Nanopatterns inégale dendrimère-basé à localement gouvernes adhésivité : une méthode pour diriger la différenciation chondrogéniques

L’objectif global de ce protocole est d’obtenir des nanomotifs inégaux à grande échelle basés sur des dendrimères qui permettent le contrôle à l’échelle nanométrique de l’adhérence de surface locale. La méthode décrite est appliquée à l’étude de l’adhésion cellulaire et de la différenciation chondrogénique. Les nanomotifs en relief du dendrimère permettent de contrôler localement l’adhérence de surface à l’échelle nanométrique.

Des polynanomères de première génération modifiés avec le peptide RGD adhésif cellulaire sont utilisés pour créer des nanomotifs. Ils sont caractérisés par des techniques de balayage par microscopie et utilisés dans les études d’adhésion et de différenciation cellulaires. Nous analysons ensuite les résultats des techniques de microscopie et d’immunomarquage.

La première étape consiste à préparer les supports de travail. Les lames de verre carrées personnalisées sont produites en découpant des lames de microscopie à l’aide d’un coupe-diamant à pointe. Faites des diapositives de 1,25 par 1,25 centimètres.

Lavez les lames avec de l’eau déminéralisée, puis de l’éthanol à 96 % et laissez-les sécher à l’air. Préparez la solution de PLLA à 2 % en ajoutant 200 milligrammes de PLLA dans un tube de force et ajoutez 10 millilitres de dioxane. Ajoutez un agitateur et fermez bien le tube.

Réchauffez le mélange dans un bain de glycérine à 60 degrés centigrades pendant 24 heures en remuant doucement. Placez les lames de verre dans un flacon en verre contenant la solution de PLLA sur une plaque propre et chaude à 60 degrés centigrades. Attendez au moins 10 minutes pour atteindre la température nécessaire.

Appliquez la solution PLLA sur les substrats de verre par centrifugation en plaçant la lame de verre sur l’étage de spin coater et en exécutant le programme sélectionné. Nous sélectionnons 3 000 tr/min pendant 30 secondes avec une accélération de 1 500 tr/min par seconde avec un pré-pas de 500 tr/min à cinq secondes à 300 tr/min par seconde pour assurer un revêtement homogène. Les verres à revêtement rotatif peuvent être conservés au réfrigérateur.

Préparez et sonisez pendant 10 minutes la solution A, une solution de 0,77 milligramme par millilitre de dendrimère RGD-Cys-D1 dans de l’eau désionisée. Préparez ensuite des solutions de dendrimères de 10 à 2 % et de 10 à 5 % respectivement dans des solutions B et C dans de l’eau désionisée. Sonicate la solution C pendant 10 minutes et préparer les solutions de dendrimères suivantes, D, E et F également dans de l’eau désionisée.

Solution D, 2,5 x 10 à 8 %solution E, 10 à 8 % et solution F, 4 à 10 à 9 %Conservez ces solutions au réfrigérateur jusqu’à utilisation. Vous passez avec une lampe UV de la cabine de culture cellulaire 18 verres enduits de PLLA pendant 13 minutes pour les rendre stériles. Sonicez chacune des solutions de dendrimères pendant 10 minutes.

Filtrez les solutions de dendrimères à travers des filtres de 0,22 micromètre de diamètre sur les lames de verre revêtues de PLLA dans une plaque à 12 puits sous le flux laminaire de la cabine de culture cellulaire. Laissez-les à l’intérieur de la cabine à température ambiante pendant 16 heures et lavez-les avec de l’eau stérile et déminéralisée. Pour les échantillons de contrôle positif, préparez une solution stérile de fibronectine dans du PBS et incubez les répliques avec la solution pendant une heure à température ambiante dans la cabine de culture cellulaire.

Lavez-les avec du PBS. Les trois substrats restants revêtus de PLLA serviront de répliques pour le contrôle négatif. La topographie des nanomotifs est analysée avec l’AFM fonctionnant en mode de tapotement dans l’air.

Montez un porte-à-faux en silicone avec une constante de ressort de 40 newtons par mètre et une fréquence de résonance de 300 kilohertz dans le support d’embout AFM. Avec le substrat de nanomotif sur la platine AFM, approchez-vous de la surface jusqu’au contact et choisissez un point de consigne d’amplitude qui permet d’imager la configuration du dendrimère sans exercer de pression excessive sur la surface. Enregistrez au moins trois images représentatives de 5x5 micromètres par substrat de trois substrats indépendants par condition.

