Name: Purification de l’ADN Viral pour l’Identification des protéines virus et cellulaires associées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Découvrez la purification de l'ADN du virus Herpes Simplex de type 1 à partir de cellules infectées pour l'analyse protéomique des protéines associées au génome viral. Cette méthode révèle le rôle des facteurs cellulaires dans l'infection.

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Nous reconnaissons Hannah Fox pour aider à la préparation de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le NIH grant R01AI030612.

1. Culture cellulaire, Infection virale et EdC Labeling ( Figure 1) le protocole suivant implique l’utilisation de virus. Veuillez vous référer à votre établissement &#39; protocoles de biosécurité s concernant la manipulation sécuritaire des virus et autres agents biologiques. Ce protocole a été approuvé par la Commission de révision institutionnelle de l’Université de Pittsburgh.
<ol><li>Trypsinize une fiole de vitroplants confluentes 150 cm 2 de MRC-5 cellules et les cellules de transfert à une plaque de culture de tissu de 2 600 cm contenant 100 mL DMEM majoré de 10 % FBS. Incuber à 37 ° C en présence de 5 % de CO 2 pendant 3-4 jours atteindre la phase stationnaire et confluency. Un plat de 2 cm 600 confluentes contient environ 7 x 10 7 cellules. Préparer 1 assiette pour chaque condition et 1 assiette pour chaque contrôle négatif correspondant. 
	Remarque : Les cellules doivent parvenir à la phase stationnaire pour inhiber la réplication de l’ADN cellulaire pour s’assurer que seul vDNA est étiqueté et purifié dans les étapes suivantes. 
	Remarque : Chaque échantillon nécessite un gratuit non témoin négatif établi en utilisant les mêmes conditions d’infection et le point dans le temps sans l’ajout de l’ECD. 
	NOTE : A revus à la baisse la version de cette expérience devrait se faire en tandem pour tester pour l’étiquetage de l’ADN cellulaire par imagerie à l’aide de la croissance des cellules comparables, infection, EdC, des conditions d’étiquetage et de points de temps (voir étape 2).</li>
	<li>Diluer 7 x 10 8 PFU HSV-1 à 7 mL froide Solution Saline (SCT). Retirez le milieu de croissance et à 37 ° C. Pour infecter, ajouter le virus dilué de 7 mL cellules MRC-5 et le rock pendant 1 h à température ambiante. Après adsorption, retirer inoculum, rincer avec la température de la pièce 50 mL du SCT et remplacer le milieu de croissance initiale. Incuber à 37 ° C en présence de 5 % de CO 2. Cette étape devrait être effectuée pour chaque condition expérimentale et un témoin négatif. 
	NOTE : Étiquetage d’EdC accrue peut être réalisé à l’aide de HSV-1 mutants déficients pour l’expression de la dUTPase virale (gène UL50) et/ou l’uracile glycosylase (gène AMT2). HSV-1 dUTPase a une spécificité de substrat faible et permet de réduire l’activation de plusieurs nucléosides analogues 25 , 27.</li>
	<li>Des génomes viraux étiquette avec EdC. Suivre les indications pour étiqueter des génomes entrants (1.3.1.), reproduisant les génomes (1.3.2.), ou les fourches de réplication virale (1.3.3.). 
	NOTE : Seule étape 1.3.1 et 1.3.2 1.3.3 doit être effectué selon que les génomes entrants, génomes répliqués ou fourches de réplication sont à analyser dans les étapes suivantes, respectivement. 
	NOTE : EdU ou EdU f-ara peut être substitué pour EdC. La toxicité d’analogues nucléosidiques doit être surveillée et réduit au minimum.
	<ol><li>Utilisation prémarquées des actions à mener à l’infection à l’étape 1.2 et passez à l’étape 2 ou 3 moins de 4 h après l’infection (hpi) pour enquêter sur les vDNA non répliquée ( Figure 1 a). 
		NOTE : Préparer des virus pré-étiquetée stocks en utilisant le protocole décrit précédemment 25. Les stocks de virus doivent être passés à travers une colonne G-25 pour enlever tout résidu EdC.</li>
		<li>Label vDNA reproduisant en ajoutant 5 à 25 µM EdC au milieu de culture cellulaire des cellules infectées pendant 2-4 h ( Figure 1 b). Avant d’ajouter, diluer 1 mL de milieu de croissance EdC.</li>
		<li>D’étiqueter les fourches de réplication virale, après le début de la réplication de vDNA (&#8805; 4 hpi), étiquette impulsion reproduisant vDNA avec 5 à 25 µM EdC pour 5 à 20 min. Pour chasser, rincer 3 x milieu de chasse contenant 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC) et puis incuber en présence du milieu de la chasse pour une supplémentaire de 20 à 40 min ( Figure 1). 
		NOTE : Moyenne de pouls et chase doit être équilibré à 37 ° C et 5 % de CO 2 avant utilisation. 
		Remarque : Pour des expériences de pouls de chase, il est important de tenir compte de la quantité de temps qu’il faut pour les nucléosides entrer dans la cellule et être phosphorylé avant qu’ils peuvent être incorporés dans la réplication de l’ADN. Cela doit être déterminé empiriquement. 
