Procédé amélioré pour la création d’un In Vitro barrière hémato - encéphalique modèle basé sur les cellules endothéliales du cerveau porcin

L’objectif global de ce protocole est de purifier et d’isoler les cellules endothéliales cérébrales porcines primaires afin de mettre en place un modèle étanche in vitro de barrière hémato-encéphalique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la barrière hémato-encéphalique, telles que l’administration de médicaments, la perméabilité, le trafic des récepteurs, ainsi que l’étanchéité et la polarité du BB. Le principal avantage de ce modèle est le rendement élevé de cellules endothéliales cérébrales primaires qui peuvent être utilisées pour créer un modèle in vitro de barrière hémato-encéphalique qui a un TEER élevé et une faible perméabilité. Pour commencer cette procédure, placez les cerveaux dans un banc d’écoulement stérile et lavez-les doucement avec un litre de PBS dans un bécher posé sur de la glace.

Ensuite, retirez soigneusement les méninges de chaque cerveau à l’aide d’une pince à pointe fine. À l’aide d’un scalpel, grattez la matière grise du cerveau un par un et transférez le matériel isolé dans des boîtes de Pétri contenant 20 millilitres de DMEM/F-12 placés sur de la glace. Pour une fragmentation initiale, faites passer la matière grise dans une seringue de 50 millilitres sans l’aiguille.

Répétez la procédure pour tous les cerveaux et regroupez le matériel de matière grise collecté. Transférez la matière grise isolée avec le milieu DMEM/F-12 dans le tube de broyage d’un homogénéisateur de tissus portable. Homogénéisez le matériau en effectuant huit mouvements de haut en bas avec un pilon lâche, suivis de huit mouvements de haut en bas avec un pilon serré.

Ensuite, isolez les capillaires en filtrant l’homogénat à l’aide d’une bouteille à bouchon bleu de 500 millilitres avec porte-filtre et maille filtrante de 140 microns. Placez les filtres capillaires dans des boîtes de Pétri avec une solution de digestion. Par la suite, incubez les boîtes de Pétri à 37 degrés Celsius pendant une heure sur un agitateur orbital à 180 tr/min, ou remuez-les doucement toutes les 10 minutes.

Au bout d’une heure, lavez les capillaires des filtres avec la suspension de la boîte de Pétri. Ensuite, divisez la suspension des trois plats en deux tubes de 50 millilitres et arrêtez la digestion en ajoutant 10 millilitres de DMEM/F-12 dans chaque tube de 50 millilitres. Centrifugez les suspensions cellulaires à 250 fois g, quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, aspirez les surnageants et remettez en suspension chaque pastille dans 10 millilitres de DMEM/F-12. Ensuite, ajoutez 20 millilitres supplémentaires de DMEM/F-12 dans chaque tube. Pour optimiser les conditions de fixation des PBEC, ajoutez une solution d’enrobage dans la fiole T-75, ce qui permet d’obtenir les concentrations finales de collagène quatre à 150 microgrammes par millilitre et de fibronectine à 50 microgrammes par millilitre et d’eau distillée, en veillant à ce que la solution couvre toute la surface.

Ensuite, décongelez les capillaires dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Pour éliminer le fluide de congélation, faites tourner les capillaires à 250 fois g, quatre degrés Celsius, pendant sept minutes. Après cela, aspirez soigneusement le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un à deux millilitres d’aliquote de 10 millilitres.

Ensuite, transférez la suspension capillaire dans la fiole T-75 enduite et inclinez doucement la fiole pour assurer une répartition uniforme sur la surface. Placez la fiole T-75 à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après une nuit d’incubation, préparer 10 millilitres de milieu de croissance PBEC, complété par de la puromycine à raison de quatre microgrammes par millilitre pour une fiole T-75 et effectuer un changement de milieu.

Ensuite, préparez les inserts de membrane perméable pour l’ensemencement PBEC en les enrobant de collagène IV à 500 microgrammes par millilitre, et de fibronectine à 100 microgrammes par millilitre, et par de l’eau distillée. Trypsinisez les cellules en ajoutant deux millilitres de solution trypsine-EDTA dans la fiole T-75, et placez-la à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant cinq à sept minutes. Pour détacher les cellules endothéliales du cerveau, tapotez doucement le côté de la fiole T-75 du bout des doigts.

Par la suite, transférez la solution cellulaire dans un tube de 15 millilitres et faites tourner les cellules endothéliales du cerveau par centrifugation à 250 fois g, quatre degrés Celsius, pendant sept minutes. Ensuite, retirez soigneusement le surnageant et remettez le granulé en suspension dans un millilitre de milieu. Ensuite, ajoutez deux millilitres supplémentaires de fluide pour porter le volume total à trois millilitres.

Comptez le nombre de cellules manuellement à l’aide d’une chambre de comptage de cellules ou d’un système de comptage automatique des cellules. Pour la coculture sans contact, transférez les inserts dans les puits qui contiennent des astrocytes, qui ont été rafraîchis avec un milieu de croissance des astrocytes la veille. Le lendemain, replacez le milieu sur les inserts de membrane perméable contenant des PBEC.

Ensuite, aspirez soigneusement le milieu des puits et ajoutez 750 microlitres de milieu de différenciation dans chaque puits. Ensuite, aspirez soigneusement le milieu des inserts et ajoutez 500 microlitres de milieu de différenciation par insert. Ensuite, ajoutez les 750 microlitres restants de milieu de différenciation dans chaque puits d’astrocytes.

Après cela, incubez les cellules avec un milieu de différenciation à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, jusqu’au lendemain. Le lendemain de la stimulation des cellules avec un milieu de différenciation, préparez le système de chambre de mesure de la résistance tissulaire pour les mesures TEER en rinçant la chambre deux fois avec de l’eau bidistillée, une fois avec de l’éthanol à 70 % pendant cinq minutes et deux fois de plus avec de l’eau bidistillée. Ensuite, connectez la chambre au système, ajoutez quatre millilitres de DMEM/F-12 dans la chambre de mesure de la résistance tissulaire et laissez-la rester à température ambiante pendant environ 30 minutes.

Après cela, effectuez des mesures TEER en plaçant soigneusement les inserts dans la chambre de mesure de la résistance des tissus. Voici les images de microscopie à contraste de phase des PBEC, des cultures et des astrocytes visualisées pendant cinq jours. Les fragments capillaires purifiés le premier jour de la culture initiale ont montré la présence de capillaires et de cellules contaminantes, qui après un changement de milieu le deuxième jour et un jour supplémentaire de croissance, ont montré une sélection pour les PBEC, commençant leur croissance à partir des fragments capillaires.

Des monocouches confluentes de PBEC étaient généralement obtenues du quatrième au sixième jour, moment où les PBEC présentaient une morphologie en forme de fuseau et étaient alignées longitudinalement. Les astrocytes de rat ensemencés dans les puits de fond proliféraient normalement en couches confluentes en cinq jours et étaient utilisés pour des modèles de coculture sans contact après deux semaines de croissance. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept heures.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer l’administration de médicaments et le trafic de récepteurs dans les cellules endothéliales cérébrales serrées et polarisées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer un modèle de barrière hémato-encéphalique in vitro qui peut être utilisé pour de nouvelles études qui ne peuvent pas être menées in vivo.