Bibliothèque de Peptide qui se chevauchent pour mapper les épitopes de Qa-1 dans une protéine

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les épitopes de Qa-1 dans les protéines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régulation immunitaire et de l’immunothérapie. Les principaux avantages de cette technique sont que les peptides cartographiés sont connus pour stimuler les cellules T CD8 restreintes à Qa-1, et que la procédure est facile à réaliser.

Les implications de cette technique s’étendent à la conception thérapeutique de maladies à médiation immunitaire, telles que la sclérose en plaques. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la régulation immunitaire médiée par Qa-1 chez les animaux, elle peut également être appliquée à la régulation immunitaire médiée par HLA-E chez l’homme. Pour commencer la procédure, concevez une bibliothèque de peptides 15-mers, dans laquelle les peptides adjacents se chevauchent en 11 acides aminés.

Obtenir et reconstituer les peptides dans des conditions stériles. Pour chaque peptide, combinez cinq milligrammes du peptide avec 100 microlitres de diméthylsulfoxyde. Combinez 10 microlitres de chaque stock peptidique dans un tube cryogénique propre de 1 millilitre pour préparer le stock de pool OLP.

Ensuite, chargez 20 microlitres de chaque stock peptidique dans une plaque à 96 puits à fond en V et diluez chaque stock avec 80 microlitres d’eau stérile. Stockez à la fois les 50 milligrammes de peptides restants et la plaque de 10 milligrammes de peptides à 20 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de la solution mère de pool OLP dans un tube de 15 millilitres contenant deux millilitres de cellules dendritiques irradiées dans un milieu sans sérum, diluant ainsi le DMSO deux cents fois.

Stockez le stock de piscine OLP restant à 20 degrés Celsius. Incuber les DC avec la piscine OLP à température ambiante pendant trois heures. Secouez doucement les cellules toutes les 15 minutes à la main.

Pendant l’incubation, utilisez un kit pour purifier les lymphocytes T CD8+ d’une rate ou d’un ganglion lymphatique de souris prélevé. Préparez cinq millilitres d’une solution avec 10 millions de lymphocytes T par millilitre de milieu sans sérum avec 50 unités par millilitre d’interleukine 2 et 100 unités par millilitre d’interleukine 7. Les lymphocytes T CD8 purifiés doivent être exempts de billes ou intacts.

Placez 0,5 millilitre de la solution de cellules T dans chacun des 10 puits d’une plaque de 48 puits. Une fois l’incubation de la solution de DC pulsée en pool OLP terminée, ajoutez 10 millilitres de milieu sans sérum aux DC. Centrifugez les cellules à 300 fois G pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, reconstituez les cellules dans cinq millilitres de milieu sans sérum. Ajoutez 0,5 millilitre de suspension cellulaire dans chacun des 10 puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 % pendant quatre jours.

Ensuite, retirez 400 microlitres de milieu de culture de chaque puits. Ajoutez 500 microlitres de milieu frais sans sérum contenant 100 unités par millilitre d’IL-2 et d’IL-7 dans chaque puits. Incuber les cellules pendant encore deux à trois jours avant de restimuler les cellules amorcées par le bassin OLP.

Avant la restimulation, prélever et irradier les macrophages péritonéaux de souris. Ajustez la concentration de macrophages à cinq millions de cellules par millilitre de milieu sans sérum. Combinez 10 microlitres de stock OLP avec deux millilitres de macrophages péritonéaux irradiés pour une concentration finale de DMSO de 0,5 % en volume.

Complétez cette solution avec 100 unités par millilitre de facteur de stimulation des colonies de macrophages murins. Remplissez une plaque de 48 puits avec 200 microlitres de la solution de macrophages de piscine OLP dans chaque puits. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.

Ensuite, lavez délicatement chaque puits avec 200 microlitres de milieu RPMI-0 préchauffé. La solution de macrophage contiendra beaucoup de billes. Avant d’ajouter les cellules T CD8 amorcées par le pool OLP, la plaque doit être vérifiée au microscope pour s’assurer que tous les puits sont exempts de billes.

Ensuite, collectez et regroupez les cellules CD8 + T amorcées par le pool OLP qui sont prêtes pour la re-stimulation. Ajustez la concentration de cellules T à un million de cellules par millilitre dans un milieu sans sérum contenant 25 unités par millilitre d’IL-2 et 50 unités par millilitre d’IL-7. Ajoutez un millilitre de la solution de lymphocytes T mélangés à chaque puits contenant des macrophages pulsés en pool OLP.

Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 % pendant quatre jours. Ensuite, retirez environ 400 microlitres du milieu de chaque puits. Ajoutez à chaque puits 500 microlitres de milieu frais sans sérum contenant 100 unités par millilitre d’IL-2 et d’IL-7.

Reprendre l’incubation dans les mêmes conditions. Après trois à quatre jours, examinez les cellules restimulées à la recherche d’une réponse restreinte à Qa-1 spécifique du pool OLP avec un test immuno-spot lié à l’enzyme interféron-gamma. Actualisez le milieu CD8+T tous les trois à quatre jours en attendant les résultats.

Effectuez un test ELISPOT avec les stocks de peptides dilués pour déterminer quels peptides produisent la sécrétion restreinte d’interféron-gamma Qa-1 spécifique du pool OLP. Enfin, évaluez une série de peptides tronqués avec ELISPOT pour identifier l’épitope optimal de Qa-1. Un test ELISPOT à l’interféron gamma a montré une augmentation significative des cellules formant des taches lorsque les cellules T CD8+ stimulées par la banque de peptides superposés MOG étaient combinées avec du C1R.

Cellules Qa-1b. Cela suggère que les lymphocytes T ont réagi aux peptides de liaison à Qa-1 et que les MOG_pool contenaient un ou plusieurs épitopes de liaison à Qa-1. Un autre test a été effectué pour cribler les peptides individuels dans le pool.

Trois peptides ont montré des réponses au moins trois fois supérieures à la réponse en présence de C1R. Cellules Qa-1b sans peptides. Parmi ceux-ci, le peptide ayant obtenu la réponse la plus élevée a été sélectionné pour une évaluation plus approfondie.

Une banque de peptides tronqués basée sur le peptide 15-mer d’intérêt a été évaluée pour identifier l’épitope optimal de Qa-1. L’épitope serait idéalement de huit à 10 mer, avec neuf mers préférés. De plus, l’épitope optimal présenterait une réponse interféron-gamma similaire ou plus forte que le peptide 15-mer.

Le peptide tronqué à neuf mères N-terminale répond le mieux à ces critères, ce qui en fait l’épitope optimal de Qa-1. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régulation immunitaire pour découvrir de nouveaux épitopes de Qa-1 pour l’étude de la régulation immunitaire dans d’autres tissus, tels que le pancréas. N’oubliez pas que travailler avec des radiations peut être extrêmement dangereux.

Les chercheurs doivent suivre strictement la politique de l’établissement et recevoir une formation appropriée.