grande déplétion en eau près des axes racinaires.

Alors que les zones d'un bleu plus foncé représentent des régions ayant une teneur en eau du sol plus élevée, hors de portée des racines. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment remplir correctement les rhizoboxes afin d'assurer une croissance et une visibilité satisfaisantes des racines. Ceci constitue la base pour des images ultérieures et des résultats représentatifs de phénotypage racinaire.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes de classification spectrale, telles que le regroupement par K-moyennes ou les machines à vecteurs de support, peuvent être effectuées afin d'obtenir des informations approfondies sur les propriétés des racines et du rhizosphère, comme la sénescence et la décomposition racinaires. Une fois mise en place, cette technique permet de phénotyper de manière exhaustive les systèmes racinaires ainsi que la réponse au stress abiotique. Un ensemble de 10 cultivars peut être caractérisé avec une durée expérimentale totale inférieure à trois mois.