Name: Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Apprenez à générer des cellules souches pluripotentes induites sans trace à partir de cellules pancréatiques humaines et à les éditer avec CRISPR-Cas9. Cette méthode permet d'obtenir des clones monocellulaires modifiés avec une grande fiabilité.

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Travail en laboratoire a été pris en charge par stage postdoctoral au Dr Anjali Nandal et bonifiée exploratoire du Maryland Stem Cell Research Fund à BT (TEDCO).

<ol><li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem cells. 27, 543-549 (2009).</li>
<li>Macarthur, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+by+a+nonintegrating+RNA+Sendai+virus+vector+in+feeder-free+or+xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions.</a> Stem cells Int. , 564612(2012).</li>
<li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> J Virol. 74, 6564-6569 (2000).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Jpn.+Acad.+Ser.+B%2C+PhysBiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+efficient+feeder-free+culture+system+for+the+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.</a> Sci. Rep. 4, 3594(2014).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).</li>
<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 169, 559(2017).</li>
<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 168, 20-36 (2017).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).</li>
<li>McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FHDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> BioTechniques. 59, (2015).</li>
<li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA%2C+Cas9+nuclease%2C+and+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotech%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> J Biotech. 241, 136-146 (2017).</li>
</ol>

BT est un membre fondateur de rénover Biosciences Inc.

Reprogrammation de cellules somatiques humaines au CISP a donné un élan important aux champs de recherche de biologie fondamentale, médecine personnalisée, modélisation de maladies, développement des médicaments et la médecine régénérative,16. Nombreuses méthodes couramment utilisées de génération humaine iPSC nécessitent l’utilisation de virus, avec le risque d’intégration dans le génome hôte ou vecteurs épisomiques avec faible efficacité de reprogrammation. Nous présentons ici une méthode effica...

