Imagerie des tissus amyloïdes colorées avec Luminescent thiol conjugués par Hyperspectral confocale microscopie et imagerie de Fluorescence Lifetime

L’objectif global de cette méthode est la détection des dépôts d’agrégats de protéines dans des configurations cliniques et scientifiques. La coloration à l’acide acétique de l’heptaformylthiophène acétique et l’analyse de tissus provenant de modèles animaux de maladie à prions et de maladie d’Alzheimer sont décrites. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’amyloïde, telles que la présence de petites quantités d’agrégats de protéines et leurs variations conformationnelles intrinsèques.

L’avantage de cette technique est qu’elle est plus sélective et plus sensible que les autres techniques conventionnelles. Les implications de cette technique s’étendent au traitement ou au diagnostic de diverses maladies de mauvais repliement des protéines en raison de la possibilité d’adapter les sondes à la technique de visualisation souhaitée. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode ont du mal parce que la ZLEh nécessite une si faible concentration de colorant.

Le HFTAA présente également une longueur d’onde d’excitation et d’émission plus longue par rapport aux colorants conventionnels. Préparez la solution d’oligothiophène conjuguée luminescente en remettant en suspension du hFTAA lyophilisé dans deux millimolaires d’hydroxyde de sodium pour préparer une solution mère d’un milligramme par millilitre. Transférez la solution mère dans un flacon en verre et conservez-la à quatre degrés Celsius.

Si des sections fixées au formol et incluses dans de la paraffine sont utilisées, déparaffiniser le xylène pendant la nuit. Le jour de la coloration, plongez les sections dans des bains consécutifs de 99 % d’éthanol, de 70 % d’éthanol, de dH2O et de PBS pendant dix minutes à chaque fois. Ensuite, laissez les sections de tissu sécher dans des conditions ambiantes.

Pendant que le tissu sèche, préparez une solution de travail de ZLEh en diluant le stock un à 10 000 dans du PBS. Lorsque le tissu est sec, ajoutez des gouttelettes de la solution de travail hFTAA à chaque section de tissu pour le couvrir. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante.

Rincez la solution de coloration avec 500 microlitres de PBS, puis plongez la lame dans le bain PBS pendant 10 minutes. Après avoir laissé sécher la section dans des conditions ambiantes, montez à l’aide d’un milieu de montage à fluorescence. Laissez le support de montage se décanter pendant la nuit.

La détection de l’amyloïde peut être effectuée directement après le montage, ou même sans montage. Cependant, si le but de l’expérience est de recueillir des informations spectrales de haute qualité, l’incubation d’une nuit est préférable. Ouvrez le logiciel du microscope, nommez le projet, sélectionnez l’image spectrale et lancez l’acquisition.

Sélectionnez l’objet d’intérêt à travers l’oculaire à l’aide du filtre d’excitation de 436 nanomètres et décalez le chemin de la lumière vers la caméra. Dans le gestionnaire de données de cas, sélectionnez le type d’échantillon spectral, étiquetez l’échantillon et appuyez sur acquérir. La fenêtre d’acquisition s’ouvre.

Sous Imagerie spectrale, ouvrez le menu des paramètres, sélectionnez les propriétés d’acquisition et réglez la plage spectrale sur 460 à 700, la qualité de la vitesse à la vitesse maximale et le type de mesure sur les filtres étroits laser à gaz. Fermez la boîte de dialogue. Dans le menu de l’image, sélectionnez Live full.

Dans la barre de l’icône, désactivez les franges. Sélectionnez une région pour l’image et assurez-vous que la valeur maximale de la mémoire est inférieure à 800 mégaoctets. Réglez le temps d’exposition sur une valeur qui donne une luminosité totale de l’image comprise entre 1 000 et 3 000.

Dans la barre de l’icône, appuyez sur l’appareil photo coloré. L’acquisition va commencer. Une fois l’acquisition de l’image terminée, appuyez sur Enregistrer dans la boîte de dialogue Acquérir une image spectrale et sur Nouvelle cellule dans la boîte de dialogue du gestionnaire de données de cas.

