Name: Préparation des cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en Phases de Cycle de cellules différentes par élutriation centrifuge (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Apprenez l'élutriation centrifuge pour isoler des cellules de leucémie lymphoblastique aiguë en phases de cycle cellulaire distinctes. Cette méthode permet d'étudier les effets phase-dépendants des composés anticancéreux sans perturbation chimique.

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Ce travail a été soutenu par les NIH CA109821 (à la STC). Nous remercions Beckman-Coulter pour fournir généreusement des fonds pour couvrir les frais de publication et d’assistance technique à l’installation et le fonctionnement du système élutriation. Nous remercions le Dr Fred Falkenburg fournissant primaire initiale toutes les cultures.

Remarque : ce protocole a été optimisé pour primaire B-toutes les cellules qui vont de diamètre d’environ 8 µm (phase G1) à 13 µm (phases G2/M). Ainsi, la centrifugeuse spécifique des vitesses et les débits pompe peut-être pas applicables aux cellules avec des gammes de tailles différentes. Néanmoins, les paramètres appropriés d’élutriation peuvent être estimées à l’aide de l’équation de vitesse de sédimentation. Les cellules sont cultivées dans un milieu sans sérum défini comme décrit 16 à une densité optimale de 1-3 x 10 6 cellules/mL. À l’exception de la collection des fractions qui est réalisée à 4 ° C, en utilisant des tubes de refroidissement glace, toutes les mesures sont effectuées à température ambiante et la centrifugeuse réglé à 20 ° C avec un maximum de 24 ° C.
 1. préparation du tampon de l’élutriation et matériaux <ol><li>afin de réduire l’agglutination des cellules, de préparer un tampon d’élutriation de Hank &#39; s équilibré de solution saline (HBSS) avec le rouge de phénol additionné de 2 % sérum de veau fœtal ( FBS), pour protéger les cellules contre les contraintes mécaniques pendant le processus de l’élutriation et 1,6 g/L de sel dipotassique acide 2-naphtol-6,8-disulfonique (NDA), qui rend l’extérieur de la cellule chargée négativement et réduit l’agglutination.
	<ol><li>Ajouter 1,6 g de NDA dans un tube conique de 50 mL.</li>
		<li>Dans des conditions stériles, ajouter 35 mL de HBSS provenant d’une bouteille de 1 L dans le tube conique de 50 mL contenant NDA. Agiter le tube jusqu'à ce que l’EDN a dissous.</li>
		<li>à l’aide d’un filtre de 0,2 µm, transférer la LDN dissoute dans un nouveau tube conique stérile de 50 mL. Puis ajoutez l’EDN à la L 1 restante du HBSS.</li>
		<li>Ajouter enfin, 21 mL FBS à la HBSS pour obtenir une concentration finale de 2 % (v/v). 
		Remarque : La mémoire tampon d’élutriation peut être préparée et stockée à 4 ° C jusqu'à la date d’expiration du HBSS ou jusqu'à ce qu’il y a un changement majeur dans le pH comme il est indiqué par un jaunissement du colorant indicateur.</li>
	</ol></li> <li>Label 50 mL tubes coniques pour la collecte des fractions afin qu’il y a laver les fractions (W1 et W2), 1-20 (F1 - F20) 1 et 2 tubes étiquetés et arrêter.
	<ol><li>Refroidir préalablement ces tubes sur la glace avant de recueillir des fractions.</li>
	</ol></li></ol> 2. Assemblage du système élutriation <ol><li>installer tout d’abord, l’Assemblée de stroboscope dans la centrifugeuse pour que le cordon d’alimentation est introduit dans la chambre via le port sur le côté gauche. Veiller à ce que la lampe flash stroboscopique est à l’avant de la chambre, donc il s’alignera avec la fenêtre de visualisation quand la centrifugeuse est fermée.
	<ol><li>Fixer l’ensemble en place en serrant tout d’abord deux vis à tête Phillips dans les deux trous en haut de la chaque support et ensuite en serrant les vis de serrage au bas de chaque support.</li>
		<li>Brancher le cordon d’alimentation dans la prise d’alimentation de lampe stroboscopique à l’arrière de la centrifugeuse.</li>
	</ol></li> <li>Ensuite, mettre le rotor vers le bas sur le moyeu d’entraînement de centrifugeuse et sécuriser avec une clé hexagonale de poignée en T. 
