Name: Ingénierie du tissu cornéen : Un In Vitro modèle des Interactions stroma-nerf de la cornée humaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Découvrez un modèle 3D in vitro pour étudier les interactions stroma-nerf dans la cornée humaine. Cette méthode permet aux cellules de sécréter leur propre matrice extracellulaire, offrant un modèle plus fidèle du tissu cornéen.

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Nous tenons à remercier sincèrement le Dr Ben Fowler pour son aide technique avec les expériences TEM.

Ce protocole suit les directives de la Commission de révision de l’Université d’Oklahoma Health Sciences Center/institutionnel (CISR #4509). Toutes les parties du protocole a rencontré les principes de la déclaration d’Helsinki. Cornée échantillons ont été prélevés de développement National et Research Institute (NDRI) et la Banque des yeux Lions Oklahoma.
1. isolement de cellules primaires
<ol><li>Dès réception des échantillons de tissus cornée humaine, transférer les tissus dans un 21,5 cm2 boîte de Pétri contenant 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco stérile (SPD) (1 x).</li>
	<li>Gratter et enlever l’épithélium cornéen en positionnant la cornée dôme face vers le haut. Afin d’assurer l’élimination complète, gratter la couche épithéliale soigneusement à l’aide d’une lame de rasoir à un angle de 45°. Ensuite, retournez la cornée dôme face vers le bas et grattez soigneusement l’endothélium du stroma avec une lame de rasoir à un angle de 45° pour assurer l’élimination complète. Laver le tissu stromal avec le SPD.</li>
	<li>Couper les tissus stromales en petits morceaux, à l’aide d’une lame chirurgicale du numéro 10, gardant les morceaux stromales mouillés lors de tous les temps à l’aide de SPD. Ramasser stromales morceaux avec une pince stérile et la place dans une fiole de la culture du T25 sans médias (4 ou 5 morceaux de tissu de 2 x 2 mm par flacon).</li>
	<li>Laissez les explants d’adhérer au fond de la fiole à 37 ° C pendant environ 30-40 min. Une fois collé, ajouter lentement le minimum indispensable milieu Eagle (EMEM) contenant 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % antibiotique/antimycosique au ballon sans déranger les explants.</li>
	<li>Placer délicatement le ballon dans l’incubateur à 37 ° C, 5 % de CO2. Laisser les explants jusqu'à ce que les cellules commencent à isoler et migration dans le ballon. Après environ 2 à 4 semaines, les cellules devraient atteindre 100 % confluence. À la confluence de 100 %, les cellules de passage en enlevant les milieux de culture de tissu et laver les cellules avec le SPD.</li>
	<li>Ajouter la trypsine aux cellules et puis les incuber à 37° C. Après environ 5 min, Découvre les cellules sous microscopie pour confirmer qu’ils ont détaché et puis arrêter la protéolyse en ajoutant les supports neufs.</li>
	<li>Transférer la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL pour centrifugation à 1 000 x g. éliminer le surnageant soigneusement sans déranger le culot et suspendre les cellules en EMEM frais 10 % BF 1 % aux antibiotiques. Compter les cellules et les graines environ 1 x 106 cellules en flacon de culture T75 pour poursuivre son expansion avec EMEM frais 1 % FBS 1 % aux antibiotiques.</li>
</ol>2. primaire CS Culture et assemblage de constructions 3D
<ol><li>Montage 3D constructions d’explants auparavant cultivés en EMEM 10 % BF 1 % antibiotique/antimycosique, passage et comte cs.</li>
	<li>Graines environ la 1 x 106 cellules/puits de primaires CS sur inserts membrane en polycarbonate avec pores 0,4 µm des constructions 3D, ainsi que de 1,5 mL de EMEM frais 10 % BF 1 % antibiotique/antimycosique jusqu’au sommet de la construction. Ajouter un autre 1,5 mL de ces mêmes médias au fond de chaque construction.</li>
	<li>Après 24 h d’ensemencement de la cellule, la culture des cellules avec EMEM 10 % BF 1 % antibiotique/antimycosique, stimulée par l’acide 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic (vitamine C) de 0,5 mM par ajoutant 1,5 sur le dessus et 1,5 mL sur la partie inférieure de chaque construction.</li>
	<li>Maintenir les cultures dans un incubateur à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 3 semaines et fournir les supports neufs, tous les deux jours pendant toute la période témoin. Aucun autre passage n’est nécessaire.</li>
</ol>3. différenciation et des cultures de cellules
<ol><li>Après 3 semaines, ajoutez 8 x 103 cellules/puits de cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y sur le dessus de la 3D déjà assemblé construit contenant 1,5 mL de la EMEM contenant 10 % BF, 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 1 % antibiotique/antimycosique et 0,5 mM Acid (vitamine C).<ol>
<li>Laissez les cellules de neuroblastome SH-SY5Y de croître sur le dessus les cellules stromales de la cornée pendant au moins 24 h avant d’initier la différenciation cellulaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Initier la différenciation des cellules SH-SY5Y en stimulant les cellules avec EMEM contenant 1 % FBS et 1,5 mL de 10 µM acide rétinoïque sur le dessus de la construction. Ajouter 1,5 mL de la EMEM FBS 1 % antibiotique/antimycosique 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acide à 10 % (vitamine C) vers le bas de la construction. Veuillez noter que l’étape de l’acide rétinoïque doit être exécutée dans l’obscurité.<ol>
<li>Continuer à la culture des cellules dans les médias de cette différenciation pendant 5 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lorsque les cellules atteignent la phase de différenciation, passer les cellules à 1,5 mL de milieu sans sérum contenant 2 nM de Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) et 1 % antibiotique/antimycosique ajouté à la EMEM, en ajoutant au début de la construction. Ajouter 1,5 mL de la EMEM FBS 1 % antibiotique/antimycosique 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acide à 10 % (vitamine C) vers le bas de la construction. Veuillez noter que l’étape BDNF doit être exécutée dans l’obscurité.</li>
	<li>La culture des cellules pour 2 jours supplémentaires avant le traitement pour une analyse ultérieure, comme il est indiqué dans le tableau 1.</li>
</ol>

