Name: Bibliothèque de Peptide qui se chevauchent pour mapper les épitopes de Qa-1 dans une protéine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Découvrez comment identifier les épitopes Qa-1 dans les protéines grâce à une bibliothèque de peptides de 15 acides aminés se chevauchant. Cette méthode simple permet de stimuler les cellules T CD8 restreintes Qa-1 pour la régulation immunitaire.

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Nous remercions Penelope Garcia pour son assistance technique et la préparation de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par une subvention de l’Innovation recherche (RIG) du département de médecine à l’Université de Loma Linda (681205-2967) et une subvention pilote de la National Multiple Sclerosis Society (PP1685) à XT.

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<li>Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disruption+of+CD8%2B+Treg+activity+enhances+the+immune+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).</li>
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<li>Guo, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+length+peptides+bind+to+HLA-Aw68+similarly+at+their+ends+but+bulge+out+in+the+middle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle.</a> Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).</li>
<li>Soloski, M. J., Metcalf, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+class+Ib+molecules+in+the+host+response+to+infection+with+Salmonella+and+its+relevance+to+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity.</a> Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).</li>
<li>Smith, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+use+endocytic+pathway+for+cross-priming+class+Ib+MHC-restricted+CD8alphaalpha%2BTCRalphabeta%2B+T+cells+with+regulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties.</a> J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).</li>
<li>Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fine+specificity+of+the+immune+response+to+a+Plasmodium+falciparum+rhoptry+neck+protein%2C+PfAARP%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP.</a> Malar J. 15, 457(2016).</li>
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</ol>

Auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Ici, nous avons décrit un protocole pour l’analyse des épitopes Qa-1 en une protéine. En ce qui concerne le présent protocole, plusieurs autres stratégies ont également été signalés auparavant. Tout d’abord, allogéniques CD8+ des lignées de cellules T et les clones ont été utilisées pour l’identification de la Qdm1. Deuxièmement, un motif de liaison-1-Qa putatif de l’analyse du Qdm a été utilisé pour l’identification de l’HSP60p216-224 et un épitope-TCRBV8.19<sup...

QA-1 appartient à un groupe de 1 b complexe majeur d’histocompatibilité non-classique molécules (MHC-Ib) chez la souris. Son homologue humain est HLA-E. Témoignage antérieur a démontré que les molécules de Qa-1 ont des fonctions biologiques importantes. Tout d’abord, Qa-1 molécules jouent un rôle important dans l’arpentage pour l’intégrité structurale et fonctionnelle des cellules. À cet égard, Qa-1 molécules ont évolué plusieurs stratégies pour surveiller la fonction normale d’une cellule. Une telle stratégie permet aux molécules de Qa-1 pour former des complexes avec un peptide leader transformés (épitope), c'est-à-dire le Qa-1 déterminant modificateur (Qdm) qui est transformés à base de molécules de MHC-Ia classiques dans le réticulum endoplasmique1. Ces complexes de Qa-1/Qdm plus tard affichent sur la surface d’une cellule et se lient aux récepteurs de NKG2A inhibitrices sur les cellules NK pour inhiber NK tuant l’activité2. Si l’expression de molécules MHC-Ia est perdue, une cellule (par exemple une cellule maligne) devient sensible à NK tuant2. L’autre stratégie permet aux molécules de Qa-1 former de nouveaux complexes de Qa-1/épitope sur la surface d’une cellule qui est déficiente en TAP (transporter associé au traitement de l’antigène)3 et/ou ERAAP (aminopeptidase de réticulum endoplasmique associé traitement de l’antigène)4 (les deux défauts se produisent souvent dans les cellules malignes). La cellule qui exprime ces nouveaux complexes de Qa-1/épitope peut ensuite être reconnue et éliminée par l’épitope spécifique CD8 Qa-1-accès restreint+ T des cellules. Deuxièmement, Qa-1 molécules induisent immunorégulation5. À cet égard, Qa-1/épitope complexes ont été montrés pour stimuler CD8+ des lymphocytes T (Treg) régulateurs qui sont importants pour la prévention des dommages immunitaire du self-tissus6,7,8 ,9,10. Troisièmement, Qa-1-accès restreint CD8+ Treg cellules auraient dû être divulgués afin de limiter les réponses immunitaires contre les infections virales,11.
Par conséquent, augmentation spécifique de l’épitope spécifique Qa-1-restrictred CD8+ T des cellules est une stratégie potentiellement prometteuse pour l’élimination des cellules anormales, pour le renforcement de la régulation immunitaire et pour le contrôle de l’ampleur des Viro-induite des réponses immunitaires. Tandis qu’il n’a pas été déterminé si augmentation des épitopes spécifiques CD8 Qa-1-accès restreint+ T cellules peuvent améliorer la surveillance du système immunitaire et limiter Viro-induite des réponses immunitaires, nos laboratoires et autres ont clairement démontré que immunisation avec des épitopes Qa-1 capable de compléter la fonction de Qa-1-accès restreint CD8+ Treg cellules spécifiques pour CD4 auto-immunes pathogènes+ T cellules, menant à un contrôle efficace des CD4+ T cell-mediated des maladies auto-immunes dans un variété des animaux modèles tels qu’encéphalomyélite allergique expérimentale (un modèle animal de la sclérose en plaques humaine)6,10, arthrite induite par le collagène (un modèle animal de la polyarthrite rhumatoïde)7, et diabète non obèses (un modèle animal du diabète de type humain 1)8. En outre, nous avons découvert que la vaccination avec un épitope de Qa-1 tissu-spécifique conduit à contrôle spécifique de l’inflammation immunitaire dans ce tissu par augmentation de CD8+ Treg cellules12. Les succès ci-dessus des études précliniques indiquent un besoin pour une évaluation complète de l’immunisation d’épitope Qa-1 pour le traitement des maladies à médiation immunitaire tissu-spécifique et, éventuellement, pour le traitement d’autres maladies associées aux carences dans le robinet et ERAAP.
En conséquence, il y a une demande pour une technologie qui permet d’analyser rapidement et de façon fiable des épitopes de Qa-1 en une protéine. À cet égard, un nombre limité de biologiquement importants épitopes Qa-1 a été décrite. La plupart de ces épitopes Qa-1 ont été identifiée par hasard au cours de l’étude des CD8+ T cell réponses aux bactéries13, cellules déficientes en robinet3, cellules déficientes en ERAAP4et les cellules qui causent de l’EAE6, 9. Par conséquent, une technique à haut débit est souhaitable pour l’identification des épitopes de Qa-1 biologiquement importants dans une protéine définie. Dans ce qui suit, nous décrivons une stratégie de bibliothèque de peptide (PLO) qui se chevauchent qui mappe des épitopes de Qa-1 fonctionnelles dans une protéine à l’aide de CD8 Qa-1-resrticted+ des lymphocytes T lignes spécifiques pour le pool de PLO (OLP_pool) d’une protéine.

