Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9

L'objectif général de cette procédure est de générer des cellules souches pluripotentes induites sans empreinte, ou IPSCs, à partir de cellules pancréatiques humaines dans des conditions sans cellules nourricières, puis de modifier ces cellules à l'aide de ribonucléoprotéines CRISPR-Cas9, et enfin de caractériser les clones monocellulaires modifiés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'édition du génome des cellules souches humaines, telles que la génération d'IPSCs sans empreinte et la modification par des ribonucléoprotéines CRISPR-Cas9. Le principal avantage de cette technique est que des lignées clonales d'IPSCs modifiées peuvent être obtenues avec une grande fiabilité, et qu'aucun signe de mosaiquisme n'est observé.

Après avoir enrobé une plaque de six puits avec du collagène froid, ensemencez les cellules primaires pancréatiques humaines de bas passage dans le milieu Prigrow III au jour 2 afin d'obtenir environ 2,5 × 10⁵ cellules, ou une confluence d'au moins 60 % par puits, le jour de la transduction ou jour zéro. Le jour de la transduction, après avoir récolté et compté les cellules selon le protocole décrit dans le texte, décongelez sur de la glace un jeu de tubes viraux Sendai et ajoutez soigneusement les volumes calculés de chaque tube à 1 mL de milieu Prigrow III préchauffé. Pipetez doucement pour homogénéiser la solution.

Aspirez le Prigrow III des cellules et ajoutez lentement le mélange de virus de reprogrammation dans les puits. Incubez ensuite les cellules toute la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Vingt-quatre heures après la transduction, jetez soigneusement le mélange de virus présent sur les cellules et remplacez-le par du milieu Prigrow III frais.

Le sixième jour, ajouter 1 mL de solution de détachement des cellules aux cellules et les incuber pendant 10 minutes. Ensuite, à l'aide de Prigrow III contenant l'inhibiteur de rock, ensemencer toutes les cellules dans des boîtes de MEF préparées la veille. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Observer régulièrement les plaques à la recherche de l’apparition d’agrégats cellulaires ou de colonies indiquant des cellules reprogrammées, qui formeront des agrégats clonaux présentant une morphologie en pavé et un noyau ainsi que des nucléoles volumineux. Marquer les colonies d’iPS probables et les surveiller régulièrement pour suivre leur croissance. Quasiment quatre semaines après la transduction, une fois les plaques de MEF 24 puits préparées, préparer la membrane matricielle en aliquotant celle-ci selon le facteur de dilution indiqué sur le certificat d’analyse.

Prélevez 24 à 48 colonies et transférez-les sur des plaques de 24 puits recouvertes de membrane matricielle avec du mTeSR1. Incubez les plaques pendant 24 heures et changez le milieu chaque jour. Reportez-vous au protocole écrit pour plus de détails.

Ajouter 500 µL de dispase pour détacher les colonies robustes ensemencées sur la membrane matricielle. Après avoir incubé les cellules pendant 20 minutes, les repiquer sur des plaques de 12 puits revêtues d'une membrane matricielle. Étendre et caractériser les clones par coloration à la phosphatase alcaline, coloration immunohistochimique et analyse FACS conformément au protocole décrit dans le texte.

Pour transfecter les CIPSh après la synthèse des ARNsg conformément au protocole décrit, préparez un mélange maître de nucléofection pour chaque échantillon en combinant 0,5 µg de protéine Cas9 et 0,5 µg de chaque ARNsg dans un volume réactionnel de 22 µL. Après avoir aspiré le milieu contenant l'inhibiteur de ROCK, lavez chaque puits de CIPSh avec 2 mL de PBS-RT. Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez 1 mL de solution de détachement des cellules.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Resuspendre les cellules dans 3 mL de milieu mTeSR1 et pipeter doucement plusieurs fois afin d'obtenir une suspension monocellulaire. Transférer les cellules dissociées dans un tube de centrifugation de 15 mL contenant 5 mL de milieu mTeSR1.