Traitez les images acquises avec le logiciel de traitement AFM. Sélectionnez les dendrimères sur les images de hauteur AFM traitées et obtenez les seuils d’image correspondants. Obtenez les précisions des particules et utilisez-les pour obtenir les distances minimales entre les particules.

Soit les distances minimales entre les particules en Z aux précisions de particules correspondantes pour obtenir les bouchons de contrôle de probabilité pour les distances minimales entre les particules. Ajustez l’échelle de couleurs du graphique pour visualiser les régions où la densité de surface RGD locale est inférieure à 70 nanomètres. Quantifiez la surface de ces régions en les sélectionnant sur l’image et en générant un seuil.

Utilisez du tissu adipeux humain commercial dérivé de cellules souches mésenchymateuses provenant de passages précoces, de préférence en dessous de cinq. Cultivez-les à 37 degrés et 4,6 % d’atmosphère de CO2 dans le milieu de croissance des cellules souches jusqu’à ce que la confluence soit atteinte à 70 ou 80 %. Ensemencez les cellules à une densité cellulaire de 3 000 cellules par centimètre carré sur les substrats dans un milieu induisant la chondrogenèse.

Changez de support tous les trois jours. L’étape de condensation peut être observée dès le premier jour en culture, et son évolution peut être suivie par un microscope optique à contraste de phase pendant tous les laboratoires de culture. Fixez les cellules avec une solution de formol à 10 % à température ambiante pendant 20 minutes, puis lavez-les avec du PBS.

Verrouillez les groupes furaldéhyde en ajoutant une solution de 50 millimolaires de chlorure d’ammonium dans du PBS. Laisser reposer 20 minutes à température ambiante. Laver avec du PBS.

Perméabiliser les cellules avec une solution à 0,1 % de saponine dans la solution bloquante de 1 % d’albumine dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante. Incuber avec des anticorps primaires dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante. Laver avec du PBS.

Incuber avec des anticorps secondaires dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante, en évitant l’exposition à la lumière. Laver avec du PBS et sécher. Appliquez un support de microscopie sur les échantillons et recouvrez-les délicatement avec des lamelles.

Imagez les échantillons immunocolorés pour la protéine d’adhésion focale paxilline après un jour d’induction chondrogénique, et pour le marqueur chondrogénique précoce, le collagène II alpha I après cinq jours d’induction chondrogénique à l’aide d’un microscope confocal droit. Collectez des sections à un intervalle représentatif, par exemple 0,5 ou 1 micromètre. Filtrez les images colorées pour la paxilline de la zone basale des condensats cellulaires.

Supprimez l’arrière-plan, lissez et convertissez en fichiers huit bits. Rendez-les binaires en définissant un seuil sélectionné empiriquement. Traiter un minimum de trois condensats de cellules par condition de trois échantillons indépendants.

Quantifiez les zones sélectionnées et exprimez-les en pourcentage correspondant de la surface divisé par le nombre de noyaux cellulaires dans l’image. Pour quantifier la coloration du collagène II alpha I, créez des projections confocales Z. Filtrez les images résultantes, supprimez l’arrière-plan, lissez et définissez un seuil.

Quantifiez la somme de la surface projetée du collagène maximal II alpha I par échantillon par rapport à la surface du condensat cellulaire correspondant. Différentes configurations de nanomotifs peuvent être obtenues en modifiant la concentration initiale du dendrimère en solution. Les nanomotifs peuvent être visualisés par l’analyse AFM et les tracés de contour de probabilité pour la distance minimale entre les particules construite.

Ils mettent en évidence les régions de la surface avec la plus forte densité de surface RGD locale. Les nanomotifs de dendrimères sont utilisés dans les études d’adhésion cellulaire. L’adhérence augmente avec la densité de surface locale du RGD.

Pour le témoin positif et les surfaces contenant des agrégats de dendrimères, cette corrélation est perdue. L’influence de la densité de surface locale des RGD a été testée dans la chondrogenèse, la condensation et la différenciation cellulaires sont favorisées par des nanomotifs présentant une adhérence intermédiaire. En conclusion, nanomotif à base de dendrimères dans une méthode à trois tables pour aborder l’effet de la densité locale de RGD sur la réponse cellulaire.

Les nanomotifs maintiennent plus efficacement l’adhésion cellulaire à la surface homogène correspondante couramment utilisée dans la culture cellulaire. Dans les expériences de différenciation, l’adhérence intermédiaire des cellules au substrat a favorisé la condensation des cellules mésenchymateuses et la différenciation chrondogénique précoce. En raison de la modification facile de la croissance périphérique du dendrimère, la méthode décrite ici peut être étendue à toutes les couches rhumatismales excessives ayant des effets de densité sur les cellules.