	Remarque : Si la centrifugeuse n’est pas nécessaire à des fins non-élutriation, l’Assemblée de stroboscope et le rotor peuvent être conservés dans la centrifugeuse entre pistes.</li>
	<li>Une fois que le rotor est sécurisé, placez l’assembly de dégagement rapide contenant la chambre élutriation, contrepoids, rotation d’ensemble et une plaque de montage dans le rotor.
	<ol><li>Appuyez uniformément avec une main sur la chambre d’élutriation et l’autre main sur le contrepoids jusqu'à ce que les boulons dans le rotor s’enclenchent dans les trous sur la plaque de montage.</li>
		<li>Enfin, fixer l’ancrage de câble en plaçant la broche sur un côté du câble dans le trou de la garniture rotative et fixant l’eyehole de l’autre côté du câble avec une des vis à tête Phillips (mentionnés à la section 2.1.1) sur le support sur le côté gauche de o la chambre de f.</li>
	</ol></li> <li>Ensuite assembler le système d’écoulement à l’aide d’une pompe à vitesse variable et chambre de tuyau au tampon de pompe dans l’élutriation et recueillir tampon telle qu’elle circule dans la chambre de l’élutriation.
	<ol><li>Insérer le tuyau d’entrée de taille 16 venant de la pompe à vitesse variable par l’orifice en haut à gauche de la chambre de centrifugeuse afin qu’elle pénètre dans la chambre.</li>
		<li>Fixer un raccord à l’extrémité libre du tuyau d’entrée et insérez le raccord dans le trou d’entrée sur le côté de la garniture rotative.</li>
		Ensemble d’étanchéité <li>Insérez la taille 16 tubes via le port de sortie et fixez-le au tube de transfert en haut de la rotation. 
		Remarque : Le système d’écoulement peut rester aussi assemblé entre les exécutions d’élutriation.</li>
	</ol></li> <li>Enfin, allumez la centrifugeuse et définir les spécifications nécessaires pour l’expérience.
	<ol><li>Changement du rotor ID.</li>
		<li>Si la centrifugeuse requiert une contribution de temps, définissez pendant 2 h, ce qui est plus que suffisante pour effectuer une élutriation exécute.</li>
		<li>Régler la température à 20 ° C avec une température maximum de 24 ° C.</li>
		<li>Set max l’accélération et la décélération pour lent.</li>
		<li>Enfin, réglez la vitesse à 867 x g.</li>
	</ol></li></ol> 3. D’amorçage du système élutriation <ol><li>préalable pour stériliser le système élutriation, placez le tuyau de réservoir dans une bouteille en plastique de 500 mL, contenant 5 % eau de Javel et placer le tube de sortie dans une bouteille en plastique vide de déchets du 1 L.
	<ol><li>Allumer la pompe et de régler la vitesse à 25 mL/min et de permettre à l’eau de Javel 5 % s’écouler complètement par le système d’élutriation jusqu'à ce qu’il est pompé hors du tube de sortie dans la bouteille pour eaux usées.</li>
		<li>Allumez la centrifugeuse et lui permettre de venir au maximum désignée vitesse (867 x g) afin de libérer les bulles et contre-pression.</li>
		<li>Arrêter la centrifugeuse. Une fois que le rotor a arrêté de tourner, ouvrez le couvercle et inspecter la chambre de fuites.</li>
		<li>Si il n’y a aucune fuite, laisser la solution d’eau de Javel débit dans le système pendant au moins 5 min.</li>
	</ol></li> <li>Ensuite, rincez le système avec autoclave eau comme eau de Javel peut conduire à la formation de précipités de la mémoire tampon d’élutriation qui peut conduire à l’agglutination des cellules, ainsi que d’effets nocifs pour les cellules.
	<ol><li>Place le tuyau de réservoir dans une bouteille de 1 L de stérilisés à l’autoclave de l’eau et lui permettre de circuler dans pour au moins 10 min.</li>
	</ol></li> <li>Après le rinçage avec de l’eau, introduire le tampon élutriation dans le système. Utiliser une bouteille de verre de 150 mL qui a été stérilisés à l’autoclave pour créer un réservoir pour les cellules et le tampon d’élutriation.