		Remarque : Pour déterminer la résolution d’expériences de pulse chase, calculer le taux de réplication virale dans les conditions expérimentales utilisées. Ceci peut être déterminé par PCR quantitative des génomes viraux durant une seule étape croissance temps cours 26. 
		Remarque : Pour l’imagerie des génomes viraux passez à l’étape 2 et pour la purification des génomes viraux, passez à l’étape 3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Imagerie de l’ECD étiquetée ADN ( Figure 2 a) Remarque : il est utile d’effectuer l’imagerie en tandem avec la méthode de purification du génome viral pour vérifier que l’ADN cellulaire n’est pas étiquetée dans les expériences. L’imagerie permet également de visualiser la nature des vDNA marqué et valider les données de la protéomique. Exemples de patrons de coloration de l’ADN viraux et cellulaire sont indiquées à la Figure 3.
<ol><li>Mener à des infections et EdC étiquetage comme indiqué à l’étape 1, sauf en utilisant revus à la baisse les conditions sur les lamelles dans un plat de culture de tissu de 12 puits contenant 1 mL de milieu de croissance.</li>
	Paraformaldéhyde <li>fix cellules avec 3,7 % de 1 mL dans du PBS 1 x pendant 15 min à température ambiante. Après fixation, rincer les cellules 2 x avec BSA 3 % 1 mL dans du PBS. 
	ATTENTION : Paraformaldéhyde peut causer des blessures graves ou permanentes. Suivez les consignes de sécurité. 
	Remarque : Le protocole peut être suspendu ici et lamelles peuvent être stockés à 4 ° C au cours du deuxième lavage jusqu'à 3 jours.</li>
	<li>Permeabilize des cellules avec 1 mL de tampon de perméabilisation [Voir la Table des matières] pendant 20 min à température ambiante tout en berçant.</li>
	<li>Rincer avec 1 mL de 3 % de BSA, puis bloc avec BSA 3 % 1 mL dans du PBS pendant 30 min à température ambiante tout en berçant.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de la réaction de clic cocktail [Voir la Table des matières] à lamelles de façon covalente conjugué Alexa Fluor 488 azoture d’EdC étiquetée ADN. Incuber à température ambiante pendant 30 min, tout bascule. Aspirer et rincer deux fois avec 1 mL de PBS.</li>
	<li>Tache ADN cellulaire avec 1 mL d’une dilution de 1:2,000 de Hoechst en PBS pendant 30 min à température ambiante tout en bascule. Aspirer et rincer deux fois avec 1 mL de PBS.</li>
	Immunofluorescence indirecte <li>tache avec des anticorps primaires et secondaires selon norme protocoles 25. 
	Remarque : VDNA étiqueté putative avec ICP8, ICP4 ou UL42 et étiqueté cellulaire ADN putative avec Hoechst tache.</li>
	<li>Monter sur glissières lamelles couvre-objet et image des cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence. 
	Remarque : Diapositives peuvent être stockés à 4 ° C pendant plusieurs semaines.</li>
</ol> 3. Purification des vDNA et des protéines associées aux Remarque : plusieurs aspects de ce protocole ont été adaptées de Leung et al. 22 Remarque : tous les tampons et les réactifs doivent être réfrigérés sur la glace avant utilisation et toutes les mesures devraient être menées sur glace sauf indication contraire.
<ol><li>Récolter noyaux. 
	NOTE : Avant l’isolement des noyaux, formaldéhyde peut servir aux protéines de réticulation à l’ADN. Des conditions plus strictes de lavage permet ensuite au cours de la purification de l’ADN sur des billes de streptavidine. Pour crconditions osslinking et lavage voir Sirbu et al. 21. <ol><li>remplacer le milieu de culture avec 20 mL de tampon d’Extraction de noyaux (NEB) et incuber pendant 20 min à 4 ° C, avec parfois de la bascule. Noyaux deviendra visibles au microscope.</li>
		<li>Gratter des noyaux de la plaque à l’aide d’un grattoir de cellules et transvaser dans un tube conique de 50 mL. Centrifugation pendant 10 min à 2 500 g à 4 ° C à noyaux de granule, éliminer le surnageant. 
		NOTE : Trypan coloration bleue peut être utilisée pour vérifier l’isolement des noyaux des cellules.</li>
		<li>Délicatement déloger le culot nucléaire dans 10 mL de PBS, transférez dans un tube conique de 15 mL et pellet par centrifugation pendant 10 min à 2 500 x g à 4 ° C. Completely remove PBS. 
		Remarque : Les noyaux peuvent être congelés et le protocole peut être suspendu à ce stade. Pour ce faire, doucement Resuspendre le culot nucléaire dans 500 µL de congélation mettre en mémoire tampon et incuber le tube dans un bain de glace d’éthanol/sec. Stocker des noyaux congelés à-80 ° C. Avant utilisation, décongeler à température ambiante, les noyaux, transférer rapidement vers la glace, ajouter 10 mL de PBS, roche doucement pour mélanger, pellet par centrifugation pendant 10 min à 2 500 g à 4 ° C et de supprimer complètement les PBS. Noyaux de congélation peut entraîner des rendements réduits.</li>
	</ol></li> <li>Par covalence conjugué Biotine-azide à EdC étiqueté vDNA.
