Préparation des cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en Phases de Cycle de cellules différentes par élutriation centrifuge

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules dans différentes phases du cycle cellulaire en utilisant l’élutriation centrifuge. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des thérapies anticancéreuses. Parce que l’isolement des cellules en phases distinctes permet d’interroger les effets dépendants de la phase des composés anticancéreux.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de séparer les cellules en phases spécifiques en utilisant des propriétés physiques, plutôt que des perturbations chimiques. Pour commencer l’expérience, installez l’ensemble stroboscopique dans la centrifugeuse de sorte que le cordon d’alimentation soit alimenté hors de la chambre par l’orifice situé à gauche. Ajustez la lampe du flash stroboscopique de manière à ce qu’elle s’aligne avec la fenêtre de visualisation, lorsque la centrifugeuse est fermée.

Fixez l’ensemble en place, en serrant deux vis à tête cruciforme, en haut de chaque support. Et puis en serrant les vis à oreilles au bas du support. Branchez le cordon d’alimentation dans le port d’alimentation stroboscopique, situé à l’arrière de la centrifugeuse.

Ensuite, placez les rotors directement sur le moyeu d’entraînement de la centrifugeuse et fixez-le fermement à l’aide d’une clé hexagonale à poignée en T. Ensuite, placez l’ensemble contenant la chambre d’élutriation, le contrepoids, l’ensemble de joint rotatif et une plaque de montage sur le rotor. Appuyez uniformément vers le bas, en plaçant une main sur la chambre d’élutriation et l’autre main sur le contrepoids, jusqu’à ce que les boulons du rotor s’enclenchent.

Placez la goupille, située à une extrémité du câble, dans le trou de l’ensemble de joint rotatif. Et fixez le trou de l’œil, à l’autre extrémité, avec l’une des vis à tête cruciforme, fixée sur le support pour connecter le câble d’ancrage. Pour assembler le système d’écoulement, pour pomper le tampon dans et hors de la chambre d’élutriation, connectez un tube de taille 16 à une pompe à vitesse variable.

Insérez une extrémité libre de ce tube à travers un orifice situé en haut à gauche de la chambre de centrifugation, de sorte qu’il pénètre dans la chambre. Fixez un raccord à l’extrémité libre de ce tube, puis insérez le raccord dans le trou d’entrée de l’ensemble de joint rotatif. Enfin, insérez le tube de sortie, à travers un orifice, pour le fixer au tube de transfert en haut de l’ensemble de joint rotatif.

Une fois le système d’élutriation assemblé, stérilisez-le en plaçant l’autre extrémité libre du tube d’entrée dans une bouteille de 500 millilitres, remplie d’eau de Javel à 5 %. Et en plaçant le tube de sortie dans une bouteille de déchets vide d’un litre. Ensuite, allumez la pompe et laissez l’eau de Javel s’écouler tout au long du système d’élutriation, jusqu’à ce qu’elle soit pompée dans la bouteille à déchets.

Maintenant, allumez la centrifugeuse et laissez-la atteindre la vitesse maximale désignée pour libérer les bulles et la contre-pression. Une fois la vitesse réglée atteinte, arrêtez la centrifugeuse. Une fois que le rotor s’est complètement arrêté, ouvrez le couvercle et inspectez la chambre pour détecter toute fuite.

Ensuite, de la même manière, comme décrit précédemment, faites couler de l’eau stérile dans le système pendant 10 minutes. Après avoir rincé à l’eau, remplacez le réservoir d’eau par une bouteille en verre stérile remplie de 100 millilitres de tampon d’élutriation. Placez le tube d’entrée dans cette bouteille, de manière à ce qu’il soit tout en bas.

Démarrez la centrifugeuse et laissez la mémoire tampon s’écouler dans le système. Une fois que la bouteille du réservoir est presque vide et que l’eau est complètement évacuée du système, déplacez le tube de sortie de la bouteille à déchets dans le réservoir afin que le tampon soit recyclé en continu dans le système. Enfin, allumez la lampe stroboscopique et tournez le bouton d’élutriation vers l’extrême gauche.

Maintenant, ajustez la fenêtre de visualisation en tournant lentement le bouton vers la droite, de sorte que la chambre d’élutriation soit clairement visible et que la lumière stroboscopique soit synchronisée avec la vitesse du rotor. Préparez l’échantillon de cellule comme décrit dans le protocole de texte. Ajoutez les cellules remises en suspension dans la bouteille-réservoir contenant le tampon d’élutriation de recyclage.

Laissez les cellules entrer dans le système et atteindre l’équilibre dans la chambre d’élutriation. Pour vous assurer que toutes les cellules sont retenues dans la chambre, prélevez une goutte de l’éluant sur une lame de verre et observez-la au microscope. Si l’échantillon est dépourvu de cellules intactes, cela confirme la rétention dans la chambre.

Une fois que toutes les cellules sont entrées dans la chambre et qu’une limite distincte dans la partie la plus blanche de la chambre, contenant les cellules et l’équilibre, commence à collecter des fractions. Déplacez le tube de sortie vers un tube conique pré-refroidi de 50 millilitres, étiqueté W1. Récupérez 50 millilitres de tampon d’élutriation dans ce tube et stockez-le sur de la glace. Peu de temps après avoir collecté la fraction W1, abaissez la vitesse de la centrifugeuse à 821 G.Et déplacez le tube de sortie vers le tube conique, étiqueté W2, et collectez 50 millilitres de plus à cette vitesse.

Continuez à changer la vitesse et à collecter des fractions. Assurez-vous qu’il y a du fluide dans le réservoir et stockez toujours les fractions collectées sur de la glace. Une fois que toutes les fractions ont été collectées, arrêtez la centrifugeuse et collectez 50 millilitres dans un tube conique, étiqueté stop.

Des cellules granulaires sont prélevées dans chacune des fractions et utilisent une analyse en aval, comme la cytométrie en flux ou le western blot, au besoin. Un graphique linéaire montrant le diamètre moyen des cellules en fractions d’élutriation successives est présenté. Notez que plus le diamètre de la cellule est grand, plus le nombre de fractions auquel elle élue est élevé.

Les résultats de l’analyse de tri des cellules activées par fluorescence montrent la teneur en ADN des cellules dans chacune des 20 fractions d’élutriation. Les premières fractions, F1 à F5, contiennent presque exclusivement des cellules avec du contenu en ADN 2N représentant des cellules en phase G1. Un mélange de cellules dans les phases G1 et S a été observé dans les fractions intermédiaires, F6 à F9. Et des cellules avec un contenu en ADN 4N, représentant des cellules de G2 à M, ont été observées à partir de F10.

On voit ici les résultats du western blot obtenus en sondant les niveaux de protéines liées au cycle cellulaire dans des fractions regroupées de cellules en phase G1 et en phase G2 à M. Comme prévu, les teneurs en phospho-Rb et en cycline B ont été plus élevées dans les rangées G2 à M que dans les rangées G1. Le signal de la cycline D un était faible, mais néanmoins détectable dans le pool G1 et indétectable dans le pool G2 à M.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de prendre son temps et de s’assurer que le système d’élutriation est correctement assemblé et que tous les matériaux et solutions sont préparés. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse du cycle cellulaire, les tests de viabilité cellulaire et les immunoblots peuvent être effectuées afin d’interroger comment les composés thérapeutiques peuvent agir d’une manière dépendante de la phase du cycle cellulaire.