<ol><li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+visual+impairment%3A+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Global estimates of visual impairment: 2010.</a> Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).</li>
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<li>Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+tissue+engineering%3A+recent+advances+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives.</a> Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).</li>
<li>Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Cell+Models+for+Ophthalmic+Drug+Development+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications.</a> BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).</li>
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<li>Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Stromal+Cell+Plasticity%3A+In+Vitro+Regulation+of+Cell+Phenotype+Through+Cell-Cell+Interactions+in+a+Three-Dimensional+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).</li>
<li>Proulx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+a+human+cornea+by+the+self-assembly+approach+of+tissue+engineering+using+the+three+native+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types.</a> Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).</li>
<li>Gonzalez-Andrades, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+in+vitro+model+of+stratified+epithelial+wound+healing+with+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function.</a> Sci Rep. 6, 19395(2016).</li>
<li>Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+modeling+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">3D in vitro modeling of the central nervous system.</a> Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).</li>
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<li>Koulikovska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+regeneration+of+corneal+tissue+via+a+bioengineered+collagen+construct+implanted+by+a+nondisruptive+surgical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique.</a> Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).</li>
<li>Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+retinal+and+eye+research%22%5BJournal%5D)">Progress in corneal wound healing.</a> Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).</li>
<li>Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix and wound healing.</a> Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).</li>
<li>Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta3+regulates+assembly+of+a+non-fibrotic+matrix+in+a+3D+corneal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).</li>
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<li>Karamichos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+in+Vitro+Model+for+Keratoconus+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease.</a> J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Plusieurs études ont surtout portés sur le développement de divers modèles animaux peuvent aider à développer une meilleure compréhension des maladies de la cornée ainsi que découvrir des traitements. Toutefois, une valeur significative pour les humains de ces études n’a pas été vérifiée. A ce jour, différents modèles in vitro ont été mis au point et largement étudiés en raison de leur importance clinique remarquable. Notre modèle établie antérieurement 3D in vitro est un système novateur qui significat...

