Name: Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Apprenez à générer des cellules souches pluripotentes induites sans trace à partir de cellules pancréatiques humaines et à les éditer avec CRISPR-Cas9. Cette méthode permet d'obtenir des clones monocellulaires modifiés avec une grande fiabilité.

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Travail en laboratoire a été pris en charge par stage postdoctoral au Dr Anjali Nandal et bonifiée exploratoire du Maryland Stem Cell Research Fund à BT (TEDCO).

<ol><li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem cells. 27, 543-549 (2009).</li>
<li>Macarthur, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+by+a+nonintegrating+RNA+Sendai+virus+vector+in+feeder-free+or+xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions.</a> Stem cells Int. , 564612(2012).</li>
<li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> J Virol. 74, 6564-6569 (2000).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Jpn.+Acad.+Ser.+B%2C+PhysBiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+efficient+feeder-free+culture+system+for+the+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.</a> Sci. Rep. 4, 3594(2014).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).</li>
<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 169, 559(2017).</li>
<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 168, 20-36 (2017).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).</li>
<li>McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FHDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> BioTechniques. 59, (2015).</li>
<li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA%2C+Cas9+nuclease%2C+and+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotech%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> J Biotech. 241, 136-146 (2017).</li>
</ol>

BT est un membre fondateur de rénover Biosciences Inc.

Reprogrammation de cellules somatiques humaines au CISP a donné un élan important aux champs de recherche de biologie fondamentale, médecine personnalisée, modélisation de maladies, développement des médicaments et la médecine régénérative,16. Nombreuses méthodes couramment utilisées de génération humaine iPSC nécessitent l’utilisation de virus, avec le risque d’intégration dans le génome hôte ou vecteurs épisomiques avec faible efficacité de reprogrammation. Nous présentons ici une méthode effica...