	<ol><li>Ajouter 100 mL de tampon d’élutriation dans le flacon et déplacer le tuyau de réservoir à la bouteille en verre afin que le tube est tout en bas.</li>
		<li>Commencer la centrifugeuse et laisser le tampon de circuler à travers le système pour évacuer l’eau.</li>
		<li>Une fois la bouteille réservoir est presque vide et l’eau est complètement évacué hors du système, déplacez la sortie tuyau de la bouteille pour eaux usées vers le réservoir afin que la mémoire tampon est être recyclé via le système de.</li>
	</ol></li> <li>Enfin, ajuster la fenêtre de visualisation afin que la chambre d’élutriation peut être vu à la vitesse actuelle.
	Lampe <ol><li>presse le stroboscope alimentation touche à l’extérieur de la centrifugeuse pour que la lampe s’allume. Tourner l’élutriation kNob également à l’extérieur de la centrifugeuse complètement vers la gauche.</li>
		<li>Tout en regardant par le hublot, lentement tourner le bouton vers la droite jusqu'à ce que la chambre d’élutriation entrera en vue et la lumière stroboscopique est dans le temps avec la rotation du rotor. 
		Remarque : Le système d’élutriation peut être laissé dans cet état jusqu'à ce que les cellules sont préparés.</li>
	</ol></li></ol> 4. Préparation de l’échantillon de cellules les cellules <ol><li>comte et aliquote moyen de 300 à 400 millions en croissance dans plusieurs tubes conique de 50 mL. Tournez en bas des cellules à 1210 x g pendant 3 min.</li>
	<li>Aspirer les cellules de médias et remettre de la croissance dans 25 mL de tampon d’élutriation en pipettant également monter et descendre doucement.</li>
	<li>Afin de réduire la cellule agglomérante, cellules de passe deux fois à un 25 aiguille de calibre.
	<ol><li>à l’aide d’une seringue de 10 mL dresser les cellules puis fixer l’aiguille de calibre 25 et passer les cellules grâce à l’intérieur sur la paroi d’un tube conique stérile de 50 mL. Répétez cette opération jusqu'à ce que tous les 25 mL ont transité par l’aiguille.</li>
		<li>Obtenir une nouvelle aiguille et la seringue et répéter le processus ci-dessus une fois. 
		ATTENTION : Aiguilles de seringue doivent être placés dans des conteneurs pour objets acérés. 
		Remarque : Il est essentiel que les cellules sont poussés à travers l’aiguille immédiatement avant de leur présenter le système d’élutriation pour garder la cellule s’agglutiner au minimum.</li>
	</ol></li></ol> 5. Introduction de l’échantillon cellulaire dans le système de l’élutriation et la Collection des Fractions <ol><li>introduire l’échantillon cellulaire dans le système d’élutriation en versant l’échantillon cellulaire dans le réservoir de stockage qui a de la mémoire tampon d’élutriation restants recyclage par le biais .
	<ol><li>Laisse les cellules entrent dans le système et atteindre l’équilibre au sein de la chambre d’élutriation. 
		Remarque : Ce processus prendra environ 5 min et progrès peuvent être suivis en regardant les cellules lorsqu’ils entrent dans la chambre par l’intermédiaire de la fenêtre de visualisation. Pour s’assurer que toutes les cellules sont dans la chambre, prendre une goutte de l’éluant, déposer sur une lame de verre et Découvre sous un microscope. Si l’échantillon est libre de cellules intactes, cela confirme leur maintien dans la chambre de.</li>
	</ol></li> <li>Commencer à accumuler des fractions dès que toutes les cellules sont entrés dans la chambre et il y a une limite distincte à la partie la plus large de la chambre dans laquelle les cellules sont en équilibre.
	<ol><li>Begin en déplaçant le tube de sortie vers le tube à fond conique 50 mL étiqueté W1. Recueillir 50 mL de tampon d’élutriation pour cette fraction, en veillant à garder un oeil sur le réservoir de stockage et de reconstituer avec le tampon d’élutriation lorsque cela est nécessaire. 