Dans le corps humain, la cornée est un tissu plus densément innervé. Les nerfs sont responsables pour des sensations variées comme le toucher, la douleur, température et ont également un rôle essentiel dans la guérison des plaies, réflexes de cligner des yeux, déchirer la production et la sécrétion5,6,7. Dans la cornée, stromales troncs nerveux proviennent du plexus limbique et entrer dans le stroma cornéen périphérique radialement. L’organisation nerveuse stromales est parallèle aux lamelles de collagène et elles davantage créer une branche en petits fascicules comme ils aller de l’avant vers le stroma superficiel5,8. Les fibres nerveuses plus pénétrer la couche épithéliale et ainsi, innervation est largement étalée dans l’épithélium de la cornée et le stroma. Par conséquent, une innervation a un rôle essentiel dans l’état sain et malade de la cornée. Dans ce protocole, nous révélons la promotion d’un modèle nouveau 3D in vitro , qui est le premier du genre à simuler les interactions de stroma-nerf in vivo . La lignée SH-SY5Y a été utilisée pour cette étude, car il est une des lignes plus établis, bien caractérisés, utilisés pour étudier la croissance neuronale. La lignée SH-SY5Y a été décrite pour produire les deux adhérentes de substrat (type S) et les cellules neuroblastiques (type N) qui peut subir la transdifférenciation9. Ainsi, même si cette lignée cellulaire provient d’une sélection de triple sous-clone successives de cellules de type N, il contient également un petit nombre de cellules de type S capables de subir une différenciation dans les neurones grâce à l’utilisation de retinoic acid et encéphales Neurotrophic factor9. Ceci fournit un outil qui peut conduire à une meilleure compréhension des cornée complications associées de la rétinopathie diabétique (DM) et d’autres maladies oculaires. En raison des difficultés liées à l’obtention et la culture de neurones provenant de patients atteints de maladie oculaire, ce modèle 3D en vitro fournit des conséquences majeures en étudiant les interactions neuronales et la signalisation avec le stroma cornéen.
Conditions de malades affectent souvent divers tissus du corps à très grande échelle, menant à une qualité de vie compromise. Dystrophies oculaires sont des complications fréquentes, souvent associées aux maladies systémiques et conduire à la perte d’acuité visuelle ou une perte de vision voire permanente. Études approfondies sont souvent indispensables pour une meilleure compréhension de la maladie ainsi que les effets au niveau cellulaire basal. Afin d’étudier les effets de ces maladies, les différents modèles in vivo et in vitro ont été développés avec l’aide d’applications en génie tissulaire. Applications d’ingénierie du tissu cornéen ont suscité grand intérêt dans des domaines variés des sciences10,11,12,13,14, mais il y a des limitations majeures subsistent pendant application effective, y compris cornée greffe rejets, infections et cicatrices10,11,12,13,14. Il existe plusieurs études qui ont avec succès développé et mis en place diverses in vitro modèles3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. Les modèles 3D in vitro sont les plus prometteurs et d’un grand intérêt scientifique. Les modèles 3D sont connus pour mieux refléter l’in vivo événements cellulaires et physiologiques qui sont essentiels au cours de la fibrose et enroulé de guérison15,27,28,29. Ces modèles in vitro jouent un rôle essentiel dans la recherche de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement des différentes pathologies dont les complications cornéennes. Malgré le rôle essentiel de l’innervation en fonctions de la cornée, peu d’efforts accompli pour promouvoir la prolifération des nerfs périphériques au sein des constructions tissulaire cornéenne2,3. Toutefois, les constructions de cellule projet 3D en vitro imitent le tissu cible afin de réaliser la fonctionnalité désirée de tissu.
Kératopathie diabétique est une application évidente pour le modèle décrit ici les défauts neuronale, il y a plusieurs autres maladies de la cornée qui peuvent bénéficier d’un modèle humain in vitro y compris dystrophies kératocône et Fuchs. Notre modèle 3D se dégage de cette perspective et propose le développement d’une représentation in vitro de tissu cornéen pour évaluer l’administration de médicaments et de la sécurité des nouveaux médicaments oculaires.