La reprogrammation de cellules somatiques humaines à l’État pluripotent par la surexpression des facteurs de reprogrammation a révolutionné la recherche sur les cellules souches avec des applications dans la modélisation de la maladie, médecine régénérative et développement de médicaments. Plusieurs méthodes de reprogrammation non viraux sont disponibles pour l’administration de facteurs de reprogrammation et de générer la CISP, mais le processus est travail intensif et pas très efficace1. Les méthodes virales, bien qu’efficace, sont associés aux problèmes d’intégration de virus et de la tumorigénicité2,3,4. Dans ce manuscrit, les auteurs rapportent l’utilisation de virus cytoplasmique de Sendai pour livraison reprogrammation des facteurs et l’établissement de lignes iPSC exempte d’empreinte qui n’ont pas l’intégration de toute séquence de vecteur viral dans leurs génomes5. Le virus de Sendai est un virus à ARN qui est dilué de passages de cytoplasme ~ 10 cellule après l’infection et produit des facteurs de reprogrammation en abondance, conduisant à la rapide et efficace de reprogrammation6,7. Le CISP établie peut ensuite être facilement passés à un milieu sans alimentation afin d’éviter l’utilisation de fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) comme alimentation cellules8.
Dans cette publication, outre décrivant le virus Sendai médiée par la reprogrammation, nous décrivons également un protocole amélioré pour l’édition CISP, qui a le potentiel d’approvisionnement illimité de cellules humaines avec des modifications génétiques souhaitées pour la recherche. Nous avons utilisé la technologie CRISPR/Cas9 pour la modification de la CISP, qui est maintenant utilisé pour un large éventail d’applications dont knock-ins et masquages, destructions à grande échelle de génomiques, bibliothèque mise en commun de dépistage pour la découverte du gène, génie génétique de nombreux organismes modèles et la thérapie de gène pour9,10,11. Cette technique implique la formation de complexes de Streptococcus pyogenes-dérivées Cas9 nucléase et 20-mer guident ARN qui obtenir une reconnaissance de la cible par appariement de bases avec la séquence cible génomique adjacent à 3' les protospacer de nucléotides adjacent séquence de motif (PAM). La nucléase Cas9 induit une nucléotides double brin pause ~ 3 sur le site de PAM, qui est par la suite réparé principalement par la fin non homologue, rejoindre la voie (NHEJ) conduisant à des insertions ou suppressions dans le cadre de lecture ouvert et donc fonctionnel masquage des gènes12.
Notre protocole amélioré inclut les détails pour la culture de cellules pancréatiques humaines, leur reprogrammation sur mitotically inactivés fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) pour atteindre une plus grande efficacité de reprogrammation, adaptation ultérieure de culture sans chargeur le Matrigel, caractérisation de CISP établie, CRISPR guidée RNA conception, préparation, livraison en CISP complexes RNP, seule cellule tri pour générer des lignées clonales de CISP édité, facile de dépistage et identification des modifications et la caractérisation des clones de cellule unique. Destructions génomiques ont été efficacement générées dans cette étude par l’introduction de protéines Cas9 et deux complexes de la RNP CRISPR sgRNA pour induire la doubles brin pauses (CDB) et les segments de la suppression de l’intervenant. Cette méthode tire parti de l’utilisation de deux guides pour générer les destructions dans le cadre de lecture ouvert, rendement élevé de NHEJ menant à faible nombre de clones qu’il fallait être caractérisé et simple présélection des clones par le capillaire automatisé unité d’électrophorèse, analyseur de fragment. Ces génome efficaces méthodes pour générer des modèles de maladies humaines axée sur les cellules souches d’édition va bientôt devenir une approche standard et courante dans tout laboratoire de cellules souches. Enfin, génome précis édition rendra possible d’aller au-delà de modélisation de la maladie de cellules souches et potentiellement pourrait aider catalysent les thérapies à base cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Vecteurs viraux Sendai - CytoTune-iPS 2.0 Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A16517</td><td>Décongélation sur glace ; N° S : 1</td></tr><tr><td>Trypsine EDTA</td><td>Gibco Life Tech</td><td>25300-054</td><td>0,05 %, 100 ml ; S No : 2</td></tr><tr><td>Inhibiteur de roche (Y-27632)</td><td>Milipore</td><td>SCM075</td><td>Utilisation 10 &mu ; M; N° S : 3</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 moyen</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td>N° S : 4</td></tr><tr><td>Remplacement sérique (KSR)</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>N° S : 5</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960069</td><td>1X ; S No : 6</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Aliquot ; S No : 7</td></tr><tr><td>L-glutamine (Glutamax, 100X), liquide</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050061</td><td>1/100 ; S No : 8</td></tr><tr><td>acides aminés non essentiels</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>1/100 ; N° S : 9</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>55 mM, 1/1 000 ; N° S : 10</td></tr><tr><td>Hausser Hémacytomètres</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>N° S : 11</td></tr><tr><td>Solution de gélatine à 0,1 %</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7903</td><td>Incuber à 37&ordm ; C pendant 1 heure ; S No : 12</td></tr><tr><td>Anticorps SSEA-4</td><td>Santacruz</td><td>sc-21704</td><td>1/100 ; S No : 13</td></tr><tr><td>TRA-1-81</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>4745S</td><td>1/200 ; S No : 14</td></tr><tr><td>OCT4 anticorps</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1/1 000 ; N° S : 15</td></tr><tr><td>Collagène I, Rat Tail</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td>Garder au froid ; N° S : 