La reprogrammation de cellules somatiques humaines à l’État pluripotent par la surexpression des facteurs de reprogrammation a révolutionné la recherche sur les cellules souches avec des applications dans la modélisation de la maladie, médecine régénérative et développement de médicaments. Plusieurs méthodes de reprogrammation non viraux sont disponibles pour l’administration de facteurs de reprogrammation et de générer la CISP, mais le processus est travail intensif et pas très efficace1. Les méthodes virales, bien qu’efficace, sont associés aux problèmes d’intégration de virus et de la tumorigénicité2,3,4. Dans ce manuscrit, les auteurs rapportent l’utilisation de virus cytoplasmique de Sendai pour livraison reprogrammation des facteurs et l’établissement de lignes iPSC exempte d’empreinte qui n’ont pas l’intégration de toute séquence de vecteur viral dans leurs génomes5. Le virus de Sendai est un virus à ARN qui est dilué de passages de cytoplasme ~ 10 cellule après l’infection et produit des facteurs de reprogrammation en abondance, conduisant à la rapide et efficace de reprogrammation6,7. Le CISP établie peut ensuite être facilement passés à un milieu sans alimentation afin d’éviter l’utilisation de fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) comme alimentation cellules8.
Dans cette publication, outre décrivant le virus Sendai médiée par la reprogrammation, nous décrivons également un protocole amélioré pour l’édition CISP, qui a le potentiel d’approvisionnement illimité de cellules humaines avec des modifications génétiques souhaitées pour la recherche. Nous avons utilisé la technologie CRISPR/Cas9 pour la modification de la CISP, qui est maintenant utilisé pour un large éventail d’applications dont knock-ins et masquages, destructions à grande échelle de génomiques, bibliothèque mise en commun de dépistage pour la découverte du gène, génie génétique de nombreux organismes modèles et la thérapie de gène pour9,10,11. Cette technique implique la formation de complexes de Streptococcus pyogenes-dérivées Cas9 nucléase et 20-mer guident ARN qui obtenir une reconnaissance de la cible par appariement de bases avec la séquence cible génomique adjacent à 3' les protospacer de nucléotides adjacent séquence de motif (PAM). La nucléase Cas9 induit une nucléotides double brin pause ~ 3 sur le site de PAM, qui est par la suite réparé principalement par la fin non homologue, rejoindre la voie (NHEJ) conduisant à des insertions ou suppressions dans le cadre de lecture ouvert et donc fonctionnel masquage des gènes12.
Notre protocole amélioré inclut les détails pour la culture de cellules pancréatiques humaines, leur reprogrammation sur mitotically inactivés fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) pour atteindre une plus grande efficacité de reprogrammation, adaptation ultérieure de culture sans chargeur le Matrigel, caractérisation de CISP établie, CRISPR guidée RNA conception, préparation, livraison en CISP complexes RNP, seule cellule tri pour générer des lignées clonales de CISP édité, facile de dépistage et identification des modifications et la caractérisation des clones de cellule unique. Destructions génomiques ont été efficacement générées dans cette étude par l’introduction de protéines Cas9 et deux complexes de la RNP CRISPR sgRNA pour induire la doubles brin pauses (CDB) et les segments de la suppression de l’intervenant. Cette méthode tire parti de l’utilisation de deux guides pour générer les destructions dans le cadre de lecture ouvert, rendement élevé de NHEJ menant à faible nombre de clones qu’il fallait être caractérisé et simple présélection des clones par le capillaire automatisé unité d’électrophorèse, analyseur de fragment. Ces génome efficaces méthodes pour générer des modèles de maladies humaines axée sur les cellules souches d’édition va bientôt devenir une approche standard et courante dans tout laboratoire de cellules souches. Enfin, génome précis édition rendra possible d’aller au-delà de modélisation de la maladie de cellules souches et potentiellement pourrait aider catalysent les thérapies à base cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Vecteurs viraux Sendai - CytoTune-iPS 2.0 Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A16517</td><td>Décongélation sur glace ; N° S : 1</td></tr><tr><td>Trypsine EDTA</td><td>Gibco Life Tech</td><td>25300-054</td><td>0,05 %, 100 ml ; S No : 2</td></tr><tr><td>Inhibiteur de roche (Y-27632)</td><td>Milipore</td><td>SCM075</td><td>Utilisation 10 &mu ; M; N° S : 3</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 moyen</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td>N° S : 4</td></tr><tr><td>Remplacement sérique (KSR)</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>N° S : 5</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960069</td><td>1X ; S No : 6</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Aliquot ; S No : 7</td></tr><tr><td>L-glutamine (Glutamax, 100X), liquide</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050061</td><td>1/100 ; S No : 8</td></tr><tr><td>acides aminés non essentiels</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>1/100 ; N° S : 9</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>55 mM, 1/1 000 ; N° S : 10</td></tr><tr><td>Hausser Hémacytomètres</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>N° S : 11</td></tr><tr><td>Solution de gélatine à 0,1 %</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7903</td><td>Incuber à 37&ordm ; C pendant 1 heure ; S No : 12</td></tr><tr><td>Anticorps SSEA-4</td><td>Santacruz</td><td>sc-21704</td><td>1/100 ; S No : 13</td></tr><tr><td>TRA-1-81</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>4745S</td><td>1/200 ; S No : 14</td></tr><tr><td>OCT4 anticorps</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1/1 000 ; N° S : 15</td></tr><tr><td>Collagène I, Rat Tail</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td>Garder au froid ; N° S : 