<table><tbody><tr><td>Tissu cornéen sain</td><td>NDRI</td><td></td><td>Échantillons provenant de donneurs sans traumatisme oculaire ni maladie systémique</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solution tamponnée phosphate (1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Pince stérile</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Fisherbrand Dissection Extra-Fine-Point-Splinter</td></tr><tr><td>Span Blades de rasoir à un seul tranchant</td><td>Personna</td><td>270100</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel chirurgical stériles No.10</td><td>Feather Surgical Blade</td><td>2976#10</td><td></td></tr><tr><td>Eagle' s Minimum Essential Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>10 % FBS est requis pour la préparation des milieux</td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycosique (100X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>1 % Antibiotique-Antimycosique est nécessaire pour la préparation des milieux</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine EDTA(1X)</td><td>Gibco de Life Technologies</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Inserts de membrane en polycarbonate avec 0,4-&mu ; Pores</td><td>Corning Costar</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>Acide 2-O-&alpha ;-Dglucopyranosyl-L-ascorbique (Vitamine C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SMB00390-14</td><td>Une concentration de 0,5 mM doit être utilisée pour l’étude</td></tr><tr><td>Bloc de cire</td><td>VWR</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y Cellules de neuroblastome</td><td>ATCC</td><td>SHSY5YATCC CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Acide rétinoïque Sigma-Aldrich</td><td></td><td>SRP3014-10UG</td><td>La concentration finale de 10 μM doit être utilisée</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-100MG</td> La <td>concentration finale de 2 nM doit être utilisée</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>VWR-Alfa Aesar</td><td>67-68-5</td><td>Ultra Pure Grade-Sterile DMSO à utiliser</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-351</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr></tbody></table>

ingénierie du tissu cornéen : un in vitro modèle des interactions stroma-nerf de la cornée humaine

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Génie tissulaire a acquis une reconnaissance considérable en raison de la forte demande pour les remplacements de la cornée humaine avec environ 10 millions de personnes dans le monde souffrent de perte de vision cornéen1. Pour répondre à la demande de cornées humaines viables, des progrès significatifs dans le tissu en trois dimensions (3D) génie a2,3,4. Ces cornée modèles allant des systèmes monocouche simple aux modèles multicouches, menant à 3D pleine épaisseur cornéenne équivalents2.
Cependant, l’utilisation de la 3D corné tissulaire dans le contexte des modèles in vitro de maladies étudiées à date n’a pas de ressemblance avec la structure multicouche du tissu cornéen 3D, la fonction et la mise en réseau des différents types de cellules (c.-à-d., nerf, épithélium, stroma et l’endothélium)2,3. En outre, la demande pour les modèles de tissus in vitro cornée a augmenté dans le but de réduire l’expérimentation animale pour les produits pharmaceutiques. Ainsi, des modèles plus sophistiqués sont nécessaires afin de mieux correspondre aux besoins physiologiques humaines, les systèmes et le développement d’un modèle qui est plus pertinent à la population de patients est absolument nécessaire. Étant donné que plusieurs types de cellules de la cornée sont touchés par les maladies et les dystrophies musculaires, tels que le kératocône, kératopathie diabétique et Fuchs, ce modèle comprend un modèle 3D de co-culture de fibroblastes cornéens humaines primaires (CS) de donneurs sains et les neurones de la lignée de cellules SH-SY5Y. Cela nous permet pour la première fois étudier les interactions entre les deux types de cellules dans le tissu de la cornée humain. Nous croyons que ce modèle pourrait potentiellement disséquer les mécanismes sous-jacents liés à des interactions stroma-nerf de maladies de la cornée qui présentent des dommages de nerf. Ce modèle 3D reflète la nature fondamentale d’anatomique et physiologique du tissu cornéen in vivo et peut servir à l’avenir comme un outil pour étudier les défauts cornéens ainsi que l’efficacité des divers agents de dépistage avant l’expérimentation animale.