		Remarque : Afin de s’assurer que toutes les cellules sont entrés dans le système, laisser le réservoir de stockage devenir presque vide avant chaque remplissage du réservoir, la première fois. Après la première recharge, il ne sera pas nécessaire d’attendre que le réservoir de devenir presque vide. Aussi, ne jamais laisser la cuve se vide car cela va créer des bulles et la contre-pression dans le système.</li>
		<li>Une fois 50 mL ont été recueillis pour W1, simultanément changer la vitesse à 821 g x et déplacer le tube de sortie pour le tube à fond conique étiqueté W2 et recueillir 50 mL plus à cette vitesse.</li>
		<li>Continuer à changer la vitesse et recueillant des fractions comme il est indiqué dans le tableau 1. Assurez-vous qu’il y a des médias dans le réservoir du réservoir et garder les tubes coniques sur la glace à tout moment. Enfin, ajuster la fenêtre de visualisation en tournant lentement le bouton vers la droite à mesure que la vitesse diminue.</li>
		<li>Une fois que toutes les fractions de 20 ont été prélevées, arrêter la centrifugeuse et recueillir 50 mL dans le tube à fond conique marqué STOP.</li>
	</ol></li></ol> 6. Flushing du système élutriation <ol><li>après la centrifugeuse a cessé complètement rincer le système en plaçant le tube réservoir dans la bouteille de 1 L d’eau stérilisés à l’autoclave et le tube de sortie dans la bouteille des déchets.
	<ol><li>Mettre la vitesse de la pompe jusqu'à 50 mL/min et laisser l’eau couler à travers le système jusqu'à ce qu’elle est déchargée.</li>
	</ol></li> <li>Tourner la pompe, retirer le tuyau d’entrée et de sortie de l’Assemblée de dégagement rapide et tirez sur la broche du câble d’ancrage.
	<ol><li>Supprimer l’assembly de dégagement rapide du rotor. 
		NOTE : Selon ce que la centrifugeuse sera utilisée pour, le système d’élutriation peut être laissé maintenant comme c’est. Dans le cas contraire, l’ensemble peut être pris vers le bas dans l’ordre inverse comme décrit ci-dessus. La chambre d’élutriation peut être retirée de l’Assemblée de dégagement rapide et nettoyée entre s’exécute à l’aide d’un bain à ultrasons. Cela supprime les débris et les contaminants de la paroi de la chambre qui peut affecter négativement les pistes plus tard.</li>
	</ol></li></ol> 7. L’analyse des Fractions et Collection du G1 ou G2/M piscines.
 Remarque : pour démontrer l’efficacité d’élutriation, chaque fraction est analysée pour globules, le diamètre de la cellule et la teneur en ADN, et piscines sont créés des cellules dans les phases G1 ou G2/M pour les analyses immunoblot, comme décrit dans Représentant des résultats. Cette section de protocole décrit comment faire pour créer ces pools et les préparer à usage expérimental.
<ol><li>Spin chaque fraction à 2000 x g pendant 5 min à 4 ° C et aspirer hors tampon élutriation.</li>
	<li>Fractions de combiner ensemble afin d’obtenir une piscine de phase G1 et un pool de phases G2/M.
	<ol><li>Pour le G1 phase piscine, remettre en suspension les fractions qui ont été recueillies dans la gamme de vitesse de 788 x g à 661 x g (F1 - F5) dans 1 mL de solution saline de tampon phosphate (PBS) et transférez dans un tube conique de 15 mL au total. Pour le pool de phases G2/M, remettre en suspension les fractions qui ont été recueillies dans la gamme de vitesse de 387 x 333 x g (F17 - F20) et de g.</li>
		<li>Spin down cellules à 2000 x g pendant 5 min à 4 ° C et aspirer hors PBS.</li>
	</ol></li> <li>Remettre en suspension des cellules dans 10 mL de milieu de culture et d’effectuer un comptage cellulaire.</li>
	Prélever une partie aliquote de chaque poule à analyser l’ADN contenu via l’iodure de propidium et flux de l’analyse cytométrique 15 de <li>. 
	NOTE : Le reste de chaque pool peut être utilisé pour d’autres expériences.</li>
</ol>

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</ol>

Anisha Kothari est actuellement dans le département de biologie cellulaire et moléculaire à l’hôpital St. Jude Children Research.

Nous avons décrit une méthode pour l’obtention de primaire toutes les cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire à l’aide de la CCE. Dans des conditions optimales une population essentiellement pure des cellules en phase G1 et une population fortement enrichie de cellules en phases G2/M pourraient être facilement obtenus avec d’excellents rendements et cellules fortement enrichis en phase S peuvent également être obtenus si vous le souhaitez. Les résultats présentés ici ont été obtenus à l’aide d’un primair...

