Purification de l’ADN Viral pour l’Identification des protéines virus et cellulaires associées

L’objectif global de cette méthode est de purifier l’ADN du virus de l’herpès simplex de type un à partir de cellules infectées pour l’analyse protéomique des protéines associées au génome viral. Cette méthode fournit des informations clés sur l’implication des facteurs cellulaires et de l’infection par le virus de l’herpès. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être adaptée pour purifier directement différentes populations d’ADN viral à partir de cellules infectées, ce qui permet d’analyser de multiples aspects de l’infection.

Commencer cette procédure par la culture de cinq cellules MRC comme décrit dans le protocole texte. Ensuite, diluez le HSV-1 dans une solution saline froide tris-tamponnée ou TBS. Pour les étapes suivantes, il est important d’éteindre le ventilateur et le capot de culture tissulaire pour éviter que les cellules ne se dessèchent.

À l’aide d’une pipette, transférez le milieu de croissance des cellules MRC 5 dans un flacon stérile à ajouter aux cellules après l’infection. Infectez les cellules en ajoutant sept millilitres de virus dilué aux cellules. Secouez les cellules toutes les 10 minutes pendant une heure à température ambiante.

Après absorption, aspirez l’innoculum, rincez les cellules avec 50 millilitres de TBS à température ambiante et remplacez le milieu de croissance d’origine. Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone. Après le début de la réplication de l’ADN viral, environ quatre heures après l’infection, l’étiquette réplique l’ADN viral.

Pour ce faire, diluez EdC dans un millilitre de milieu de croissance et ajoutez-le au milieu de culture cellulaire des cellules infectées pendant deux à quatre heures. Pour récolter les noyaux, remplacez le milieu de croissance par 20 millilitres de tampon d’extraction des noyaux et incubez pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius avec balancement occasionnel. Après l’incubation, grattez les noyaux de la plaque à l’aide d’un grattoir cellulaire et transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres sur de la glace.

Centrifugez pendant 10 minutes à 2 500 x g et quatre degrés Celsius pour granuler les noyaux. Après la centrifugation, jeter le surnageant. Délogez délicatement la pastille nucléaire dans 10 millilitres de tampon phosphate salin ou PBS et transférez-la dans un tube conique de 50 millilitres.

Ensuite, centrifugez l’échantillon comme précédemment. Après avoir complètement retiré le PBS, remettez la pastille nucléaire en suspension dans 10 millilitres de mélange réactionnel à clic, en pipetant doucement de haut en bas cinq fois avec une pipette de 10 millilitres. Faites pivoter l’échantillon pendant une heure à quatre degrés Celsius, avant de granuler les noyaux comme précédemment.

Retirez complètement le mélange à réaction rapide, puis lavez la pastille en la remettant doucement en suspension dans 10 millilitres de PBS et en la centrifugeant à nouveau. Maintenant, remettez soigneusement la pastille nucléaire en suspension dans un millilitre de PBS et transférez la solution dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Après la centrifugation, retirez complètement le PBS et congelez la pastille dans de l’azote liquide.

À ce stade, le granulé peut être stocké à 80 degrés Celsius ou la procédure peut être poursuivie. Pour lyser les noyaux et fragmenter l’ADN, remettre en suspension les noyaux décongelés dans 500 microlitres de tampon B1 en pipetant de haut en bas. Incuber la suspension sur de la glace pendant 45 minutes.

Ensuite, sonifiez les échantillons six fois pendant 30 secondes chacune à 40 % d’amplitude, à l’aide d’une sonde à micropointes de trois millimètres. Placez les échantillons sur de la glace pendant au moins 30 secondes entre les impulsions. Après la sonication, les échantillons doivent apparaître clairs et non troubles.

Granulez les débris cellulaires en les centrifugeant à 14 000 x G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. La taille des pastilles doit diminuer considérablement, filtrer le surnageant à travers une crépine de 100 microns et retenir le débit. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon B2 au surnageant filtré.

Pour lier l’ADN biotinylé aux billes enrobées de streptavidine, préparez les billes magnétiques de streptavidine en transférant 300 microlitres de boue de billes dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Préparez un tube de perles par échantillon. Lavez les billes trois fois avec un millilitre de tampon B2 en tourbillonnant pour les remettre en suspension, en appliquant sur un aimant pour séparer les billes et en aspirant le tampon de lavage.

Ensuite, ajoutez 900 microlitres de l’échantillon aux billes lavées. Le reste de l’échantillon sera utilisé pour l’isolement de l’ADN et des protéines. Faites pivoter la suspension pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, placez les échantillons dans un support de tube de microfuge magnétique et retirez le surnageant. Remettez doucement les billes en suspension dans un millilitre de tampon B2, avant de les tourner à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez à nouveau le surnageant à l’aide du support de tube à microfuge magnétique.

Cette fois, suspendez doucement les billes dans un tampon B3 d’un millilitre et tournez-les à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir retiré le surnageant du mélange de billes à l’aide de l’aimant, remettre les billes en suspension dans 50 microlitres de tampon d’échantillon 2x Laemmli pour faire allusion aux complexes protéiques d’ADN. Ensuite, faites bouillir les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Vortex un mélange avant de faire tourner rapidement les échantillons dans un microfuge. Appliquez les échantillons sur l’aimant et transférez l’allot dans un nouveau tube. Enfin, congelez les échantillons et conservez-les à 80 degrés Celsius.

Effectuez l’analyse des protéines comme décrit dans le protocole textuel. Le marquage EdC a été réalisé pendant zéro, 20, 40 ou 60 minutes suivi de la purification de l’ADN viral et des protéines associées. Les protéines éluées ont été soumises à une coloration au bleu de Coomassie et à un western blot avec l’anticorps spécifique des protéines de liaison à l’ADN viral, ICP4 et UL42.

La flèche indique la streptavidine qui a été retirée des billes lors de l’élution et qui est présente dans toutes les conditions. Les protéines isolées par cette méthode sont ensuite soumises à la spectrométrie de masse. Le diagramme circulaire illustre le nombre de protéines de chaque catégorie fonctionnelle qui se sont avérées associées au type de virus de l’herpès simplex sur les génomes six heures après l’infection.

Un examen plus approfondi des interactions protéine-protéine entre les protéines identifiées a été effectué à l’aide de la base de données du réseau d’association fonctionnelle de protéines de chaîne. Les résultats révèlent des sous-complexes de protéines qui fonctionnent ensemble dans le même processus biologique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier l’ADN viral des cellules infectées pour l’étude protéomique des protéines associées au génome viral.

Cette technique peut être réalisée en trois à quatre jours. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de prendre des précautions pour éviter la contamination des échantillons par l’ADN ou la protéase. En plus de cette procédure, d’autres méthodes comme l’immunofluorescence peuvent être effectuées pour vérifier la nature de l’ADN viral marqué par EdC.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la virologie de l’herpès, pour explorer les fonctions des protéines de l’hôte et de l’infection virale.