La figure 1 présente une image représentative étape par étape du travail 3D in vitro modèle. Lors de la première étape, les cellules sont isolées de cornées humaines. Puis, ils sont cultivés sur une membrane en polycarbonate et stimulés par la vitamine C pour assembler une matrice 3D automatique sécrétée. Ce système de construction 3D induit la synthèse d’un multicouche cellulaire in vivo-comme matrice stromal. Par la suite, les cellules de ...

Ce protocole décrit un roman en trois dimensions in vitro model, où les cellules du stroma cornéens et différenciés de cellules neuronales sont élevées ensemble afin d’aider à l’examen et la compréhension des interactions entre les deux types cellulaires.

Ingénierie du tissu cornéen : Un In Vitro modèle des Interactions stroma-nerf de la cornée humaine

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

L’objectif global de ce protocole est d’étudier les interactions cellulaires entre les cellules stromales cornéennes humaines et les cellules neuronales dans leur matrice extracellulaire naturelle. Le protocole peut être étendu à l’étude des maladies et des dystrophies de la cornée, telles que le kératocône, la kératopathie diabétique et la dystrophie de Fuchs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de la cornée humaine, en identifiant les mécanismes sous-jacents et les défauts dans les interactions nerveuses du stroma au cours d’une maladie ou d’une dystrophie cornéenne spécifique.Le principal avantage de cette technique est que les cellules sont autorisées à sécréter leur propre matrice extracellulaire in vitro, ce qui fournit un modèle meilleur et plus précis du tissu cornéen humain réel in vivo. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies de la cornée, car l’évaluation des interactions cellule-cellule et de la matrice extracellulaire cellulaire garantira une représentation précise du tissu cornéen et permettra un développement de médicaments plus ciblé. Maintenant, cette méthode peut donner un aperçu des lésions et de la régénération des nerfs cornéens.Il peut également être appliqué à d’autres systèmes, tels que le dépistage et le développement de médicaments. À la réception d’échantillons de tissu cornéen humain, transférez les tissus dans une boîte de 21,5 centimètres carrés contenant deux millilitres de solution saline stérile tamponnée au phosphate de Dulbecco. Positionnez le dôme de la cornée face vers le haut et utilisez une lame de rasoir à un angle de 45 degrés pour gratter la couche épithéliale.Ensuite, retournez le dôme de la cornée face vers le bas et grattez soigneusement l’endothélium du stroma. Lavez le tissu stromal avec du DPBS. Gardez les morceaux stromaux mouillés avec du DPBS et utilisez une lame chirurgicale numéro 10 pour couper les tissus stromaux en petits morceaux.À l’aide d’une pince stérile, transférez les morceaux stromaux dans un flacon de culture T25 sans milieu. Laissez les explants adhérer au fond du ballon à 37 degrés Celsius pendant environ 30 à 40 minutes. Après avoir coupé avec précision le tissu stromal, transférez soigneusement le ballon dans l’incubateur.Il est important de prévoir 30 à 40 minutes, puis d’ajouter lentement le média. Cette étape est essentielle pour permettre une adhérence complète des explants, et éviter leur détachement. Une fois adhéré, ajoutez lentement le milieu essentiel minimum d’Eagle, contenant 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % d’antibiotique-antimycosique dans le flacon, sans déranger les explants.Placez délicatement le ballon dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Laissez les explants intacts jusqu’à ce que les cellules commencent à s’isoler et à migrer dans le flacon. Après environ deux à quatre semaines, les cellules devraient atteindre 100 % de confluence.Lors de la confluence à 100 %, faites passer les cellules en retirant le milieu de culture tissulaire et en lavant les cellules avec du DPBS. Ajoutez de la trypsine aux cellules, puis incubez à 37 degrés Celsius. Après environ cinq minutes, observez les cellules sous une microscopie optique pour confirmer qu’elles se sont détachées.Arrêtez la protéolyse en ajoutant un milieu frais et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les tubes à 1000 x g pour granuler les cellules. Retirez le surnageant avec précaution sans déranger la pastille et suspendez les