En temps réel Quaking induite par le test de Conversion pour détection de CWD Prions dans les matières fécales

L’objectif global de ce protocole pour l’essai de conversion induite par le tremblement en temps réel est de permettre une détection sensible des prions de la maladie débilitante chronique dans les échantillons de matières fécales de cervidés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur l’encéphalopathie des cervidés, comme quand les prions de cervidés infectés dans les matières fécales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est spécifique, sensible et qu’elle permet un débit élevé d’échantillons.

La démonstration de la procédure sera faite par Ginny Cheng, une technicienne de laboratoire de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, ajoutez un gramme de matières fécales dans un tube contenant 10 millilitres de tampon d’extraction de matières fécales. À l’aide d’un dissociateur avec un programme prédéfini pour les protéines, homogénéisez les boulettes fécales pendant une minute à température ambiante.

Répétez cette opération deux à trois fois jusqu’à ce que les échantillons fécaux soient complètement homogénéisés. Ensuite, utilisez du parafilm pour sceller les tubes et placez-les sur une plate-forme à bascule ou un agitateur rotatif pour une incubation d’une heure à température ambiante. Après cela, centrifugez à 18 000 g pendant cinq minutes à température ambiante.

Collectez les surnageants et aliquotez-les dans des tubes de 1,5 millilitre. Conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’au moment de l’utiliser. Pour commencer la méthode de précipitation de l’acide phosphotungstique de sodium, ajoutez 250 microlitres de sarkosyl à un millilitre d’extrait de protéines fécales.

À l’aide d’un parafilm, scellez le tube. Placez le tube dans un mélangeur thermique et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en secouant constamment à 1 400 tr/min. Après cela, ajoutez une solution mère contenant 10 % d’acide phosphotungstique de sodium et 170 millimolaires de chlorure de magnésium de sorte que la concentration finale d’acide phosphotungstique de sodium dans les échantillons soit de 3 %Transférez les échantillons dans le mélangeur thermique et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux heures en agitant constamment à 400 tr/min.

Ensuite, centrifugez à 15 800 g pendant 30 minutes à 14 degrés Celsius. Retirez soigneusement les surnageants et lavez les granulés en les remettant en suspension dans le tampon de lavage. Puis centrifuger à 15, 800 g pendant 15 minutes à 14 degrés Celsius.

Retirez soigneusement les surnageants et remettez les granulés en suspension dans 100 microlitres de tampon de dilution RT-QuIC. Conservez les échantillons traités à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à effectuer le test RT-QuIC. Pour commencer, ajoutez 0,032 gramme de Thioflavin T à 10 millilitres d’eau distillée deux fois pour préparer une solution mère fraîche de 10 millimolaires de Thioflavin T.

Ensuite, utilisez de l’eau distillée deux fois pour effectuer une dilution de un à 10 de la solution mère, ce qui donne une concentration finale d’un millimolaire de Thioflavin T. À l’aide d’une seringue équipée d’un filtre à disque Acro de 0,2 micromètre, filtrez la solution de Thioflavin T d’un millimolaire. Décongelez ensuite le substrat de protéine prion le plus recombinant. Chargez 500 microlitres de substrat de protéine prion recombinante à la fois dans des microtubes de filtre d’exclusion de taille Dalton de 100 kilos.

Centrifuger à 14 000 g pendant cinq minutes à température ambiante. Après cela, transférez le substrat élué dans un tube stérile de 1,5 millilitre. Conserver à quatre degrés Celsius jusqu’au moment de l’utiliser.

Ensuite, décongelez le tampon de dilution RT-QuIC stocké. Diluez la graine et préparez les solutions mères et le mélange réactionnel RT-QuIC comme indiqué dans le protocole de texte. À l’aide d’une pipette munie d’un filtre, mélangez le mélange réactionnel en le pipetant de haut en bas.

Versez le mélange dans un réservoir de pipetage de 50 millilitres. À l’aide d’une pipette multicanaux, chargez 98 microlitres de mélange réactionnel RT-QuIC dans chaque puits d’une plaque inférieure optique à 96 puits. À chaque réaction, ajoutez deux microlitres d’extrait de protéines fécales non dilué ou 10 fois dilué en série.

Utilisez ensuite du ruban d’étanchéité pour sceller la plaque. Incuber dans un lecteur de plaques à 42 degrés Celsius pendant 25 heures avec des cycles répétés d’une minute de double agitation orbitale à 700 tr/min et d’une minute de repos tout au long de l’incubation. Pendant ce temps, définissez les paramètres de mesure de fluorescence comme indiqué dans le protocole texte.

Après 25 heures, retirez la plaque du lecteur de plaques. Faites tourner la plaque à 3 000 g pendant trois minutes pour éviter une contamination potentielle entre les puits. Ensuite, retirez le joint de la plaque.

Préparez une nouvelle plaque en ajoutant 90 microlitres de mélange réactionnel RT-QuIC contenant du substrat frais et un colorant de fluorescence Thioflavin T frais. Transférez 10 microlitres de chaque puits de la première plaque vers la plaque de 96 puits nouvellement préparée. Utilisez du ruban d’étanchéité pour sceller la nouvelle plaque.

Après avoir défini les paramètres de mesure de fluorescence, poursuivez le test pendant 50 heures supplémentaires. Lire et documenter le signal de fluorescence de la thioflavine T pour chaque puits toutes les 15 minutes. Ensuite, collectez et tracez les données comme indiqué dans le protocole texte.

Dans cette étude, des matières fécales de wapitis ou de cerfs mulets non infectés sont homogénéisées dans un tampon d’extraction de matières fécales pour obtenir une concentration finale de l’échantillon de 10 %. Bien qu’une réduction des conversions spontanées soit observée dans les échantillons purifiés, tous les échantillons ont montré de faibles signaux de fluorescence dans les échantillons fécaux positifs à la MDC. Pour améliorer l’amplification des prions et augmenter la sensibilité de la détection, une étape de remplacement du substrat est incorporée.

Les échantillons qui ont subi un remplacement de substrat dans le cadre du protocole RT-QuIC montrent une augmentation de la sensibilité et de la spécificité de la détection, 14 des 18 échantillons étant positifs et aucun des témoins négatifs n’enregistrant de faux positifs. Une fois maîtrisés, la préparation de l’extrait fécal et la concentration de PRP/SCRP peuvent être effectuées en quatre heures environ et le test RT-QuIC peut être mis en place en environ 1/1 à 2 heures s’il est effectué correctement. Lors de la tentative de la procédure, il est important de ne pas oublier de filtrer le substrat mais de ne jamais le vortex.

Après la procédure, d’autres méthodes telles que le western blot peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la résistance des protéases aux produits résultants. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux scientifiques du domaine de la recherche sur les prions pour explorer la présence de prions dans des animaux vivants en testant des échantillons de matières fécales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer et de concentrer le PRP/SCRP à partir d’extraits fécaux et de la façon d’effectuer un test RT-QuIC modifié pour obtenir une détection sensible et spécifique des prions.

N’oubliez pas que travailler avec des prions peut être extrêmement dangereux et qu’il est important de porter des EPI appropriés et de travailler sous une enceinte de biosécurité pendant l’exécution de la procédure.