16</td></tr><tr><td>Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (anticorps secondaires)</td><td>Invitrogen</td><td>A21202/A10042</td><td>1/2 000 ; N° S : 17</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028LS</td><td>1X ; N° S : 18</td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire de 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>N° S : 20</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 96 puits</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td>S : 21</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 6 puits</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>N° S : 22</td></tr><tr><td>Lunette de dissection</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>S No : 23</td></tr><tr><td>Capot de sélection</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td>S No : 24</td></tr><tr><td>15&nbsp ; ml Tube à centrifuger</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>S No : 25</td></tr><tr><td>50&nbsp ; ml Tube à centrifuger</td><td>Greiner Bio-One 227261</td><td></td><td>S No : 26</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td>S No : 28</td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>S No : 29</td></tr><tr><td>Prigrow III medium</td><td>ABM</td><td>TM003</td><td>S No : 31</td></tr><tr><td>Countess&trade ; Compteur de cellules</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>S No : 32</td></tr><tr><td>Système à rayons X Faxitron</td><td>Faxitron</td><td>CellRad</td><td>S No : 33</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>S No : 34</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>stock de 1 mg/ml ; S No : 35</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td>S No : 36</td></tr><tr><td>hESC qualifié matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Pour diluer, utilisez du DMEM/F-12 froid ; N° S : 37</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R & D</td><td>233-FB</td><td>Stock 10 ug/ml ; N° S : 38</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4 % des actions de PBS ; N° S : 39</td></tr><tr><td>TRA-1-60</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21705</td><td>1/100 ; N° S : 40</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0004P-F</td><td>1/100 ; S No : 41</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td>S No : 42</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase</td><td>kit Stemgent</td><td>00-0055</td><td>S No : 43</td></tr><tr><td>Cas9 protein</td><td>PNA Bio</td><td>CP01-50</td><td>Décongélation et aliquote ; N° S : 44</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre ou d’âne</td><td>Sigma</td><td>D9663/G9023</td><td>N° S : 45</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td>N° S : 46</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td>N° S : 47</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>9285-100ML</td><td>N° S : 48</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td>N° S : 49</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>BP2482-500</td><td>N° S: 50</td></tr><tr><td>T4 ADN ligase</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td>N° S : 51</td></tr><tr><td>Kit Mega Shortscript T7</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1354</td><td>N° S : 52</td></tr><tr><td>Kit Mega Clear</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1908</td><td>N° S : 53</td></tr><tr><td>SMC4</td><td>BD Biosciences</td><td>354357</td><td>N° S : 54</td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7159</td><td>N° S : 55</td></tr><tr><td>Kit de clonage CloneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1232</td><td>S No : 56</td></tr><tr><td>Analyseur de fragmentsTM</td><td>Advanced Analytical</td><td></td><td>S No : 57</td></tr><tr><td>mTeSR1 medium kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td>Chaud à température ambiante ; S No : 58</td></tr><tr><td>Moyen de congélation mFreSR&trade ;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5855</td><td>S No : 59</td></tr><tr><td>Milieu de congélation CryoStor&reg ;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7930</td><td>S No : 60</td></tr><tr><td>MEFs</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6301G</td><td>S No : 61</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>S No : 62</td></tr><tr><td>Cellules pancréatiques humaines</td><td>ABM</td><td>T0159</td><td>S No : 63</td></tr><tr><td>STEMdiff&trade ; Induction neuronale Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5835</td><td>N° S : 64</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermofisher</td><td>11875-093</td><td>N° S : 65</td></tr><tr><td>2 % B27-insuline</td><td>Thermofisher</td><td>A1895601</td><td>N° S : 66</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72052</td><td>N° S : 67</td></tr><tr><td>IWP4</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72552</td><td>N° S : 68</td></tr><tr><td>2 % B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>N° S : 69</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372019</td><td>N° S : 70</td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S8761-100ML</td><td>N° S : 71</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td>N° S : 72</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Proliant</td><td>68700</td><td>N° S : 73</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>Pepro-Tech</td><td>120-00</td><td>N° S : 74</td></tr><tr><td>TUJ1 anticorps</td><td>EMD Milipore</td><td>AB9354</td><td>S No : 75</td></tr><tr><td>NKX2-5 anticorps</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-14033</td><td>S No : 76</td></tr><tr><td>SOX17 anticorps</td><td>R & D systems</td><td>AF1924</td><td>S No : 77</td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Thermo Scientific</td><td>P3566</td><td>S No : 78</td></tr><tr><td>Amaxa 4D-nucleofector&trade ;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002</td><td>N° S : 79</td></tr><tr><td>FACSAria II (trieur de cellules)</td><td>BD biosciences</td><td>SORP UV</td><td>S N° : 80</td></tr></tbody></table>

