Manipulation de molécules simples de G-quadruplexes par pinces magnétiques

L’objectif global de cette expérience est de mesurer directement le repliement et le dépliage des G-quadruplexes, abrégés en G4, et la régulation par liaison des protéines au niveau de la molécule unique à l’aide d’une pince magnétique. Ce message peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de G4, telles que la dynamique flottante de G4 et la régulation par les protéines de liaison. Le principal avantage de cette technique, est que les pinces magnétiques permettent une mesure stable, de la dynamique flottante de taille nanométrique d’une molécule unique sur plusieurs jours, en utilisant la technique anti-dérive.

Commençons par ce message, peut fournir l’intérieur des mécanismes moléculaires de stabilité de G4, les activités hélicase sur G4, il peut également être utilisé pour sonder les al-a-do-gees liés aux protéines de liaison G4, ou ligans, qui peuvent avoir des applications thérapeutiques potentielles. De plus, il peut également être utilisé pour sonder les interactions protéique externe avec l’ADN ou les interactions protéine. Commencez cette procédure par la préparation de l’ADN G4 dans le canal d’écoulement, comme décrit dans le protocole texte.

L’ADN G4 a été préparé par ligature G4 formant de l’ADN simple brin, de l’ADN simple brin à deux flancs et une poignée d’ADN double brin, à l’aide de ligates d’ADN T4. Pour la configuration de la pince à épiler magnétique, démarrez le programme de pinces magnétiques. Ici, la pince à épiler magnétique est contrôlée par un programme interne de vue de laboratoire écrit.

Ensuite, alignez les centres des aimants avant de monter le canal. Utilisez une lentille 10 fois l’objectif pour régler les axes X et Y du magnétisme, dans l’accès optique du microscope. Utilisez un manipulateur motorisé contrôlé par ordinateur pour déplacer les aimants le long de la direction Z et réglez la distance entre les aimants et la lamelle comme D est égal à zéro, lorsque les aimants se fixent à une lamelle sur le microscope.

Programmez le mouvement du magnétisme à travers le manipulateur pour obtenir le contrôle de la force, y compris la force constante et la force variant dans le temps. Utilisez une source lumineuse à diode électroluminescente brillante pour l’éclairage rétrodiffusé de la perle à travers l’objectif. Collecter les images de billes et une fréquence d’échantillonnage de 100 hertz, par une caméra à dispositif couplé de changement.

Pour la formation d’attache, versez doucement 200 billes paramagnétiques M280 diluées dans une solution telle que définie dans un canal. Incuber le mélange pendant 10 minutes pour permettre aux billes de se lier aux molécules d’ADN marquées à la biotine immobilisées sur la surface codée par le biais de l’ent marqué au thiol. Lavez doucement les billes non attachées à l’aide de 200 microlitres de solution de réaction standard.

Ensuite, montez le canal sur la platine du microscope. Recherchez les billes sur la surface inférieure à l’aide de l’objectif d’immersion dans l’huile 100 fois. Sélectionnez une perle de référence sur la surface et une perle attachée mobile.

Construisez les bibliothèques d’images initiales, à la fois de la perle de référence et de la perle captée et des différentes plaines défocalisées. Avant les expériences, utilisez un actionneur piézoélectrique objectif pour obtenir des images de billes de référence et attachées à différentes plaines défocalisées, espacées de 20 à 50 nanomètres. Stockez les images sous la forme de deux bibliothèques d’images de perles distinctes qui sont respectivement indexées avec la distance de flou.

Au cours des expériences, déterminez la position de la perle dans la plaine XY, par le centroïde de la perle. Déterminez également le changement de hauteur de la perle attachée en comparant l’image actuelle de la perle avec celles stockées dans la bibliothèque. Utilisez l’analyse de la fonction d’autocorrélation du spectre de puissance de la transformée de Fourier des images de billes.

Lors d’expériences, utilisez le Pizeo pour verrouiller la distance entre l’objectif dans une image de perle de référence spécifique stockée dans la bibliothèque grâce à un contrôle de rétroaction basse fréquence, afin que l’image de la bille coincée ait la meilleure corrélation avec l’image spécifique stockée dans la bibliothèque. Déterminez si le câble est une molécule d’ADN simple brin double brin, en appliquant une force d’environ 65 piconewtons. Une attache est une molécule d’ADN simple double brin si elle subit la transition caractéristique de surétirement de l’ADN.

Répétez le processus jusqu’à ce qu’un seul câble d’ADN double brin soit trouvé. La relation entre la force et la position de l’aimant, ou ce qu’on appelle la courbe de distance-force, a été calibrée en fonction de la fluctuation du talon. De plus, la transition d’étirement excessif de l’ADN double brin qui s’est produite près de 65 piconewtons, pourrait également être utilisée pour calibrer la force.

Pour les expériences de rampe de force, effectuez un balayage d’augmentation de force à un taux de charge de 0,2 piconewton par seconde, suivi d’un balayage de diminution de force à moins 0,2 piconewtons par seconde. Après chaque cycle d’étirement, maintenez la molécule d’ADN à un piconewton pendant 30 secondes, pour permettre à l’ADN simple brin de se replier en G4. Pour les expériences de saut de force, faites varier la force entre 54 piconewtons pendant 30 secondes, sous lesquels un G4 plié peut être déplié, et 1 piconewton pendant 60 secondes permettant à un G4-15T plié de se replier. Enfin, analysez la force de dépliage à l’aide d’un programme de laboratoire de tapis écrit en interne.

Voici un exemple typique d’une courbe d’augmentation et de diminution de la force d’un quadriplexe G4 captif. Le saut d’extension dans le balayage d’augmentation de force indiquait une transition en cours de G4, à environ 52 piconewtons. Cependant, en présence de RHAU, G4 est resté plié pendant le balayage d’augmentation de force jusqu’à 60 piconewtons, indiquant une stabilisation de la force G4 par liaison RHAU.

En présence de RHAU et d’ATP, la distribution de la force de déploiement de G4 a été déplacée vers une force plus faible, indiquant une déstabilisation de G4 dépendante de l’ATP par RHAU. Des traces représentatives de la hauteur de la perle pendant les cycles de saut de force montrent que la force appliquée à la molécule a été cyclée entre 54 piconewtons pendant 30 secondes, sous lesquels un G4 plié pouvait être déplié, et 1 piconewton pendant 60 secondes, sous lequel il pouvait se replier. La durée de vie moyenne d’un G4 plié à 54 piconewtons était d’environ 6,4 secondes, estimée en ajustant l’histogramme de durée de vie avec une fonction de décroissance exponentielle.

Lorsque l’hélicase RHAU a été introduite, l’extension de l’ADN attaché est restée au niveau replié tout au long du temps de maintien de 30 secondes à 54 piconewtons, ce qui indique que l’UARH stabilise fortement G4 contre le dépliage mécanique. Lors de l’ajout de RHAU et d’ATP, l’extension était au niveau de l’ADN simple brin déplié, indiquant une déstabilisation de G4. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la dynamique de dépliage et de repliement des jonctions nucléaires ACS à l’aide de cette pince à épiler magnétique ultra stable. L’attribution de cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la structure des acides nucléiques et des protéines de liaison pour explorer la régression de la stabilité de la structure et la cinétique de repliement, ainsi que l’interaction des acides nucléiques et des protéines de liaison.