À partir du gestionnaire de données de cas, ouvrez l’image collectée à l’aide du bouton Démarrer l’analyse. La fenêtre d’analyse des données s’ouvre. Des informations spectrales peuvent être collectées à partir de chaque pixel de l’image en sélectionnant les zones d’intérêt à l’aide de la boîte de dialogue d’affichage spectral.

Choisissez Définir et sélectionnez les zones d’intérêt dans les zones pertinentes de l’image. Enregistrez les données spectrales sous forme de fichier texte à l’aide du bouton Lib. Le fichier txt enregistré peut être importé dans n’importe quel logiciel d’analyse de votre choix.

Ouvrez le logiciel du microscope et commencez par configurer le microscope confocal. Réglez l’intensité du laser sur 0,2 %, le sténopé sur une unité Airy, la taille de l’image sur 1 024 x 1 024 pixels, la vitesse de balayage sur sept en moyenne sur 16 balayages et la profondeur de bits sur huit bits. Pour collecter le spectre d’émission, sélectionnez le mode lambda et le laser argon réglé sur 488 nanomètres.

Collectez des émissions entre 499 et 691 nanomètres à l’aide de 22 canaux dans le détecteur de souffle à 32 canaux. Réglez le gain sur 755. Cliquez sur le bouton en direct et changez la palette en indicateur de plage et ajustez le gain pour permettre aux pixels non surchargés en rouge.

Cliquez sur le bouton d’arrêt, puis capturez l’image à l’aide d’un bouton-pression. Pour obtenir des images monocouches, sélectionnez l’option de configuration intelligente. Sélectionnez FITC et Alexa 532.

Sélectionnez le démixage linéaire et appliquez-le. Ajustez le gain pour tenir compte des pixels non surchargés. Pour FITC, réglez le gain sur 693 et pour Alexa 532, réglez le gain sur 433 en mode direct.

Cliquez sur le bouton d’arrêt, puis capturez l’image à l’aide d’un bouton-pression. Basculez le microscope en mode FLIM. Réglez le sténopé sur 20, la longueur d’onde d’excitation sur 490 nanomètres et l’intensité du laser sur 0,5 %Utilisez des lasers pulsés à 40 mégahertz.

Dans le logiciel FLIM, configurez le comptage de photons sur 550 nanomètres. Dans la fenêtre des paramètres d’affichage, suivez le comptage des photons jusqu’à ce que le nombre maximum soit d’environ 4 000 comptes de photons. Enregistrez le fichier et exportez-le en tant qu’image SPC.

Cette image montre des corps de Mallory-Denk constitués d’agrégats de kératine dans des hépatocytes hépatiques contre-colorés avec du DAPI. Ici, des inclusions positives à P62 sont mises en évidence dans le tissu musculaire squelettique de myosite à inclusions sporadiques. Cette image montre une inclusion amyloïde d’un polypeptide amyloïde dans le pancréas humain.

Un dépôt amyloïde de chaîne légère d’immunoglobulines dans l’intestin humain est montré ici. Cette image montre des dépôts d’agrégats de protéines prions de tremblante de mouton dans le cerveau de souris. Les agrégats de protéines prions dans le cerveau d’une souris infectée par la maladie débilitante chronique sont présentés ici.

Cette image montre des plaques A-bêta-amyloïdes dans le cerveau de souris APP23. Et cette image montre la pathologie A-bêta dans le cerveau de la souris APP-PS1. Ces frottis de biopsie graisseuse à partir d’échantillons diagnostiques de transthyrétine amyloïde chez des patients humains classés de un à quatre selon le score standard Congo Red.

Les zones jaunes montrent des dépôts amyloïdes de transthyrétine colorés à la ZLECA, et le bleu est l’autofluorescence du tissu adipeux. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de colorer à une concentration suffisamment faible. N’oubliez pas non plus d’utiliser des filtres passe-long pour obtenir le contraste maximal et d’éviter l’autofluorescence et la fluorescence de coloration de fond.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunofluorescence peuvent être effectuées afin d’identifier la protéine agrégée et d’identifier les protéines coagrégées. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’amylose pour explorer les structures d’agrégats de protéines et à la chimie organique pour concevoir de nouvelles sondes pour ces cibles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire la coloration LCO à l’imagerie avec chacune avec des techniques différentes.