génération efficace et l’édition de cisp exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système crispr-cas9

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Les cellules souches pluripotentes embryonnaires et induits peuvent se renouveler et se différencier en plusieurs types de cellules du corps. Les cellules pluripotentes sont donc convoités pour la recherche en médecine régénératrice et sont actuellement en essais cliniques pour les maladies de l’oeil, diabète, maladies cardiaques et autres troubles. Le potentiel de se différencier en cellules spécialisées types couplés avec les progrès récents dans le génome de technologies, y compris le système CRISPR/Cas d’édition offrent des possibilités supplémentaires pour adapter le génome de l’iPSC pour applications variées y compris la maladie de modélisation, thérapie génique et polarisation des voies de différenciation, pour n’en nommer que quelques-uns. Parmi les technologies d’édition disponibles, le CRISPR/Cas9 de Streptococcus pyogenes a émergé comme un outil de choix pour l’édition spécifique du génome eucaryote. Les CRISPRs sont facilement accessible, peu coûteuse et très efficace en ingénierie des modifications ciblées. Le système nécessite une nucléase Cas9 et une séquence de guide (20-mer) spécifique à la cible génomique attenante à un 3-nucléotides « NGG » protospacer-adjacent-motif (PAM) pour le ciblage Cas9 au locus génomique désiré, aux côtés d’un traceur universel de liaison Cas9 (RNA ensemble appelé ARN de guide unique ou sgRNA). Nous présentons ici une étape par étape du protocole pour la production efficace d’iPSC alimentation indépendante et sans encombrement et décrire les méthodologies pour l’édition de génome d’iPSC en utilisant des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) de Cas9. Le génome du protocole d’édition est efficace et peut être facilement multiplexé par pre-complexants sgRNAs pour plus d’une cible avec la protéine Cas9 et débitent simultanément dans les cellules. Enfin, les auteurs décrivent une approche simplifiée pour l’identification et la caractérisation de la CISP, avec les modifications souhaitées. Pris ensemble, les stratégies décrites sont censés rationaliser la production et l’édition d’iPSC pour des applications multiples.