	<ol><li>Remettre le culot nucléaire en réaction clic 10 mL mélanger [Voir la Table des matières] par pipetage doucement monter et descendre 5 fois avec une pipette de 10 mL. 
		Remarque : Il est important que les réactifs inclus dans le mélange réactionnel clic sont ajoutés dans l’ordre indiqué.</li>
		<li>Tourner pendant 1h à 4 ° C. Pendant la rotation de préparer et refroidissez les tampons B1, B2 et B3 [Voir la Table des matières].</li>
		<li>Pellet noyaux par centrifugation pendant 10 min à 2 500 x g à 4 ° C. complètement supprimer cliquez sur mélange réactionnel et laver le culot par doucement resuspendant dans 10 mL de PBS et centrifugation pendant 10 min à 2 500 x g à 4 ° C.</li>
		<li>Resuspendre doucement le nucléaire culot dans 1 mL de PBS et le transfert d’un tube de microtubes de 1,5 mL à l’aide d’une pointe de pipette grosse perce. Noyaux de granule par centrifugation pendant 10 min à 2 500 x g à 4 ° C. Completely remove PBS et flash congélation dans l’azote liquide. 
		Remarque : Le protocole peut être suspendu à ce stade et noyaux congelés peuvent être conservés à-80 ° C. gel dégel contribue à la lyse ultérieure il est donc recommandé que les noyaux être flash gelés même quand procéder à l’étape 3.3 le même jour.</li>
	</ol></li> <li>Lyse des noyaux et de fragments d’ADN.
	<ol><li>Décongeler noyaux sur la glace et remettre en suspension dans 500 µL tampon B1 par pipetage de haut en bas. Incuber sur glace pour 45 min.</li>
		<li>Un échantillons 6 fois pendant 30 s chaque à amplitude de 40 % à l’aide d’une sonde de microtip 3 mm. Placer les échantillons sur la glace pendant 30 s entre les impulsions. Après la sonication, échantillons devraient être clair, pas nuageux. 
		NOTE : Conditions de Sonication doivent être optimisées pour chaque sonicateurs. Pour obtenir des instructions détaillées sur la façon d’optimiser les conditions de la sonication voir Leung et al. 22.</li> <li>-pellet débris cellulaires par centrifugation à 14 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. La taille de granule devrait diminuer de manière importante. Filtrer le liquide surnageant à travers des tamis de cellule 100 µM et de conserver le débit par.</li>
		<li>Ajouter 500 µL tampon B2 pour le surnageant filtrée. 900 µL de cet exemple seront utilisés à l’étape 3.4.2.</li>
		<li>, Prélever une partie aliquote de chaque condition d’isolement d’ADN (50 µL ou volume 1/20ème) et ajouter 50 µL 2 x solution SDS-bicarb [Voir la Table des matières]. Procéder au protocole d’isolement de l’ADN (étape 3.6).</li>
		<li>Prélever une partie aliquote de chaque condition d’entrée protéine (50 µL ou volume 1/20ème) et ajouter 50 µL 2 x solution tampon de Laemmli, congélation dans l’azote liquide et stocker à -80 ° C. utiliser à l’étape 3.5.6.</li>
	</ol></li> <li>Billes recouvertes de bind biotinylé ADN de streptavidine.
	<ol><li>Préparer la Streptavidine T1 billes magnétiques en transférant 300 µL de lisier de perle à un tube de microtubes de 1,5 mL. Préparer un tube de perles par exemple. Perles de lavage 3 x avec 1 mL de tampon B2 par vortex pour remettre en suspension, en appliquant un aimant pour séparer les billes et aspirer le tampon de lavage. 
		NOTE : Optimisé liant le résultat de conditions en rendement maximisé et liaison fond minimal. Il a été déterminé expérimentalement que Streptavidin T1 billes magnétiques ont une capacité de liaison significativement plus élevée que d’agarose perles, mais aussi d’autres perles de streptavidine et moins de fond lie de streptavidine C1 perles ( Figure 4 a ).</li>
		<li>Ajouter 900 µL de l’échantillon de l’étape 3.3.4. aux talons lavées et tourner la nuit à 4 ° C. 
		Remarque : Ne pas les perles de vortex, une fois que l’échantillon est ajouté à leur. 
		Remarque : Si des quantités importantes de l’ADN ou des protéines sont isolées dans le contrôle négatif sans étiquette, cette étape peut être réduite de nuit à 4 h afin de réduire la liaison fond.</li>
	</ol></li> <li>Laver les perles et éluer vDNA et des protéines associées. 
	Remarque : Il est recommandé d’utiliser des embouts de filtration pour les étapes restantes.