cellules dans un milieu frais.Après avoir effectué un comptage cellulaire, ensemencer environ une fois 10 fois les six cellules dans le flacon de culture T75 avec un milieu frais pour une expansion supplémentaire. Pour assembler la construction 3D, il faut d’abord passer et compter les fibroblastes cornéens humains, puis ensemencer environ une fois 10 à six HCF sur un insert de membrane en polycarbonate avec des pores de 0,4 micron. Ajoutez 1,5 millilitre de milieu frais sur le dessus de la construction.Ensuite, pipetez 1,5 millilitres du même milieu au bas de chaque construction. Après 24 heures, ajoutez 1,5 millilitre de milieu, complété par 0,5 millimolaire de vitamine C en haut et en bas de chaque construction. Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois semaines, en ajoutant un milieu frais contenant de la vitamine C tous les deux jours.Cela stimulera les cellules à sécréter et à assembler leur propre matrice extracellulaire. Après trois semaines, ajoutez huit fois 10 à la troisième cellule de neuroblastome humain SH-SY5Y au-dessus des constructions 3D précédemment assemblées. Il est essentiel de calculer le nombre exact de cellules à cette étape et de prévoir 24 heures avant de commencer la différenciation cellulaire.Après 24 heures d’incubation, amorcez la différenciation cellulaire SH-SY5Y en stimulant les cellules avec 1,5 millilitre d’EMEM avec 10 % de FBS et 10 micromolaires d’acide rétinoïque. Ajoutez ensuite 1,5 millilitre du milieu contenant de la vitamine C au bas de la construction. L’acide rétinoïque est sensible à la lumière, cette étape doit donc être effectuée dans l’obscurité.Après cinq jours, lorsque les cellules atteignent la phase de différenciation, ajoutez 1,5 millilitre de milieu sans sérum contenant deux nanomolaires de BDNF et 1 % d’antibiotique-antimycosique au sommet de la construction. Ajoutez un milieu frais complété en vitamine C au bas de la construction. Cultivez les cellules pendant deux jours supplémentaires avant de les traiter pour une analyse plus approfondie.Il s’agit d’une image de microscopie électronique à transmission à fort grossissement de la construction 3D auto-assemblée montrant la membrane en polycarbonate et les cellules stromales cornéennes assises sur le dessus. Cette image montre les cellules neuronales différenciées assises sur le dessus, qui présentent un arrangement cellulaire stromal-neuronal. Les flèches de l’image montrent les cellules neuronales.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder le tissu cornéen humide à tout moment, lors de la coupe d’explants, et de maintenir les instruments chirurgicaux et les lames stériles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de configurer et d’utiliser ce modèle in vitro pour étudier les interactions cellulaires entre les cellules stromales cornéennes humaines et les cellules neuronales dans leur matrice extracellulaire naturelle. N’oubliez pas que travailler avec du BDNF, de l’acide rétinoïque et des lames chirurgicales peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, telles que le port de vêtements de protection appropriés, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo présente une technique permettant de générer un système de modèle de co-culture tridimensionnel de fibroblastes cornéens humains primaires et de cellules neuronales différenciées. Ce système de co-culture peut être utilisé pour étudier les interactions stromales-nerveuses.

Génération d’un modèle de co-culture 3D de fibroblastes et de neurones cornéens humains

Nous rapportons une technique pour la fabrication de micropoches dans les membranes électrofilées dans lequel étudient le comportement des cellules. Plus précisément, nous décrivons une combinaison de microstéréolithographie électrofilage et pour la production de PLGA (poly (lactide-co-glycolide)), des dispositifs de biomatériaux équipés de micro-caractéristiques de la cornée.

Combinaison de Microstéréolithographie et Électrofilage à produire des membranes Equipé Niches pour la régénération de la cornée

Une culture primaire de cellules endothéliales de cornée bovine a été utilisée pour étudier le mécanisme de transition endotheliale de la cornée mésenchymateuses. En outre, un modèle d'endothélium cornéen cryolésion de rat a été utilisé pour démontrer la transition de l' endothélium de la cornée mésenchymateuses in vivo.