16</td></tr><tr><td>Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (anticorps secondaires)</td><td>Invitrogen</td><td>A21202/A10042</td><td>1/2 000 ; N° S : 17</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028LS</td><td>1X ; N° S : 18</td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire de 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>N° S : 20</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 96 puits</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td>S : 21</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 6 puits</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>N° S : 22</td></tr><tr><td>Lunette de dissection</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>S No : 23</td></tr><tr><td>Capot de sélection</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td>S No : 24</td></tr><tr><td>15&nbsp ; ml Tube à centrifuger</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>S No : 25</td></tr><tr><td>50&nbsp ; ml Tube à centrifuger</td><td>Greiner Bio-One 227261</td><td></td><td>S No : 26</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td>S No : 28</td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>S No : 29</td></tr><tr><td>Prigrow III medium</td><td>ABM</td><td>TM003</td><td>S No : 31</td></tr><tr><td>Countess&trade ; Compteur de cellules</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>S No : 32</td></tr><tr><td>Système à rayons X Faxitron</td><td>Faxitron</td><td>CellRad</td><td>S No : 33</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>S No : 34</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>stock de 1 mg/ml ; S No : 35</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td>S No : 36</td></tr><tr><td>hESC qualifié matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Pour diluer, utilisez du DMEM/F-12 froid ; N° S : 37</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R & D</td><td>233-FB</td><td>Stock 10 ug/ml ; N° S : 38</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4 % des actions de PBS ; N° S : 39</td></tr><tr><td>TRA-1-60</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21705</td><td>1/100 ; N° S : 40</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0004P-F</td><td>1/100 ; S No : 41</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td>S No : 42</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase</td><td>kit Stemgent</td><td>00-0055</td><td>S No : 43</td></tr><tr><td>Cas9 protein</td><td>PNA Bio</td><td>CP01-50</td><td>Décongélation et aliquote ; N° S : 44</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre ou d’âne</td><td>Sigma</td><td>D9663/G9023</td><td>N° S : 45</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td>N° S : 46</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td>N° S : 47</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>9285-100ML</td><td>N° S : 48</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td>N° S : 49</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>BP2482-500</td><td>N° S: 50</td></tr><tr><td>T4 ADN ligase</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td>N° S : 51</td></tr><tr><td>Kit Mega Shortscript T7</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1354</td><td>N° S : 52</td></tr><tr><td>Kit Mega Clear</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1908</td><td>N° S : 53</td></tr><tr><td>SMC4</td><td>BD Biosciences</td><td>354357</td><td>N° S : 54</td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7159</td><td>N° S : 55</td></tr><tr><td>Kit de clonage CloneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1232</td><td>S No : 56</td></tr><tr><td>Analyseur de fragmentsTM</td><td>Advanced Analytical</td><td></td><td>S No : 57</td></tr><tr><td>mTeSR1 medium kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td>Chaud à température ambiante ; S No : 58</td></tr><tr><td>Moyen de congélation mFreSR&trade ;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5855</td><td>S No : 59</td></tr><tr><td>Milieu de congélation CryoStor&reg ;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7930</td><td>S No : 60</td></tr><tr><td>MEFs</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6301G</td><td>S No : 61</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>S No : 62</td></tr><tr><td>Cellules pancréatiques humaines</td><td>ABM</td><td>T0159</td><td>S No : 63</td></tr><tr><td>STEMdiff&trade ; Induction neuronale Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5835</td><td>N° S : 64</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermofisher</td><td>11875-093</td><td>N° S : 65</td></tr><tr><td>2 % B27-insuline</td><td>Thermofisher</td><td>A1895601</td><td>N° S : 66</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72052</td><td>N° S : 67</td></tr><tr><td>IWP4</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72552</td><td>N° S : 68</td></tr><tr><td>2 % B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>N° S : 69</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372019</td><td>N° S : 70</td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S8761-100ML</td><td>N° S : 71</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td>N° S : 72</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Proliant</td><td>68700</td><td>N° S : 73</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>Pepro-Tech</td><td>120-00</td><td>N° S : 74</td></tr><tr><td>TUJ1 anticorps</td><td>EMD Milipore</td><td>AB9354</td><td>S No : 75</td></tr><tr><td>NKX2-5 anticorps</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-14033</td><td>S No : 76</td></tr><tr><td>SOX17 anticorps</td><td>R & D systems</td><td>AF1924</td><td>S No : 77</td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Thermo Scientific</td><td>P3566</td><td>S No : 78</td></tr><tr><td>Amaxa 4D-nucleofector&trade ;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002</td><td>N° S : 79</td></tr><tr><td>FACSAria II (trieur de cellules)</td><td>BD biosciences</td><td>SORP UV</td><td>S N° : 80</td></tr></tbody></table>