	<ol><li>Échantillons de Place dans un portoir magnétique microtubes, enlever le surnageant, resuspendre doucement dans 1 mL de tampon B2, tournent à 4 ° C pendant 5 min.</li>
		<li>Répéter l’étape 3.5.1 triple.</li>
		<li>Placer les échantillons dans un portoir magnétique microtubes, éliminer le surnageant, resuspendre dans 1 mL de tampon B3, doucement et tourner à 4 ° C pendant 5 min.</li>
		<li>Transférer 100 µL de billes mélange (1/10 ème volume) dans un nouveau tube pour l’isolement d’ADN lié. Appliquer ce tube à l’aimant, éliminer le surnageant, remettre les billes en suspension dans 100 µL 1 x solution SDS-bicarb et procéder au protocole d’isolement de l’ADN (étape 3.6).</li>
		<li>Appliquer le tube contenant le reste du mélange 900 µL perle de l’étape 3.5.3. à l’aimant, éliminer le surnageant et remettre les billes en suspension dans 50 µL 2 x Laemmli solution tampon pour éluer les protéines et complexes ADN-protéine.</li>
		<li>Échantillons de bouillir à 95 ° C pendant 15 min, vortex, rapidement spin dans des microtubes et appliquer l’aimant. Transférer l’éluat dans un nouveau tube, congélation flash et conserver à -80 ° C. 
		Remarque : Serrures cap emploi pour s’assurer que les tubes ne pop pas ouvrir tout en ébullition. 
		Remarque : Le protocole peut être suspendu à ce stade et les échantillons peuvent être conservés à-80 ° C pendant plusieurs semaines.</li>
		<li>Analyser des échantillons de protéine par le bleu de Coomassie coloration, éponger occidental ou spectrométrie de masse par des procédures standard 25. Résultats représentatifs sont présentés dans la Figure 4 et Figure 5. 
		Remarque : Pour déterminer si le rendement de protéine est suffisante pour la spectrométrie de masse, 7,5 µL de chaque échantillon est utilisé pour l’analyse par coloration au bleu de Coomassie et 7,5 µL pour éponger occidental d’un génome viral représentant associé la protéine (ICP4, ICP8 ou UL42). Le même volume de lysats de l’étape 3.3.6. sont exécutés aux côtés de contrôle des niveaux de protéine d’entrée. L’échantillon restant (35 µL) est ensuite analysée par mass spectrometry comme décrit plus haut 25.</li>
	</ol></li> <li>Isolement d’ADN <ol><li>Incuber les échantillons de mesures 3.3.5. et 3.5.4. à 65 ° C pendant 4 à 16 h. Retirer l’échantillon de billes magnétiques, si nécessaire.</li>
		<li>Extraire des échantillons avec alcool de phénol : chloroforme : isoamylique 150 µL (PCI) et transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube.</li>
		<li>Extraire le PCI restant avec 100µl Tris-EDTA (TE) et ajouter la phase aqueuse dans un nouveau tube.</li>
		<li>Extraire des échantillons avec alcool de chloroforme : isoamylique 200 µL (24:1).</li>
		<li>Purifier la phase aqueuse à l’aide de la PCR Purification Kit selon le fabricant &#39; protocole de s. 
		Remarque : L’indicateur de pH tampon PB devient pourpre lorsqu’ajoutés à l’échantillon. Ajouter 10 & #181 ; L 3M de NaOAc pH 5.0 pour diminuer le pH de l’échantillon.</li>
		<li>Concentration d’ADN de déterminer à l’aide d’un fluorimètre. 
		Remarque : Ce protocole entraîne généralement de 100 à 400 ng perle lié aux DNA. Aucun ADN ne devrait être détecté dans l’éluat du contrôle négatif dans lequel EdC n'a pas été ajouté dans l’étape 1.3.</li>
		<li>ADN peut être stocké dans une faible liaison ADN tube à 4 ou - 20 ° C et peut être utilisé pour la PCR en temps réel ou analyse de séquençage à haut débit.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Chiou, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+and+protein-scission+activities+of+ascorbate+in+the+presence+of+copper+ion+and+a+copper-peptide+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex.</a> J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).</li>
<li>Kennedy, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+consequences+of+copper+complexes+used+to+catalyze+bioorthogonal+click+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions.</a> J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).</li>
<li>Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STRING%3A+a+web-server+to+retrieve+and+display+the+repeatedly+occurring+neighbourhood+of+a+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene.</a> Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole comprend plusieurs étapes qui, si ne pas suivi attentivement, peuvent entraîner en rendement de protéine significativement réduite ou une contamination par l’ADN cellulaire. Il est essentiel que cellules stationnaires sont utilisés pour toutes les expériences à faire en sorte que l’ADN cellulaire n'est pas étiqueté et purifié. Ceci peut être confirmé par l’absence de polymérases d’ADN cellulaires dans l’échantillon de protéines car HSV1 n’utilise pas l’ADN polymérase cellulaire pour la synthèse du génome. Pe...

Les virus ont une capacité limitée à remplir les fonctions essentielles et dépendent donc de facteurs de l’hôte pour faciliter les aspects critiques de l’infection, y compris le transport, la réplication, réparation, recombinaison et expression des gènes viraux. Les activités de ces facteurs de l’hôte sont souvent complétées par protéines virale. En outre, virus doivent éviter de détection et brouillage de la réponse cellulaire à l’infection virale. Par conséquent, interactions hôte virus dictent l’issue de l’infection. D’une importance primordiale est de comprendre comment les virus modifient l’environnement cellulaire afin d’adapter la machinerie cellulaire pour faciliter les processus viraux. Particulièrement intéressant est d’identifier quels facteurs et processus, agissent sur les génomes viraux durant tout le cycle infectieux.