Les cellules cultivées généralement croissent de façon asynchrone et des cellules individuelles sont présents dans les différentes phases du cycle cellulaire. Certains organismes présentent naturellement synchrone des cycles cellulaires ou peuvent être synchronisées par des stimuli physiologiques spécifiques. Par exemple, les noyaux dans les plasmodes géants du myxomycète Physarum polycephalum divisent dans un mode très synchrone1et les cellules de l’algue que Desmodesmus quadricauda peuvent être synchronisés par une alternance de lumière et l’obscurité périodes2. Tandis que ces organismes offrent des particularités expérimentales, ils modèle insuffisamment les complexités des cellules de mammifères. La possibilité de synchroniser artificiellement les populations cellulaires de mammifères a été essentiel pour faire progresser notre compréhension de la régulation du cycle cellulaire et la base moléculaire du cycle cellulaire points de contrôle. Méthodes courantes sont la privation de sérum, bloc chimique et libération ou d’exploiter les caractéristiques physiques3,4. Retrait du sérum entraîne souvent des cellules entrer dans le repos, et le rajout du sérum favorise rentrée cycle cellulaire en phase G15. Des inhibiteurs chimiques comprennent des agents tels que la thymidine excessive ou hydroxyurée qui bloquent les cellules à la limite de G1/S ou inhibiteurs de microtubules qui arrêtent généralement les cellules en phase M3,4. Les approches qui exploitent les caractéristiques physiques comprennent mitotique shake-off qui peut être utilisé pour enrichir des cellules mitotiques, car ils sont moins adhérents que de cellules interphasiques6. Cependant, toutes ces techniques présentent des inconvénients potentiels. Par exemple, pas tous les types de cellules maintiennent la viabilité en l’absence de sérum ou de la présence d’inhibiteurs chimiques et le rendement des cellules après que shake arrêt mitotique est limité sans synchronisation préalable avec inhibiteurs mitotiques.
À l’exception des premiers cycles cellulaires embryonnaires, où cellules diminuent progressivement en taille comme ils divisent7, avançant à travers le cycle de la plupart des cellules subissent des phases de croissance et de plus en plus. Cette propriété est exploitée en technique d’élutriation centrifuge contre-courant (CCE), qui peut être utilisée pour séparer les cellules différant par taille et par conséquent au cycle cellulaire phase8,9. Au cours de la CCE, les cellules sont sous l’influence de deux forces opposées : la force centrifuge, qui entraîne les cellules de l’axe de rotation et la vitesse du fluide (contre-courant), qui entraîne les cellules vers l’axe de rotation (Figure 1). Les cellules dans la chambre d’élutriation atteint une position d’équilibre où ces forces sont égales. Les principaux facteurs dictant la position d’équilibre sont la densité et le diamètre de la cellule. Comme l’écoulement de la solution tampon est augmenté et la force de traînée de contre-courant l’emporte sur la force centrifuge, un nouvel équilibre est établi, provoquant un changement dans la position des cellules à l’intérieur de la chambre. Toutes les cellules sont décalés vers la sortie de la chambre, ayant pour résultat plus petits laissant la chambre tout d’abord, alors que les plus grosses cellules restent dans la chambre jusqu'à ce que le taux de contre-courant est augmenté suffisamment pour promouvoir leur sortie. Les cellules s’échappant de la chambre d’élutriation avec hausses consécutives des taux de contre-courant peuvent être collectées dans les fractions spécifiques et chaque fraction contient des cellules de croissance séquentielle de tailles. Au lieu de mener élutriation avec des augmentations des taux de contre-courant, séquentiel diminue en force centrifuge en diminuant la vitesse de centrifugation permettra d’atteindre le même résultat. Le processus d’élutriation nécessite optimisation selon le type de cellule, élutriation tampon employées et l’appareillage spécifique utilisé. Le taux de sédimentation des cellules dans ces conditions est mieux décrit par la Loi de Stokes : SV = [d2ρp- ρ (m) / 18η] .ω2r, où SV = vitesse de sédimentation ; d = diamètre de la particule ; Ρ,p = masse volumique de la particule ; Ρm = masse volumique de la mémoire tampon. Η = viscosité de la mémoire tampon. Ω = vitesse angulaire du rotor ; et r = position radiale de la particule. Ainsi, la SV est proportionnelle à la densité et le diamètre de la cellule, et diamètre étant déclenché à la seconde puissance, elle contribue d’une manière plus significative que la densité qui est généralement constante au cours du cycle cellulaire.
