Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9

Ce protocole décrit en détail la génération des cellules souches pluripotentes induites exempte d’empreinte (CISP) de cellules pancréatiques humaines dans des conditions sans chargeur, suivie d’édition en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines et la caractérisation de la mis à jour le clones de cellules individuelles.

L’objectif global de cette procédure est de générer des cellules souches pluripotentes induites sans empreinte ou IPSC à partir de cellules pancréatiques humaines dans des conditions sans nourrisseur, puis de modifier les cellules à l’aide de ribonucléoprotéines CRISPR-Cas9 et enfin de caractériser les clones de cellules uniques modifiés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’édition du génome des cellules souches humaines, telles que la génération d’IPSC sans empreinte et l’édition avec des ribonucléoprotéines CRISPR-Cas9. Le principal avantage de cette technique est que des lignées clonales d’IPSC éditées peuvent être générées avec une grande fiabilité et qu’il n’y a aucune preuve de mosaïcisme.

Après avoir recouvert une plaque à six puits de collagène froid, placez des cellules pancréatiques primaires humaines à passage précoce dans un milieu Prigrow III le jour 2 pour obtenir environ 2,5 x 10 à 5 cellules ou au moins 60 % de confluence par puits le jour de la transduction ou le jour zéro. Le jour de la transduction, après la récolte et le comptage des cellules selon le protocole de texte, décongelez sur de la glace un ensemble de tubes vectoriels Sendai et ajoutez soigneusement les volumes calculés de chaque tube à 1 mL de milieu Prigrow III préchauffé. Pipetez doucement pour mélanger la solution.

Aspirez le Prigrow III des cellules et ajoutez lentement le mélange de virus de reprogrammation dans les puits. Ensuite, incubez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Vingt-quatre heures après la transduction, jetez soigneusement le mélange de virus sur les cellules et remplacez-le par du milieu Prigrow III frais.

Le sixième jour, ajoutez 1 ml de solution de décollement cellulaire aux cellules et incubez-les pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide de Prigrow III avec inhibiteur de roche, plaquez toutes les cellules sur des plats de MEF préparés la veille. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Observez régulièrement les plaques pour l’émergence d’amas ou de colonies cellulaires indiquant des cellules reprogrammées qui formeront des agrégats clonaux avec une morphologie de pavés et un gros noyau et nucléoles. Marquez les colonies IPSC probables et vérifiez régulièrement leur croissance. Près de quatre semaines après la transduction, après avoir préparé des plaques MEF à 24 puits, préparer la membrane matricielle en l’aliquote en fonction du facteur de dilution figurant sur le certificat d’analyse.

Prélever 24 à 48 colonies et les transférer sur des plaques de 24 puits recouvertes d’une membrane matricielle avec mTeSR1. Incuber les plaques pendant 24 heures et changer de milieu tous les jours. Pour plus de détails, reportez-vous au protocole texte.

Ajouter 500 mcL de dispase pour détacher les colonies robustes plaquées sur la membrane matricielle. Après avoir incubé les cellules pendant 20 minutes, plaquez-les à nouveau sur des plaques à 12 puits recouvertes d’une membrane matricielle. Développer et caractériser les clones à l’aide de la coloration à la phosphatase alcaline, de l’immunocoloration et de l’analyse FACS selon le protocole de texte.

Pour transfecter les HIPSC après avoir synthétisé des SGRNA conformément au protocole de texte, préparer le mélange maître nucleofaction pour chaque échantillon en combinant 0,5 mcg de protéine Cas9 et 0,5 mcg de chaque SGRNA dans un volume de réaction de 22 mcL. Après avoir aspiré le milieu contenant l’inhibiteur de roche, utilisez 2 mL de RTPBS pour laver chaque puits d’ISPC. Aspirez ensuite le PBS et ajoutez 1 mL de solution de décollement cellulaire.

Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Remettez les cellules en suspension dans 3 mL de milieu mTeSR1 et pipetez doucement de haut en bas pour générer une suspension de cellule unique. Transférez les cellules dissociées dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 5 mL de milieu mTeSR1.

Au mélange maître de nucléofection, ajoutez 16,4 mcL de supplément de cellules primaires P3 et 3,6 mcL de supplément 1 du kit Nucleofector. Après avoir compté et essoré les cellules, remettre en suspension chaque unité de 0,5 x 10 à la 6e cellule dans 22 mcL du mélange maître de transfection préalablement préparé. Transférez rapidement les cellules dans la chambre centrale d’un puits d’une bande de nucléocuvette.

Ensuite, placez la bandelette dans un dispositif Nucleofector et nucléofectez les cellules à l’aide du programme CB150. Après la nucléification, ajouter rapidement 80 mcL de milieu mTeSR1 préchauffé contenant 10 inhibiteurs de roche micromolaire dans chaque puits des cellules nucléofectées. Mélangez doucement en pipetant de haut en bas.

Transférez doucement les cellules de la bandelette vers les puits de la membrane matricielle pré-recouverte d’une plaque à 12 puits contenant un milieu mTeSR1 avec un inhibiteur de roche. Le deuxième jour d’incubation, après la préparation des plaques MEF, remplacer le milieu sur les HIPSC de mTeSR1 à mTeSR1 complété par 1XSMC4 pendant au moins deux heures avant le tri sur cellule unique. Aspirez le milieu des HIPSC et utilisez du PBS pour laver doucement les cellules.

Ajoutez ensuite 500 mcL de solution de détachement cellulaire dans chaque puits et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Générez une suspension unicellulaire en ajoutant 1 ml de mTeSR1 dans chaque puits et pipetez doucement de haut en bas plusieurs fois. Triez les cellules individuelles dans les puits individuels d’une plaque de 96 puits préalablement préparée.

Quatre jours après le tri, la formation de colonies devrait être apparente. À ce stade, remplacez le milieu de culture par un milieu HESC complété par 1X SMC4. Après avoir extrait et étendu l’ADN cible conformément au protocole textuel, utilisez un kit d’analyse de fragments pour faire passer la région génomique cible amplifiée par PCR de tous les clones à travers le mélange de colorant en gel selon les instructions du fabricant.

Confirmez les clones IPSC pluripotents selon le protocole texte. Avant la transduction du virus Sendai, les cellules pancréatiques présentaient une morphologie fusiforme typique. De petites colonies serrées apparaissent sur les MEF au jour 12, ressemblant à des colonies de cellules pluripotentes humaines.

Normalement, les colonies humaines IPSC entièrement reprogrammées ont des limites très claires et peuvent être détectées au bout de 23 à 30 jours. Une colonie dissociée au jour 23 est montrée ici. Voici une image typique en contraste de phase d’une colonie IPSC après la cueillette et la culture dans des conditions sans mangeoire après la reprogrammation des cellules pancréatiques par le virus Sendai.

Des colonies IPSC rouges colorées à la phosphatase alcaline sont à droite. Les IPSC ont été confirmées par immunocoloration pour les marqueurs de pluripotence OCT4 et NANANOG, comme on l’a vu dans ces panels. Dans cette expérience, les IPSC ont été colorés avec des marqueurs de surface cellulaire et l’analyse FACS a été effectuée sur une suspension unicellulaire.

Le pic vert représente les IPSC pancréatiques et le pic violet contient les cellules IPSC négatives. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir des conditions aseptiques ou stériles pour le tri et la culture cellulaires. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le ciblage génique dans les IPSC et les ESC peuvent être effectuées, et des questions supplémentaires peuvent être répondues en effectuant des modifications génétiques précises.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer de manière fiable des IPSC sans empreinte et sans mangeoire et d’effectuer l’édition du génome de manière bidirectionnelle.