Le virus de l’herpès simplex type 1 (HSV-1) est qu'un double stranded DNA virus qui infecte une proportion importante de la population humaine. Dans la première heure de l’infection, le génome viral pénètre dans le noyau, où une cascade ordonnée de l’expression des gènes viraux s’ensuit en coordination avec virale de réplication de l’ADN (vDNA)1. Dans le noyau, génomes sont soumis à régulation épigénétique, subir une réparation et recombinaison et sont emballés dans des capsides, telle que les virions de descendance premiers sont produites au sein de moins de six heures. L’évaluation complète des protéines de génome viral associé tout au long de l’évolution de l’infection jettera les bases pour étudier les détails moléculaires des processus qui agissent sur les génomes viraux et permettent de mieux comprendre quels facteurs viraux et cellulaires participent à divers stades de l’infection.
Les méthodes précédentes pour l’étude des facteurs impliqués dans l’infection virale de l’hôte incluent purification d’affinité des protéines virales pour l’analyse des protéines cellulaires associées2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. ces tests ont joué pour l’identification des facteurs cellulaires impliqués dans les réponses antivirales de l’hôte, mais aussi modification de la chromatine virale, l’expression des gènes, et réparation de l’ADN. Toutefois, il est difficile de vérifier si les interactions dépendent de la liaison avec vDNA, et protéomique seulement permettent de mieux comprendre les interactions qui se produisent en fonction d’un facteur viral spécifique. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) a été utilisée pour identifier où les protéines virus et cellulaires spécifiques se lient à des génomes viraux10,11,12,13,14 , 15 et hybridation in situ fluorescente (FISH) combinée à l’immunocytochimie a permis la visualisation des facteurs cellulaires qui sont colocalisées avec vDNA16,17,18, 19 , 20. ces tests permettent une analyse spatiale et temporelle. Cependant, les limitations incluent la nécessité d’anticorps hautement spécifiques, sensibilité limitée et la nécessité pour le précédent aperçu interactions hôte virus. Nous avons donc mis au point une méthode basée sur iPOND (isolement des protéines sur l’ADN naissante)21 et aniPOND (iPOND native accélérée)22 à étiqueter de manière sélective et purifier vDNA de cellules pour l’identification non biaisée du génome viral infectées protéines associées par spectrométrie de masse. iPOND a joué un rôle déterminant pour l’investigation de la fourche de réplication cellulaire dynamique.
Pour l’épuration sélective des génomes viraux provenant de cellules infectées, reproduisant vDNA est étiqueté avec éthynyl modifiée nucléosides, 5-éthynyl-2´-déoxyuridine (EdU) ou 5-éthynyl-2´-désoxycytidine (EdC) (Figure 1), suivie par liaisons covalentes conjugaison de l’azoture de biotine par clic chimie pour faciliter la purification de la seule étape de génomes viraux et des protéines associées sur streptavidine perles (Figure 2 b). Ce qui est important, les infections sont réalisées dans des cellules fixes qui ne sont pas engagés dans la réplication de l’ADN cellulaire pour permettre un étiquetage spécifique de vDNA. En outre, infection par HSV-1 provoque l’arrêt du cycle cellulaire et inhibe la cellular DNA réplication23,24. Virus peut être prémarquées avant l’infection pour l’analyse des protéines associées aux génomes viraux entrants (Figure 1 a) ou marqués au cours de la réplication de l’ADN pour l’analyse de protéines nouvellement synthétisée vDNA (Figure 1 b) 25. en outre, pulse chase analyse peut être utilisée pour étudier la nature des protéines associées à la réplication virale fourches (Figure 1)26. En outre, éthynyl-modified vDNA peut être conjugué de façon covalente à un fluorophore pour l’exploration spatiale de la dynamique des protéines (Figure 2 et Figure 3). L’imagerie permet la visualisation directe de vDNA et est une approche gratuite pour la validation des interactions protéine-vDNA peut être adapté pour assurer le suivi des génomes viraux tout au long de l’infection. Nous prévoyons que ces approches pourraient être modifiées ultérieurement pour étudier n’importe quel aspect d’infection baculoviraux, y compris le temps de latence et de réactivation et d’étudier d’autres virus à ADN. En outre, marquage avec l’uridine 5-éthynyle (UE) pourrait permettre pour l’analyse des génomes viraux RNA.