Un avantage important du CCE est que les cellules ne sont pas soumises à des conditions difficiles de traitement chimique ou de la privation alimentaire et peuvent être récupérés avec un excellent rendement essentiellement non perturbée. Une exigence est que les cellules en question subissent une augmentation significative de diamètre, d’au moins 30 %, car ils parcourent le cycle cellulaire. Le principal inconvénient est le coût de la centrifugeuse spécialisée, rotor et accessoires. Néanmoins, la possibilité de préparer les cellules enrichies en phases de cycle de cellules spécifiques par le CCE a grandement facilité les recherche sur le cycle cellulaire chez les organismes de levure en cellules mammifères9,10. Par ailleurs, les avancées récentes élargissent utilisations à la séparation des cellules de sain par rapport aux tissus cancéreux, la séparation des différents types de cellules dans les mélanges hétérogènes et à la production de types spécifiques de cellules pour immunothérapie9.
Notre intérêt majeur a été pour comprendre le mécanisme d’action du microtubule ciblant les agents (MTA) tels que les alcaloïdes de la Pervenche et taxanes. Ces médicaments étaient censés agir exclusivement lors de la mitose, bloquant la fonction de microtubules du fuseau11,12, mais des données récentes suggèrent qu’ils peuvent viser aussi interphase microtubules13,14. Nous avons récemment rapporté que les cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë (tous) subissent la mort en soit la phase G1 ou au m phase que traités par vincristine et d’autres MTA dans un cycle cellulaire-dépendant15. La capacité de séparer toutes les cellules en phases de cycle de cellules différentes par le CCE a contribué pour parvenir à cette conclusion. Dans cet article, nous décrire les détails techniques et offrent des conseils pratiques pour l’application du CCE à la préparation des primaires toutes les cellules en phases de cycle de cellules différentes.

<table><tbody><tr><td>Solution saline équilibrée de Hanks</td><td>Lonza</td><td>10-508Q Bouteille de</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Sérum bovin Fetal Plus</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td>Bouteille de 500 mL</td></tr><tr><td>Acide 2-napthol-6,8-disulfonique Sel dipotassique</td><td>Acros Organics</td><td>212-672-4</td><td>100 g en poudre</td></tr><tr><td>50 mL Tubes conciaux</td><td>Denville Scientifics</td><td>C1062-P</td><td>500/caisse</td></tr><tr><td>Membrane PES 0.22 et micro ; Unité de filtrage</td><td>m Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>250/paquet</td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI w/ Elut. Centrifugeuse non IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14544</td><td>compatible avec le système d’élutriation</td></tr><tr><td>Kit de rotor d’élutriateur JE 5.0</td> Kit de rotor <td>Beckman Coulter</td><td>356900</td><td>qui comprend le rotor, la clé hexagonale à poignée en T, l’ensemble de dégagement rapide (sans la chambre d’élutriation), le câble d’ancrage et l’ensemble stroboscopique</td></tr><tr><td>Chambre, standard, 4 ml, « A"Beckman</td> <td>Coulter</td><td>356943</td><td>Chambre d’élutriation standard&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tête de pompe Masterflex L/S Easy-Load</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Entraînement à vitesse variable Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07528-10</td><td></td></tr><tr><td>Tube de pompe en silicone durci au platine Masterflex BioPharm, L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96420-16</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1,5 Aiguille Precision Glide</td><td>BD</td><td>305127</td><td>aiguilles stériles à usage unique</td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok seringue</td><td>BD</td><td>309604</td><td>seringues stériles à usage