In vitro et dans des modèles in vivo pour étudier la transition cornéenne endothéliale-mésenchymateuses

Un protocole pour un ancien modèle de culture de cornée orgue vivo utile pour la cicatrisation des études est exposée. Ce système de modèle peut servir à évaluer les effets des agents pour favoriser la guérison régénératrice ou toxicité des médicaments dans un environnement 3D organisé de multicellulaire.

Ex Vivo, modèle de Culture d’organes cornéenne pour la cicatrisation des études

Ici, un protocole étape par étape pour la préparation et la culture des boutons cornéens fendus porcins est présenté. Comme ce modèle de culture d'organes organo-typiquement cultivé montre des taux de mortalité cellulaire dans les 15 jours, comparables aux cornées de donneurs humains, il représente le premier modèle permettant la culture à long terme de cornées non humaines sans ajouter de dextran toxique.

Un modèle de culture d'orgue endothéliale de porc cornée utilisant des boutons cornéens fendus

Ici, nous présentons un protocole pour détacher les cellules endothéliales cornéennes (CEC) de la membrane de Descemet (DM) à l’aide d’un neodymium:YAG (Nd:YAG) laser comme modèle de maladie ex vivo pour la kératompathie bullous (BK).

Développement d’un modèle expérimental non invasif assisté au laser de la perte de cellules endothéliales cornéennes

Ce protocole décrit les étapes critiques nécessaires pour établir et cultiver les cultures endothéliales cornéennes de cellules des explants des tissus humains ou de mouton. Une méthode pour subculturing cellules endothéliales cornéennes sur les biomatériaux membranaires est également présentée.

Croissance des couches cellulaires endothéliales coréennes humaines et brebis sur les membranes biomatériaux

Ici, des modèles animaux basés sur la souris et le lapin sont développés pour les lésions mécaniques et chimiques de l’épithélium cornéen afin de cribler de nouveaux traitements et le mécanisme sous-jacent.

Modèles animaux ex vivo et in vivo pour les lésions mécaniques et chimiques de l’épithélium cornéen

Le Stripping Only de Descemet est une procédure expérimentale dans laquelle les patients atteints de guttase cornéenne centrale résultant d’une dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs ont la membrane de Descemet dépouillée pour que les cellules périphériques régénèrent la couche endothéliale. Nous présentons une nouvelle méthodologie simulant le DSO dans les cornées humaines dystrophiques ex vivo avec une guérison accélérée stimulée par eFGF1 (NM141).

Un modèle de culture d’organes cornéens humains du décapage de Descemet uniquement avec une guérison accélérée stimulée par le facteur de croissance des fibroblastes 1

Le présent protocole démontre les différentes étapes impliquées dans la blessure de la cornée d’un poussin embryonnaire in ovo. Les cornées régénérantes ou entièrement restaurées peuvent être analysées pour leur potentiel de régénération à l’aide de diverses techniques cellulaires et moléculaires après la procédure de blessure.

Étude de la régénération tissulaire sans cicatrices dans les cornées de poussins embryonnaires blessés

Nous proposons ici trois méthodes différentes pour endommager les fibres sensorielles qui innervent la cornée. Ces méthodes facilitent l’étude de la régénération axonale chez la souris. Ces trois méthodes, adaptables à d’autres modèles animaux, sont idéales pour l’étude de la physiologie et de la régénération de l’innervation cornéenne.

Trois stratégies pour induire la kératite neurotrophique et la régénération nerveuse dans la cornée murine

Découvrez un modèle 3D in vitro pour étudier les interactions stroma-nerf dans la cornée humaine. Cette méthode permet aux cellules de sécréter leur propre matrice extracellulaire, offrant un modèle plus fidèle du tissu cornéen.

Ingénierie du tissu cornéen : Un In Vitro modèle des Interactions stroma-nerf de la cornée humaine

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