Dans cette publication, nous avons suivi un protocole simple mais efficace pour la génération de l’iPSC des cellules du pancréas, à l’aide d’intégration ou vecteurs de virus de Sendai exempte d’empreinte. Figure 1 a montre une représentation schématique du présent protocole reprogrammation. Les cellules pancréatiques humaines ont été achetés dans le commerce, cultivées dans un milieu Prigrow III et transduites avec virus Sendai comme expliqué ci-dessus. Trans...

Ce protocole décrit en détail la génération des cellules souches pluripotentes induites exempte d’empreinte (CISP) de cellules pancréatiques humaines dans des conditions sans chargeur, suivie d’édition en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines et la caractérisation de la mis à jour le clones de cellules individuelles.

Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des cellules souches pluripotentes induites sans empreinte, ou IPSCs, à partir de cellules pancréatiques humaines dans des conditions sans cellules nourricières, puis de modifier ces cellules à l'aide de ribonucléoprotéines CRISPR-Cas9, et enfin de caractériser les clones monocellulaires modifiés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'édition du génome des cellules souches humaines, telles que la génération d'IPSCs sans empreinte et la modification par des ribonucléoprotéines CRISPR-Cas9. Le principal avantage de cette technique est que des lignées clonales d'IPSCs modifiées peuvent être obtenues avec une grande fiabilité, et qu'aucun signe de mosaiquisme n'est observé.Après avoir enrobé une plaque de six puits avec du collagène froid, ensemencez les cellules primaires pancréatiques humaines de bas passage dans le milieu Prigrow III au jour 2 afin d'obtenir environ 2,5 × 10⁵ cellules, ou une confluence d'au moins 60 % par puits, le jour de la transduction ou jour zéro. Le jour de la transduction, après avoir récolté et compté les cellules selon le protocole décrit dans le texte, décongelez sur de la glace un jeu de tubes viraux Sendai et ajoutez soigneusement les volumes calculés de chaque tube à 1 mL de milieu Prigrow III préchauffé. Pipetez doucement pour homogénéiser la solution.Aspirez le Prigrow III des cellules et ajoutez lentement le mélange de virus de reprogrammation dans les puits. Incubez ensuite les cellules toute la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Vingt-quatre heures après la transduction, jetez soigneusement le mélange de virus présent sur les cellules et remplacez-le par du milieu Prigrow III frais.Le sixième jour, ajouter 1 mL de solution de détachement des cellules aux cellules et les incuber pendant 10 minutes. Ensuite, à l'aide de Prigrow III contenant l'inhibiteur de rock, ensemencer toutes les cellules dans des boîtes de MEF préparées la veille. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Observer régulièrement les plaques à la recherche de l’apparition d’agrégats cellulaires ou de colonies indiquant des cellules reprogrammées, qui formeront des agrégats clonaux présentant une morphologie en pavé et un noyau ainsi que des nucléoles volumineux. Marquer les colonies d’iPS probables et les surveiller régulièrement pour suivre leur croissance. Quasiment quatre semaines après la transduction, une fois les plaques de MEF 24 puits préparées, préparer la membrane matricielle en aliquotant celle-ci selon le facteur de dilution indiqué sur le certificat d’analyse.Prélevez 24 à 48 colonies et transférez-les sur des plaques de 24 puits recouvertes de membrane matricielle avec du mTeSR1. Incubez les plaques pendant 24 heures et changez le milieu chaque jour. Reportez-vous au protocole écrit pour plus de détails.Ajouter 500 µL de dispase pour détacher les colonies robustes ensemencées sur la membrane matricielle. Après avoir incubé les cellules pendant 20 minutes, les repiquer sur des plaques de 12 puits revêtues d'une membrane matricielle. Étendre et caractériser les clones par coloration à la phosphatase alcaline, coloration immunohistochimique et analyse FACS conformément au protocole décrit dans le texte.Pour transfecter les CIPSh après la synthèse des ARNsg conformément au protocole décrit, préparez un mélange maître de nucléofection pour chaque échantillon en combinant 0,5 µg de protéine Cas9 et 0,5 µg de chaque ARNsg dans un volume réactionnel de 22 µL. Après avoir aspiré le milieu contenant l'inhibiteur de ROCK, lavez chaque puits de CIPSh avec 2 mL de PBS-RT. Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez 1 mL de solution de détachement des cellules.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Resuspendre les cellules dans 3 mL de milieu mTeSR1 et pipeter doucement plusieurs fois afin d'obtenir une suspension monocellulaire. Transférer les cellules dissociées dans un tube de centrifugation de 15 mL contenant 5 mL de milieu mTeSR1.Ajouter au mélange maître de nucléofection 16,4 µL de supplément pour cellules primaires P3 et 3,6 µL du supplément un provenant du kit Nucleofector. Après avoir dénombré et centrifugé les cellules, resuspendre chaque unité de 0,5 x 10⁶ cellules dans 22 µL du mélange maître de transfection préparé précédemment. Transférer rapidement les cellules dans la chambre centrale d'un puits d'une bande de Nucleocuvette.Ensuite, placer la bande dans un dispositif Nucleofector et nucléofecter les cellules en utilisant le programme CB150. Après la nucléofection, ajouter rapidement 80 µL de milieu mTeSR1 préchauffé contenant 10 micromolaire d'inhibiteur de ROCK à chaque puits contenant les cellules nucléofectées. Mélanger délicatement par aspiration et dispensation à l’aide d’une pipette.Transférez délicatement les cellules du ruban vers les puits de la plaque de 12 puits revêtue de membrane matricielle contenant le milieu mTeSR1 avec l'inhibiteur de ROCK. Le deuxième jour d'incubation après la préparation des plaques de MEF, remplacez le milieu des HIPSC de mTeSR1 par du mTeSR1 complété avec 1XSMC4 pendant au moins deux heures avant le tri cellulaire individuel. Aspirez le milieu des HIPSC et utilisez du PBS pour laver doucement les cellules.Ensuite, ajouter 500 µL de solution de détachement des cellules dans chaque puits et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Obtenir une suspension monocellulaire en ajoutant 1 mL de mTeSR1 dans chaque puits et en pipetant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Répartir les cellules individuelles dans les puits individuels d'une plaque de 96 puits préparée au préalable.Quatre jours après le tri, la formation de colonies devrait être apparente. À ce stade, remplacer le milieu de culture par du milieu HESC supplémenté avec 1X SMC4. Après l'extraction et l'expansion de l'ADN cible selon le protocole décrit, utiliser un kit d'analyse de fragments pour analyser la région génomique cible amplifiée par PCR de toutes les clones dans le mélange de colorant pour gel, conformément aux instructions du fabricant.Confirmer les clones de cellules souches pluripotentes induites conformément au protocole écrit. Avant la transduction par le virus de Sendai, les cellules pancréatiques présentent une morphologie typique en fuseau. De petites colonies compactes apparaissent sur les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) au jour 12, ressemblant à des colonies de cellules pluripotentes humaines.Normalement, les colonies de cellules souches pluripotentes induites humaines entièrement reprogrammées présentent des limites très nettes et peuvent être sélectionnées entre les jours 23 et 30. Une colonie dissociée au jour 23 est montrée ici. On présente ici une image typique en contraste de phase d'une colonie de cellules iPS après sélection et culture en conditions sans cellules nourricières, suite à la reprogrammation par virus de Sendai de cellules pancréatiques.Les colonies d’IPSC colorées en rouge par la phosphatase alcaline se trouvent à droite. La confirmation des IPSC a été réalisée par immunomarquage des marqueurs de pluripotence OCT4 et NANOG, comme le montrent ces panneaux. Dans cette expérience, les IPSC ont été marquées avec des marqueurs de surface cellulaire et une analyse par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été effectuée sur une suspension monocellulaire.Le pic vert représente les IPSC pancréatiques, et le pic violet contient les cellules négatives pour les IPSC. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maintenir des conditions aseptiques ou stériles pour le tri cellulaire et la culture cellulaire. Après cette procédure, d'autres méthodes comme le ciblage génétique dans les IPSC et les CSE peuvent être réalisées, et des questions supplémentaires peuvent être abordées en effectuant des modifications génétiques précises.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer de manière fiable des iPSC sans empreinte et sans cellules nourricières, et d'effectuer une édition génomique biallélique.

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Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9 (Vidéo) | JoVE Journal

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