Ajouter au mélange maître de nucléofection 16,4 µL de supplément pour cellules primaires P3 et 3,6 µL du supplément un provenant du kit Nucleofector. Après avoir dénombré et centrifugé les cellules, resuspendre chaque unité de 0,5 x 10⁶ cellules dans 22 µL du mélange maître de transfection préparé précédemment. Transférer rapidement les cellules dans la chambre centrale d'un puits d'une bande de Nucleocuvette.

Ensuite, placer la bande dans un dispositif Nucleofector et nucléofecter les cellules en utilisant le programme CB150. Après la nucléofection, ajouter rapidement 80 µL de milieu mTeSR1 préchauffé contenant 10 micromolaire d'inhibiteur de ROCK à chaque puits contenant les cellules nucléofectées. Mélanger délicatement par aspiration et dispensation à l’aide d’une pipette.

Transférez délicatement les cellules du ruban vers les puits de la plaque de 12 puits revêtue de membrane matricielle contenant le milieu mTeSR1 avec l'inhibiteur de ROCK. Le deuxième jour d'incubation après la préparation des plaques de MEF, remplacez le milieu des HIPSC de mTeSR1 par du mTeSR1 complété avec 1XSMC4 pendant au moins deux heures avant le tri cellulaire individuel. Aspirez le milieu des HIPSC et utilisez du PBS pour laver doucement les cellules.

Ensuite, ajouter 500 µL de solution de détachement des cellules dans chaque puits et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Obtenir une suspension monocellulaire en ajoutant 1 mL de mTeSR1 dans chaque puits et en pipetant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Répartir les cellules individuelles dans les puits individuels d'une plaque de 96 puits préparée au préalable.

Quatre jours après le tri, la formation de colonies devrait être apparente. À ce stade, remplacer le milieu de culture par du milieu HESC supplémenté avec 1X SMC4. Après l'extraction et l'expansion de l'ADN cible selon le protocole décrit, utiliser un kit d'analyse de fragments pour analyser la région génomique cible amplifiée par PCR de toutes les clones dans le mélange de colorant pour gel, conformément aux instructions du fabricant.

Confirmer les clones de cellules souches pluripotentes induites conformément au protocole écrit. Avant la transduction par le virus de Sendai, les cellules pancréatiques présentent une morphologie typique en fuseau. De petites colonies compactes apparaissent sur les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) au jour 12, ressemblant à des colonies de cellules pluripotentes humaines.

Normalement, les colonies de cellules souches pluripotentes induites humaines entièrement reprogrammées présentent des limites très nettes et peuvent être sélectionnées entre les jours 23 et 30. Une colonie dissociée au jour 23 est montrée ici. On présente ici une image typique en contraste de phase d'une colonie de cellules iPS après sélection et culture en conditions sans cellules nourricières, suite à la reprogrammation par virus de Sendai de cellules pancréatiques.

Les colonies d’IPSC colorées en rouge par la phosphatase alcaline se trouvent à droite. La confirmation des IPSC a été réalisée par immunomarquage des marqueurs de pluripotence OCT4 et NANOG, comme le montrent ces panneaux. Dans cette expérience, les IPSC ont été marquées avec des marqueurs de surface cellulaire et une analyse par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été effectuée sur une suspension monocellulaire.

Le pic vert représente les IPSC pancréatiques, et le pic violet contient les cellules négatives pour les IPSC. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maintenir des conditions aseptiques ou stériles pour le tri cellulaire et la culture cellulaire. Après cette procédure, d'autres méthodes comme le ciblage génétique dans les IPSC et les CSE peuvent être réalisées, et des questions supplémentaires peuvent être abordées en effectuant des modifications génétiques précises.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer de manière fiable des iPSC sans empreinte et sans cellules nourricières, et d'effectuer une édition génomique biallélique.