<table><tbody><tr><td>La protéine à analyser</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>La séquence de la protéine peut être obtenue à partir</td></tr><tr><td>du diméthylsulfoxyde NCBI (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# : D2650 SIGMA</td><td>DMSO doit être stérile et testé en culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Souris Kb-/-Db-/-</td><td>The Lackson</td><td>Laboratory Stock# : 019995</td><td>Nous avons utilisé des souris Taconic H2-KbH2-Db doube knockout (Cat# : 4215-F et 4215-M) qui ne sont cependant plus disponibles.</td></tr><tr><td>AIM V Sans Sérum Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# : 12055091</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# : 21985023</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# : 11360070</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# : 11140076</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# : 11333D</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Gel P-100</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# : 150-4171</td><td></td></tr><tr><td>Phoshate Balanced Solution (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# : 20012027</td><td></td></tr><tr><td>pipette Trasfer</td><td>Globe Scientific</td><td>Mfg# : 137238</td><td></td></tr><tr><td>Murine M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>Cat# : 315-02</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire à 48 puits</td><td>USA Scientific</td><td>Cat# : CC7682-7548</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96 puits, fond en forme de V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# : Z372129 Sigma</td><td></td></tr><tr><td>1ml de profondeur 06-well PP plate, stérile</td><td>USA</td><td>Scientific Item# : 1896-1110</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murin IL-2</td><td>PeproTech</td><td>Cat# : 212-12</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murin IL-7</td><td>PeproTech</td><td>Cat#L : 217-17</td><td></td></tr><tr><td>Capture d’anticorps anti-IFN-&gamma ;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# : 551881</td><td></td></tr><tr><td>plaque ELISPOT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# : S2EM004M99</td><td></td></tr><tr><td>C1R</td><td></td><td>ATCC Cat# : ATCC CRL-1993</td><td></td></tr><tr><td>C1R. Qa-1b</td><td></td><td></td><td>Sur mesure (accès GenBank# : NM_010398.3)</td></tr><tr><td>Vecteur lentiviral Qa-1</td><td>GeneCopoeia</td><td>Produit # : Mm02955</td><td></td></tr><tr><td>Détection anti-IFN-&gamma ; anticorps</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# : 551881</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# : P9416</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-HRP</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# : BD557630</td><td></td></tr><tr><td>Substrat AEC</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# : 551951</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur ImmunoSpot</td><td>ImmunoSpot</td><td></td><td>Tout analyseur immunoSpot devrait fonctionner à cet effet.</td></tr></tbody></table>

bibliothèque de peptide qui se chevauchent pour mapper les épitopes de qa-1 dans une protéine

Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

QA-1 (HLA-E chez l’homme) appartient à un groupe de 1 b complexe majeur d’histocompatibilité non-classique molécules (MHC-Ib). Des données récentes suggèrent que Qa-1 molécules jouent un rôle important dans l’arpentage pour l’intégrité structurale et fonctionnelle des cellules, induisant la régulation immunitaire et en limitant la réponse immunitaire aux infections virales. En outre, augmentation fonctionnelle de Qa-1-accès restreint CD8+ T des cellules par l’intermédiaire d’épitope vaccination a montré des effets thérapeutiques dans plusieurs modèles animaux de maladies auto-immunes, par exemple l’encéphalomyélite allergique expérimentale, l’arthrite induite par le collagène et le diabète non obèses. Par conséquent, il y a un besoin urgent d’une méthode qui permet d’identifier rapidement et efficacement des épitopes de Qa-1 fonctionnelles dans une protéine. Nous décrivons ici un protocole qui utilise Qa-1-accès restreint CD8+ des lymphocytes T lignes spécifiques pour une bibliothèque de peptide (PLO) qui se chevauchent pour déterminer les épitopes de Qa-1 en une protéine. Cette bibliothèque de PLO contient 15-mer peptides qui se chevauchent qui couvrent toute la longueur d’une protéine, et chevauchent les peptides adjacents de 11 acides aminés. Utilisant ce protocole, nous avons récemment identifié un épitope de Qa-1 9-mer en glycoprotéine de myéline oligodendrocyte (MOG). Cet épitope MOG Qa-1 nouvellement mappé a été montré pour induire des CD8 spécifiques d’épitope, Qa-1-accès restreint+ T cells accrue myéline spécifique immunitaire duditrèglement. Par conséquent, ce protocole est utile pour l’enquête future de nouvelles cibles et fonctions du CD8 Qa-1-accès restreint+ T des cellules.

Conception d’une bibliothèque de PLO couvrant toute la longueur d’une protéine
Partant de l’extrémité N-terminale d’une protéine, chaque peptide est 15 acides aminés (15-mer). Par conséquent, le premier peptide s’étend sur la position 1 à la position 15. N-terminal du second peptide chevauche l’extrémité C-terminale du premier peptide de 11 acides aminés. Par conséquent, le second peptide s’étend sur la position 5 à position 19. Co...

QA-1 (HLA-E chez l’homme) appartient à un groupe de molécules 1 b complexe majeur d’histocompatibilité non-classique. Vaccination avec Qa-1-liaison épitopes s’est avérée augmenter tissu-spécifique régulation immunitaire et d’améliorer plusieurs maladies auto-immunes. Dans les présentes, nous décrivons une stratégie de bibliothèque de peptide qui se chevauchent pour l’identification des épitopes Qa-1 en une protéine.

Bibliothèque de Peptide qui se chevauchent pour mapper les épitopes de Qa-1 dans une protéine

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les épitopes de Qa-1 dans les protéines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régulation immunitaire et de l’immunothérapie. Les principaux avantages de cette technique sont que les peptides cartographiés sont connus pour stimuler les cellules T CD8 restreintes à Qa-1, et que la procédure est facile à réaliser.Les implications de cette technique s’étendent à la conception thérapeutique de maladies à médiation immunitaire, telles que la sclérose en plaques. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la régulation immunitaire médiée par Qa-1 chez les animaux, elle peut également être appliquée à la régulation immunitaire médiée par HLA-E chez l’homme. Pour commencer la procédure, concevez une bibliothèque de peptides 15-mers, dans laquelle les peptides adjacents se chevauchent en 11 acides aminés.Obtenir et reconstituer les peptides dans des conditions stériles. Pour chaque peptide, combinez cinq milligrammes du peptide avec 100 microlitres de diméthylsulfoxyde. Combinez 10 microlitres de chaque stock peptidique dans un tube cryogénique propre de 1 millilitre pour préparer le stock

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Immunologie et infection

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Nous présentons ici un protocole pour la purification des complexes peptidiques de classe I et de classe II du CMH à partir de lignées cellulaires de souris et d’humains fournissant des données immunopeptidomiques de haute qualité. Le protocole se concentre sur la préparation d’échantillons à l’aide d’anticorps disponibles dans le commerce.

Immunopeptidomique : isolement de peptides associés à la souris et au CMH humain de classe I et II pour l’analyse par spectrométrie de masse

Ici, nous présentons un protocole permettant la capture et l’identification d’interactions protéine-protéine spécifiques à une maladie à partir de cellules et de tissus natifs à l’aide de sondes chimiques et de spectrométrie de masse. Les ensembles de données d’interaction qui en résultent sont analysés par le biais d’une plate-forme Web dédiée pour révéler les dysfonctionnements dynamiques du réseau et les altérations des voies liées à la maladie.

Cartographie des interactions protéine-protéine dysfonctionnelles dans la maladie

Découvrez comment identifier les épitopes Qa-1 dans les protéines grâce à une bibliothèque de peptides de 15 acides aminés se chevauchant. Cette méthode simple permet de stimuler les cellules T CD8 restreintes Qa-1 pour la régulation immunitaire.

Bibliothèque de Peptide qui se chevauchent pour mapper les épitopes de Qa-1 dans une protéine

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