unique</td></tr><tr><td>Vi-Cell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>383556</td><td></td></tr><tr><td>tampon de coloration PI/RNase</td><td>BD Pharmingen</td><td>550825</td><td>tampon de coloration à l’iodure de propidium/RNase</td></tr><tr><td>cycline B1 (GNS1) anticorps monoclonal IgG</td> de <td>souris Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-245</td><td></td></tr><tr><td>cycline D1 (DCS-6) anticorps monoclonal IgG</td><td>de souris Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20044</td><td></td></tr><tr><td>P-Rb (S807/811) (D20B12) Anticorps monoclonal de lapin XPR</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>8516s</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Anticorps monoclonal de lapin</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>2118s</td><td></td></tr><tr><td>Conjugué IgG (H+L)-HRP anti-souris de chèvre</td><td>BioRad</td><td>170-6516</td><td></td></tr><tr><td>Conjugué IgG (H+L)-HRP de chèvre</td><td></td><td>Référence 170-6515</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation des cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en phases de cycle de cellules différentes par élutriation centrifuge

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

La possibilité de synchroniser les cellules a été essentiel pour faire progresser notre compréhension de la régulation du cycle cellulaire. Les techniques courantes utilisées incluent la privation de sérum ; produits chimiques qui arrêtent les cellules lors des phases d’un cycle cellulaire différent ; ou l’utilisation de mitotique shake-off qui exploite leur adhérence réduite. Cependant, tous ces ont des inconvénients. Par exemple, la privation de sérum fonctionne bien pour les cellules normales, mais moins bien pour les cellules de la tumeur avec compromis cell cycle points de contrôle en raison de l’oncogène activation ou tumor suppressor perte. De même, populations cellulaires traité chimiquement peuvent abriter des dommages causés par les drogues et montrent des altérations liées au stress. Une technique qui contourne ces problèmes est élutriation centrifuge contre-courant (CCE), où les cellules sont soumis à deux forces opposées, la force centrifuge et vitesse du fluide, qui se traduit par la séparation des cellules sur la base de la taille et la densité. Étant donné que les cellules avançant à travers le cycle typiquement agrandir, CCE peut être utilisé pour séparer les cellules en phases de cycle de cellules différentes. Ici, nous appliquons cette technique à des cellules de leucémie lymphoblastique aiguë primaire. Dans des conditions optimales, une population essentiellement pure des cellules en phase G1 et une population fortement enrichie de cellules en phases G2/M peuvent être obtenus avec un excellent rendement. Ces populations de cellules sont idéales pour étudier des mécanismes dépendants du cycle cellulaire d’action des médicaments anticancéreux et pour d’autres applications. Aussi, nous montrent comment les modifications à la procédure standard peut provoquer des performances sous-optimales et discuter les limites de la technique. La méthodologie détaillée présentée devrait faciliter l’application et à l’exploration de la technique à d’autres types de cellules.

Primaire toutes les cellules (3-4 x 108) ont été soumis à élutriation centrifuge et recueilli dans deux fractions de lavage et vingt principales fractions, comme décrit dans le protocole. Le tableau 1 montre les données représentatives où le nombre total de cellules dans chacune des fractions ainsi que la vitesse du rotor correspondantes est présenté. Dans l’ensemble rendement dépassait généralement 80 %. Mesure du diamètre des cellules dans les différentes fractions a confirmé...

Ce protocole décrit l’utilisation d’élutriation centrifuge pour séparer les cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en phases de cycle de cellules différentes.