<table><tbody><tr><td>Cellules MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>Substitué par 10 % de FBS, 2 mM de L-glutamine, 12 mM&nbsp ; (pour la croissance en flacons) ou 30 mM (pour la croissance en boîte) bicarbinate de sodium</td></tr><tr><td>600 cm2 boîte de culture tissulaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166508</td><td></td></tr><tr><td>Tris Saline tamponnée (TBS), pH 7,4</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine</td></tr><tr><td>HSV-1 Stock</td><td></td><td></td><td>Les stocks avec des titres supérieurs à 1x109 PFU/mL fonctionnent le mieux</td></tr><tr><td>Sephadex G-25&nbsp ; colonne (colonne de dessalage-10)</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxyde (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>5&acute ;-Ethynyl-2&acute ;-deoxycytidine (EdC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T511307</td><td>Dissoudre dans du DMSO pour préparer un stock de 40 mM, aliquote et stocker à -20 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>2&acute ;-désoxycytidine (deoxyC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3897</td><td>Dissoudre dans l’eau pour préparer un stock de 40 mM, aliquote et conserver à -20 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tampon d’extraction nucléaire (NEB)</td><td></td><td></td><td>Préparer frais (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Saccharose, 0,5 % Igepal)</td></tr><tr><td>Racleur à cellules</td><td>Verre Bellco</td><td>7731-22000</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,2 (10x)</td><td></td><td></td><td>1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO<4> (diluer à 1x dans de l’eau stérile avant utilisation)</td></tr><tr><td>Sulfate de cuivre (II) pentahydraté (CuSO4-5H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C489</td><td>Préparer un stock de 100 mM et stocker à 4 &deg ; C jusqu’à 1 mois</td></tr> <tr><td>(+) L-ascorbate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Préparer fraîchement le stock de 100 mM et le stocker sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit utilisé, l’azoture</td></tr><tr><td>de biotine</td><td>Invitrogen</td><td>B10184</td><td>Préparer le stock de 10 mM dans le DMSO, l’aliquote et le conserver à -20 &deg ; C jusqu’à 1 an&nbsp ;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Préparer immédiatement avant utilisation en ajoutant les réactifs dans l’ordre indiqué (10 ml : 8,8 ml 1x PBS, 200 ml 100 mM CuSO4, 25 ml 10 ml d’azoture de biotine, 1 ml 100 ml d’ascorbate de sodium)&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase Roche</td><td></td><td>11697498001</td><td>Dissoudre dans 1 mL d’eau pour préparer 50x stock, peut se conserver à 4 &deg ; C jusqu’à 1 semaine, ou ajouter directement 1 comprimé à 50 mL</td></tr><tr><td>de tampon Tampon</td><td></td><td></td> de congélation <td>Préparez frais (7 mL de glycérol à 100 %, 3 mL de NEB, 200 &mu ; L 50x inhibiteur de protéase)</td></tr><tr><td>Tampon B1</td><td></td><td></td><td>Préparer frais (25 mM de NaCl, 2 mM d’EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 8, 1 % d’Igepal, 1x inhibiteur de protéase)</td></tr><tr><td>Tampon B2</td><td></td><td></td><td>Préparer frais (150 mM de NaCl, 2 mM d’EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 % d’Igepal, 1x inhibiteur de protéase)</td></tr><tr><td>Tampon B3</td><td></td><td></td><td>Préparer frais (150 mM de NaCl, 2 mM d’EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 8, 1x inhibiteur de protéase)</td></tr><tr><td>Vibra Cell Ultra Sonic Processer équipé d’une sonde à micro-pointes de 3 mm</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à cellules</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>260750F</td><td></td></tr><tr>2x Tampon <td></td><td></td><td>d’échantillon Laemmli</td><td>Mélanger 400 mg de SDS, 2 mL de glycérol à 100 %, 1,25 mL de 1 M de Tris (pH 6,8) et 10 mg de bleu de bromophénol dans 8 mL d’eau. Magasin à 4 &deg ; C jusqu’à 6 mois. Avant utilisation, ajoutez 1 M de DTT à une concentration finale de 200 mM.</td></tr><tr><td>Verrouillage du capuchon pour tube de 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9679153</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs</td><td></td><td></td><td></td>western blot standard</tr><tr><td>NOVEX Kit de coloration au bleu colloïdal</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire à 12 puits</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>16 % de paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td>Diluer à 3,7 % dans 1x PBS avant utilisation</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td>Préparer 3 % dans 1x tampon</td></tr> de <tr><td>perméabilisation PBS (0,5 % Triton-X 100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Préparer 0,5 % Triton-X 100 dans 1x PBS</td></tr><tr><td>Cocktail de réaction Click - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit d’imagerie</td><td>Sondes moléculaires</td><td>C10337</td><td>Préparer selon le protocole du fabricant</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>Préparer 10 mg/mL dans l’eau, peut stocker à 4 &deg ; C jusqu’à 1 an</td></tr><tr><td>Anticorps primaire anti-ICP8 de souris</td><td>Abcam</td><td>ab20194</td><td>Utiliser une dilution de 1:200 dans 1x anticorps</td></tr><tr><td>primaire anti-UL42 de souris PBS (2H4)</td><td>Abcam</td><td>ab19311</td><td>Utiliser une dilution de 1:200 dans 1x PBS</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire conjugué anti-souris 594</td> de <td>chèvre Life Technologies</td><td>a11005 Utiliser</td><td>une dilution de 1:500 dans 1x PBS</td></tr><tr><td>Immu-mount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr>2x solution <td></td><td></td><td>SDS-bicarbonate</td><td>2 % SDS, 200 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>Phénol :chloroforme :alcool</td><td></td><td></td> isoamylique <td>Mix 25:24:1 au moins 1 jour avant utilisation, conserver à 4 &deg ; C dans l’obscurité</td></tr><tr><td>chloroforme :alcool</td><td></td><td></td> isoamylique <td>Mélanger 24:1 au moins 1 jour avant utilisation, conserver à température ambiante dans l’obscurité</td></tr><tr><td>10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (diluer à 1x avant utilisation)</td></tr><tr><td>Qiaquick Kit de purification PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>3 M acétate de sodium pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorimètre</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de dosage</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de dosage Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence équipé d’un logiciel</td><td></td><td></td><td></td>d’imagerie</tr><tr><td>Microcentrifugeuse pour tubes</td><td></td><td></td><td></td>de 1,5 mL</tr><tr><td>Centrifugeuse de table pour tubes</td><td></td><td></td><td></td>de 15 et 50 mL</tr><tr><td>Cellule incubateur de</td><td></td><td></td><td></td>culture</tr><tr><td>Armoire</td><td></td><td></td><td></td>de biosécurité</tr><tr><td>Blocs thermiques</td><td></td><td></td><td>65 &deg ; C et 95 &deg ; L</td></tr></tbody></table>

purification de l’adn viral pour l’identification des protéines virus et cellulaires associées

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Le but du présent protocole est d’isoler le virus de l’herpès simplex type 1 (HSV-1) ADN provenant de cellules infectées pour l’identification des associés virale et cellulaires protéines par spectrométrie de masse. Bien que les protéines qui interagissent avec les génomes viraux jouent un rôle important en déterminant les résultats de l’infection, une analyse complète des protéines de génome viral lié n’était pas précédemment possible. Nous démontrons une méthode qui permet la purification directe de HSV-1 génomes de cellules infectées. Réplication de l’ADN viral est sélectivement marquée avec des nucléotides modifiés contenant un groupe fonctionnel d’alcyne. DNA marqué est ensuite plus précisément et de manière irréversible tag via la fixation covalente d’azoture de biotine par l’intermédiaire de cuivre (I)-réaction de cycloaddition ou clic azoture-alcyne catalysée par. Biotine-tag ADN est purifiée sur perles streptavidine et protéines associées sont éluées et identifiés par spectrométrie de masse. Cette méthode permet le ciblage sélectif et l’isolement des fourches de réplication de HSV-1 ou des génomes entiers de milieux biologiques complexes. Par ailleurs, l’adaptation de cette approche permettra d’enquête sur les divers aspects de l’infection baculoviraux, ainsi que l’examen des génomes d’autres virus à ADN.

Tout d’abord, l’utilisation de la chimie de clic pour la purification de l’ADN des cellules a été réalisée par la méthode d’iPOND21. Le but d’iPOND est de purifier les fourches de réplication cellulaire pour l’identification des protéines associées. Nous avons adapté cette technique afin d’étudier spécifiquement les interactions de protéine de vDNA au cours de l’infection. Manipulation de l’approche d’étiqueter des génomes viraux avec EdC (Figu...

Le but du présent protocole est de marquer spécifiquement et sélectivement isoler l’ADN virale des cellules infectées pour la caractérisation des protéines de génome viral lié.

Purification de l’ADN Viral pour l’Identification des protéines virus et cellulaires associées

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

L’objectif global de cette méthode est de purifier l’ADN du virus de l’herpès simplex de type un à partir de cellules infectées pour l’analyse protéomique des protéines associées au génome viral. Cette méthode fournit des informations clés sur l’implication des facteurs cellulaires et de l’infection par le virus de l’herpès. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être adaptée pour purifier directement différentes populations d’ADN viral à partir de cellules infectées, ce qui permet d’analyser de multiples aspects de l’infection.Commencer cette procédure par la culture de cinq cellules MRC comme décrit dans le protocole texte. Ensuite, diluez le HSV-1 dans une solution saline froide tris-tamponnée ou TBS. Pour les étapes suivantes, il est important d’éteindre le ventilateur et le capot de culture tissulaire pour éviter que les cellules ne se dessèchent.À l’aide d’une pipette, transférez le milieu de croissance des cellules MRC 5 dans un flacon stérile à ajouter aux cellules après l’infection. Infectez les cellules en ajoutant sept millilitres de virus dilué aux cellules. Secouez les cellules toutes les 10 minutes pendant une heure à température ambiante.Après absorption, aspirez l’innoculum, rincez les cellules avec 50 millilitres de TBS à température ambiante et remplacez le milieu de croissance d’origine. Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone. Après le début de la réplication de l’ADN viral, environ quatre heures après l’infection, l’étiquette réplique l’ADN viral.Pour ce faire, diluez EdC dans un millilitre de milieu de croissance et ajoutez-le au milieu de culture cellulaire des cellules infectées pendant deux à quatre heures. Pour récolter les noyaux, remplacez le milieu de croissance par 20 millilitres de tampon d’extraction des noyaux et incubez pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius avec balancement occasionnel. Après l’incubation, grattez les noyaux de la plaque à l’aide d’un grattoir cellulaire et transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres sur de la glace.Centrifugez pendant 10 minutes à 2 500 x g et quatre degrés Celsius pour granuler les noyaux. Après la centrifugation, jeter le surnageant. Délogez délicatement la pastille nucléaire dans 10 millilitres de tampon phosphate salin ou PBS et transférez-la dans un tube conique de 50 millilitres.Ensuite, centrifugez l’échantillon comme précédemment. Après avoir complètement retiré le PBS, remettez la pastille nucléaire en suspension dans 10 millilitres de mélange réactionnel à clic, en pipetant doucement de haut en bas cinq fois avec une pipette de 10 millilitres. Faites pivoter l’échantillon pendant une heure à quatre degrés Celsius, avant de granuler les noyaux comme précédemment.Retirez complètement le mélange à réaction rapide, puis lavez la pastille en la remettant doucement en suspension dans 10 millilitres de PBS et en la centrifugeant à nouveau. Maintenant, remettez soigneusement la pastille nucléaire en suspension dans un millilitre de PBS et transférez la solution dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Après la centrifugation, retirez complètement le PBS et congelez la pastille dans de l’azote liquide.À ce stade, le granulé peut être stocké à 80 degrés Celsius ou la procédure peut être poursuivie. Pour lyser les noyaux et fragmenter l’ADN, remettre en suspension les noyaux décongelés dans 500 microlitres de tampon B1 en pipetant de haut en bas. Incuber la suspension sur de la glace pendant 45 minutes.Ensuite, sonifiez les échantillons six fois pendant 30 secondes chacune à 40 % d’amplitude, à l’aide d’une sonde à micropointes de trois millimètres. Placez les échantillons sur de la glace pendant au moins 30 secondes entre les impulsions. Après la sonication, les échantillons doivent apparaître clairs et non troubles.Granulez les débris cellulaires en les centrifugeant à 14 000 x G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. La taille des pastilles doit diminuer considérablement, filtrer le surnageant à travers une crépine de 100 microns et retenir le débit. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon B2 au surnageant filtré.Pour lier l’ADN biotinylé aux billes enrobées de streptavidine, préparez les billes magnétiques de streptavidine en transférant 300 microlitres de boue de billes dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Préparez un tube de perles par échantillon. Lavez les billes trois fois avec un millilitre de tampon B2 en tourbillonnant pour les remettre en suspension, en appliquant sur un aimant pour séparer les billes et en aspirant le tampon de lavage.Ensuite, ajoutez 900 microlitres de l’échantillon aux billes lavées. Le reste de l’échantillon sera utilisé pour l’isolement de l’ADN et des protéines. Faites pivoter la suspension pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, placez les échantillons dans un support de tube de microfuge magnétique et retirez le surnageant. Remettez doucement les billes en suspension dans un millilitre de tampon B2, avant de les tourner à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez à nouveau le surnageant à l’aide du support de tube à microfuge magnétique.Cette fois, suspendez doucement les billes dans un tampon B3 d’un millilitre et tournez-les à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir retiré le surnageant du mélange de billes à l’aide de l’aimant, remettre les billes en suspension dans 50 microlitres de tampon d’échantillon 2x Laemmli pour faire allusion aux complexes protéiques d’ADN. Ensuite, faites bouillir les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes.Vortex un mélange avant de faire tourner rapidement les échantillons dans un microfuge. Appliquez les échantillons sur l’aimant et transférez l’allot dans un nouveau tube. Enfin, congelez les échantillons et conservez-les à 80 degrés Celsius.Effectuez l’analyse des protéines comme décrit dans le protocole textuel. Le marquage EdC a été réalisé pendant zéro, 20, 40 ou 60 minutes suivi de la purification de l’ADN viral et des protéines associées. Les protéines éluées ont été soumises à une coloration au bleu de Coomassie et à un western blot avec l’anticorps spécifique des protéines de liaison à l’ADN viral, ICP4 et UL42.La flèche indique la streptavidine qui a été retirée des billes lors de l’élution et qui est présente dans toutes les conditions. Les protéines isolées par cette méthode sont ensuite soumises à la spectrométrie de masse. Le diagramme circulaire illustre le nombre de protéines de chaque catégorie fonctionnelle qui se sont avérées associées au type de virus de l’herpès simplex sur les génomes six heures après l’infection.Un examen plus approfondi des interactions protéine-protéine entre les protéines identifiées a été effectué à l’aide de la base de données du réseau d’association fonctionnelle de protéines de chaîne. Les résultats révèlent des sous-complexes de protéines qui fonctionnent ensemble dans le même processus biologique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier l’ADN viral des cellules infectées pour l’étude protéomique des protéines associées au génome viral.Cette technique peut être réalisée en trois à quatre jours. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de prendre des précautions pour éviter la contamination des échantillons par l’ADN ou la protéase. En plus de cette procédure, d’autres méthodes comme l’immunofluorescence peuvent être effectuées pour vérifier la nature de l’ADN viral marqué par EdC.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la virologie de l’herpès, pour explorer les fonctions des protéines de l’hôte et de l’infection virale.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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