génération efficace et l’édition de cisp exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système crispr-cas9

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Les cellules souches pluripotentes embryonnaires et induits peuvent se renouveler et se différencier en plusieurs types de cellules du corps. Les cellules pluripotentes sont donc convoités pour la recherche en médecine régénératrice et sont actuellement en essais cliniques pour les maladies de l’oeil, diabète, maladies cardiaques et autres troubles. Le potentiel de se différencier en cellules spécialisées types couplés avec les progrès récents dans le génome de technologies, y compris le système CRISPR/Cas d’édition offrent des possibilités supplémentaires pour adapter le génome de l’iPSC pour applications variées y compris la maladie de modélisation, thérapie génique et polarisation des voies de différenciation, pour n’en nommer que quelques-uns. Parmi les technologies d’édition disponibles, le CRISPR/Cas9 de Streptococcus pyogenes a émergé comme un outil de choix pour l’édition spécifique du génome eucaryote. Les CRISPRs sont facilement accessible, peu coûteuse et très efficace en ingénierie des modifications ciblées. Le système nécessite une nucléase Cas9 et une séquence de guide (20-mer) spécifique à la cible génomique attenante à un 3-nucléotides « NGG » protospacer-adjacent-motif (PAM) pour le ciblage Cas9 au locus génomique désiré, aux côtés d’un traceur universel de liaison Cas9 (RNA ensemble appelé ARN de guide unique ou sgRNA). Nous présentons ici une étape par étape du protocole pour la production efficace d’iPSC alimentation indépendante et sans encombrement et décrire les méthodologies pour l’édition de génome d’iPSC en utilisant des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) de Cas9. Le génome du protocole d’édition est efficace et peut être facilement multiplexé par pre-complexants sgRNAs pour plus d’une cible avec la protéine Cas9 et débitent simultanément dans les cellules. Enfin, les auteurs décrivent une approche simplifiée pour l’identification et la caractérisation de la CISP, avec les modifications souhaitées. Pris ensemble, les stratégies décrites sont censés rationaliser la production et l’édition d’iPSC pour des applications multiples.

Dans cette publication, nous avons suivi un protocole simple mais efficace pour la génération de l’iPSC des cellules du pancréas, à l’aide d’intégration ou vecteurs de virus de Sendai exempte d’empreinte. Figure 1 a montre une représentation schématique du présent protocole reprogrammation. Les cellules pancréatiques humaines ont été achetés dans le commerce, cultivées dans un milieu Prigrow III et transduites avec virus Sendai comme expliqué ci-dessus. Trans...

Ce protocole décrit en détail la génération des cellules souches pluripotentes induites exempte d’empreinte (CISP) de cellules pancréatiques humaines dans des conditions sans chargeur, suivie d’édition en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines et la caractérisation de la mis à jour le clones de cellules individuelles.

Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des cellules souches pluripotentes induites sans empreinte, ou IPSCs, à partir de cellules pancréatiques humaines dans des conditions sans cellules nourricières, puis de modifier ces cellules à l'aide de ribonucléoprotéines CRISPR-Cas9, et enfin de caractériser les clones monocellulaires modifiés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'édition du génome des cellules souches humaines, telles que la génération d'IPSCs sans empreinte et la modification par des ribonucléoprotéines CRISPR-Cas9. Le principal avantage de cette technique est que des lignées clonales d'IPSCs modifiées peuvent être obtenues avec une grande fiabilité, et qu'aucun signe de mosaiquisme n'est observé.Après avoir enrobé une plaque de six puits avec du collagène froid, ensemencez les cellules primaires pancréatiques humaines de bas passage dans le milieu Prigrow III au jour 2 afin d'obtenir environ 2,5 × 10⁵ cellules, ou une confluence d'au moins 60 % par puits, le jour de la transduction ou jour zéro. Le jour de la transduction, après avoir récolté et compté les cellules selon le protocole décrit dans le texte, décongelez

efficient-generation-editing-feeder-free-ipscs-from-human-pancreatic

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Bioingénierie

Les outils d’édition du génome tels que le système CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associé à CRISPR) ont considérablement amélioré l’efficacité du ciblage génique dans les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Ce manuscrit décrit un protocole permettant de générer un rapporteur hiPSC spécifique à la lignée à l’aide de la recombinaison homologue assistée par le système CRISPR/Cas.

