Ingénierie du tissu cornéen : Un In Vitro modèle des Interactions stroma-nerf de la cornée humaine

L’objectif global de ce protocole est d’étudier les interactions cellulaires entre les cellules stromales cornéennes humaines et les cellules neuronales dans leur matrice extracellulaire naturelle. Le protocole peut être étendu à l’étude des maladies et des dystrophies de la cornée, telles que le kératocône, la kératopathie diabétique et la dystrophie de Fuchs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de la cornée humaine, en identifiant les mécanismes sous-jacents et les défauts dans les interactions nerveuses du stroma au cours d’une maladie ou d’une dystrophie cornéenne spécifique.

Le principal avantage de cette technique est que les cellules sont autorisées à sécréter leur propre matrice extracellulaire in vitro, ce qui fournit un modèle meilleur et plus précis du tissu cornéen humain réel in vivo. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies de la cornée, car l’évaluation des interactions cellule-cellule et de la matrice extracellulaire cellulaire garantira une représentation précise du tissu cornéen et permettra un développement de médicaments plus ciblé. Maintenant, cette méthode peut donner un aperçu des lésions et de la régénération des nerfs cornéens.

Il peut également être appliqué à d’autres systèmes, tels que le dépistage et le développement de médicaments. À la réception d’échantillons de tissu cornéen humain, transférez les tissus dans une boîte de 21,5 centimètres carrés contenant deux millilitres de solution saline stérile tamponnée au phosphate de Dulbecco. Positionnez le dôme de la cornée face vers le haut et utilisez une lame de rasoir à un angle de 45 degrés pour gratter la couche épithéliale.

Ensuite, retournez le dôme de la cornée face vers le bas et grattez soigneusement l’endothélium du stroma. Lavez le tissu stromal avec du DPBS. Gardez les morceaux stromaux mouillés avec du DPBS et utilisez une lame chirurgicale numéro 10 pour couper les tissus stromaux en petits morceaux.

À l’aide d’une pince stérile, transférez les morceaux stromaux dans un flacon de culture T25 sans milieu. Laissez les explants adhérer au fond du ballon à 37 degrés Celsius pendant environ 30 à 40 minutes. Après avoir coupé avec précision le tissu stromal, transférez soigneusement le ballon dans l’incubateur.

Il est important de prévoir 30 à 40 minutes, puis d’ajouter lentement le média. Cette étape est essentielle pour permettre une adhérence complète des explants, et éviter leur détachement. Une fois adhéré, ajoutez lentement le milieu essentiel minimum d’Eagle, contenant 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % d’antibiotique-antimycosique dans le flacon, sans déranger les explants.

Placez délicatement le ballon dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Laissez les explants intacts jusqu’à ce que les cellules commencent à s’isoler et à migrer dans le flacon. Après environ deux à quatre semaines, les cellules devraient atteindre 100 % de confluence.

Lors de la confluence à 100 %, faites passer les cellules en retirant le milieu de culture tissulaire et en lavant les cellules avec du DPBS. Ajoutez de la trypsine aux cellules, puis incubez à 37 degrés Celsius. Après environ cinq minutes, observez les cellules sous une microscopie optique pour confirmer qu’elles se sont détachées.

Arrêtez la protéolyse en ajoutant un milieu frais et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les tubes à 1000 x g pour granuler les cellules. Retirez le surnageant avec précaution sans déranger la pastille et suspendez les cellules dans un milieu frais.

Après avoir effectué un comptage cellulaire, ensemencer environ une fois 10 fois les six cellules dans le flacon de culture T75 avec un milieu frais pour une expansion supplémentaire. Pour assembler la construction 3D, il faut d’abord passer et compter les fibroblastes cornéens humains, puis ensemencer environ une fois 10 à six HCF sur un insert de membrane en polycarbonate avec des pores de 0,4 micron. Ajoutez 1,5 millilitre de milieu frais sur le dessus de la construction.

Ensuite, pipetez 1,5 millilitres du même milieu au bas de chaque construction. Après 24 heures, ajoutez 1,5 millilitre de milieu, complété par 0,5 millimolaire de vitamine C en haut et en bas de chaque construction. Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois semaines, en ajoutant un milieu frais contenant de la vitamine C tous les deux jours.

Cela stimulera les cellules à sécréter et à assembler leur propre matrice extracellulaire. Après trois semaines, ajoutez huit fois 10 à la troisième cellule de neuroblastome humain SH-SY5Y au-dessus des constructions 3D précédemment assemblées. Il est essentiel de calculer le nombre exact de cellules à cette étape et de prévoir 24 heures avant de commencer la différenciation cellulaire.

Après 24 heures d’incubation, amorcez la différenciation cellulaire SH-SY5Y en stimulant les cellules avec 1,5 millilitre d’EMEM avec 10 % de FBS et 10 micromolaires d’acide rétinoïque. Ajoutez ensuite 1,5 millilitre du milieu contenant de la vitamine C au bas de la construction. L’acide rétinoïque est sensible à la lumière, cette étape doit donc être effectuée dans l’obscurité.

Après cinq jours, lorsque les cellules atteignent la phase de différenciation, ajoutez 1,5 millilitre de milieu sans sérum contenant deux nanomolaires de BDNF et 1 % d’antibiotique-antimycosique au sommet de la construction. Ajoutez un milieu frais complété en vitamine C au bas de la construction. Cultivez les cellules pendant deux jours supplémentaires avant de les traiter pour une analyse plus approfondie.

Il s’agit d’une image de microscopie électronique à transmission à fort grossissement de la construction 3D auto-assemblée montrant la membrane en polycarbonate et les cellules stromales cornéennes assises sur le dessus. Cette image montre les cellules neuronales différenciées assises sur le dessus, qui présentent un arrangement cellulaire stromal-neuronal. Les flèches de l’image montrent les cellules neuronales.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder le tissu cornéen humide à tout moment, lors de la coupe d’explants, et de maintenir les instruments chirurgicaux et les lames stériles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de configurer et d’utiliser ce modèle in vitro pour étudier les interactions cellulaires entre les cellules stromales cornéennes humaines et les cellules neuronales dans leur matrice extracellulaire naturelle. N’oubliez pas que travailler avec du BDNF, de l’acide rétinoïque et des lames chirurgicales peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, telles que le port de vêtements de protection appropriés, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.