Génération efficace de hiPSC neurones Lineage Reporters Knockin spécifique en utilisant l&#39;CRISPR / Cas9 et Cas9 Système Double Nickase

L’édition du génome des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) peut être effectuée rapidement et efficacement. Voici une procédure expérimentale robuste pour modifier génétiquement les hPSC, comme en témoigne l’édition du locus de la sphère de sécurité AAVS1 pour exprimer l’EGFP et introduire une résistance aux antibiotiques.

Création de Génome édités cellules souches pluripotentes humaines Lines: De Ciblage Isolement

Protocoles pour générer des lignes de mutants HPSC en utilisant la plate-forme iCRISPR et de différencier hPSCs dans les cellules ß-like glucose-sensibles sont décrits. La combinaison de la technologie d'édition génome avec une différenciation HPSC dirigée fournit une plate-forme puissante pour l'analyse systématique du rôle des déterminants de la lignée dans le développement humain et de la progression de la maladie.

Genome Montage et différenciation dirigée des hPSCs pour Interrogation Déterminants Lineage dans le développement du pancréas humain

Un protocole pour rapide CRISPR/Cas9-mediated disruption de génique chez la souris et des cellules hématopoïétiques humaines primaires est décrit dans cet article. Ribonucléoprotéines Cas9-sgRNA sont introduits par électroporation avec sgRNAs des vicitimes in vitro de transcription et commerciale Cas9. Édition de hautes efficacités sont réalisées avec peu de temps et de coût financier.

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Utilisant un Cas9 préassemblé complexe ribonucléoprotéique (RNP) est une méthode puissante pour l’édition de génome précis et efficace. Ici, nous mettons en évidence son utilité dans un large éventail de cellules et des organismes, y compris des cellules humaines primaires et les deux classiques et de nouveaux organismes modèles.

Génome améliorée d’édition avec Cas9 ribonucléoprotéique dans diverses cellules et des organismes

Décrite ici, c’est un protocole pour le marquage de façon endogène des protéines avec des étiquettes fluorescentes dans les cellules souches humaines pluripotentes induites à l’aide de CRISPR/Cas9 exprimées. Cellules putativement édités sont enrichis en triant les cellules fluorescence activé et lignées clonales sont générées.

Protéine endogène de marquage dans l’homme induites par les cellules souches pluripotentes à l’aide de CRISPR/Cas9

Présenté ici est un protocole pour l'édition efficace de gène de ribonucleoprotein-mediated de CRISPR/Cas9 dans les cellules mammifères utilisant l'électroporation de tube.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Ce protocole fournit une méthode pour faciliter la génération de changements définis de nucléotide hétérozygote ou homozygote à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines.

Génération de modifications génomiques définies à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines

Ici, nous décrivons une méthode détaillée d’édition de gènes transparente dans des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un plasmide donneur à base de piggyBac et le mutant Cas9 nickase. Deux mutations ponctuelles ont été introduites dans l’exon 8 du locus du facteur nucléaire 4 alpha des hépatocytes (HNF4α) dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh).

Introduction de mutations ponctuelles dans des cellules souches pluripotentes humaines à l’aide d’une édition transparente du génome

La méthode présentée décrit la génération d’un gène knock-out médié par CRISPR dans la lignée H9 de cellules souches embryonnaires humaines (hESC), qui exprime de manière stable des sgRNA ciblant le gène L2HGDH à l’aide d’un système de distribution de gènes à médiation lentivirale très efficace.

Délétion de gène médiée par CRISPR-Cas9 dans des cellules souches pluripotentes humaines cultivées dans des conditions sans nourrisseur

Apprenez à générer des cellules souches pluripotentes induites sans trace à partir de cellules pancréatiques humaines et à les éditer avec CRISPR-Cas9. Cette méthode permet d'obtenir des clones monocellulaires modifiés avec une grande fiabilité.

Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9 (Vidéo) | JoVE Journal

Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9

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