Préparation des cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en Phases de Cycle de cellules différentes par élutriation centrifuge

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules dans différentes phases du cycle cellulaire en utilisant l’élutriation centrifuge. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des thérapies anticancéreuses. Parce que l’isolement des cellules en phases distinctes permet d’interroger les effets dépendants de la phase des composés anticancéreux.Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de séparer les cellules en phases spécifiques en utilisant des propriétés physiques, plutôt que des perturbations chimiques. Pour commencer l’expérience, installez l’ensemble stroboscopique dans la centrifugeuse de sorte que le cordon d’alimentation soit alimenté hors de la chambre par l’orifice situé à gauche. Ajustez la lampe du flash stroboscopique de manière à ce qu’elle s’aligne avec la fenêtre de visualisation, lorsque la centrifugeuse est fermée.Fixez l’ensemble en place, en serrant deux vis à tête cruciforme, en haut de chaque support. Et puis en serrant les vis à oreilles au bas du support. Branchez le cordon d’alimentation dans le port d’alimentation stroboscopique, situé à l’arrière de la centrifugeuse.Ensuite, placez les rotors directement sur le moyeu d’entraînement de la centrifugeuse et fixez-le fermement à l’aide d’une clé hexagonale à poignée en T. Ensuite, placez l’ensemble contenant la chambre d’élutriation, le contrepoids, l’ensemble de joint rotatif et une plaque de montage sur le rotor. Appuyez uniformément vers le bas, en plaçant une main sur la chambre d’élutriation et l’autre main sur le contrepoids, jusqu’à ce que les boulons du rotor s’enclenchent.Placez la goupille, située à une extrémité du câble, dans le trou de l’ensemble de joint rotatif. Et fixez le trou de l’œil, à l’autre extrémité, avec l’une des vis à tête cruciforme, fixée sur le support pour connecter le câble d’ancrage. Pour assembler le système d’écoulement, pour pomper le tampon dans et hors de la chambre d’élutriation, connectez un tube de taille 16 à une pompe à vitesse variable.Insérez une extrémité libre de ce tube à travers un orifice situé en haut à gauche de la chambre de centrifugation, de sorte qu’il pénètre dans la chambre. Fixez un raccord à l’extrémité libre de ce tube, puis insérez le raccord dans le trou d’entrée de l’ensemble de joint rotatif. Enfin, insérez le tube de sortie, à travers un orifice, pour le fixer au tube de transfert en haut de l’ensemble de joint rotatif.Une fois le système d’élutriation assemblé, stérilisez-le en plaçant l’autre extrémité libre du tube d’entrée dans une bouteille de 500 millilitres, remplie d’eau de Javel à 5 %. Et en plaçant le tube de sortie dans une bouteille de déchets vide d’un litre. Ensuite, allumez la pompe et laissez l’eau de Javel s’écouler tout au long du système d’élutriation, jusqu’à ce qu’elle soit pompée dans la bouteille à déchets.Maintenant, allumez la centrifugeuse et laissez-la atteindre la vitesse maximale désignée pour libérer les bulles et la contre-pression. Une fois la vitesse réglée atteinte, arrêtez la centrifugeuse. Une fois que le rotor s’est complètement arrêté, ouvrez le couvercle et inspectez la chambre pour détecter toute fuite.Ensuite, de la même manière, comme décrit précédemment, faites couler de l’eau stérile dans le système pendant 10 minutes. Après avoir rincé à l’eau, remplacez le réservoir d’eau par une bouteille en verre stérile remplie de 100 millilitres de tampon d’élutriation. Placez le tube d’entrée dans cette bouteille, de manière à ce qu’il soit tout en bas.Démarrez la centrifugeuse et laissez la mémoire tampon s’écouler dans le système. Une fois que la bouteille du réservoir est presque vide et que l’eau est complètement évacuée du système, déplacez le tube de sortie de la bouteille à déchets dans le réservoir afin que le tampon soit recyclé en continu dans le système. Enfin, allumez la lampe stroboscopique et tournez le bouton d’élutriation vers l’extrême gauche.Maintenant, ajustez la fenêtre de visualisation en tournant lentement le bouton vers la droite, de sorte que la chambre d’élutriation soit clairement visible et que la lumière stroboscopique soit synchronisée avec la vitesse du rotor. Préparez l’échantillon de cellule comme décrit dans le protocole de texte. Ajoutez les cellules remises en suspension dans la bouteille-réservoir contenant le tampon d’élutriation de recyclage.Laissez les cellules entrer dans le système et atteindre l’équilibre dans la chambre d’élutriation. Pour vous assurer que toutes les cellules sont retenues dans la chambre, prélevez une goutte de l’éluant sur une lame de verre et observez-la au microscope. Si l’échantillon est dépourvu de cellules intactes, cela confirme la rétention dans la chambre.Une fois que toutes les cellules sont entrées dans la chambre et qu’une limite distincte dans la partie la plus blanche de la chambre, contenant les cellules et l’équilibre, commence à collecter des fractions. Déplacez le tube de sortie vers un tube conique pré-refroidi de 50 millilitres, étiqueté W1. Récupérez 50 millilitres de tampon d’élutriation dans ce tube et stockez-le sur de la glace. Peu de temps après avoir collecté la fraction W1, abaissez la vitesse de la centrifugeuse à 821 G.Et déplacez le tube de sortie vers le tube conique, étiqueté W2, et collectez 50 millilitres de plus à cette vitesse.Continuez à changer la vitesse et à collecter des fractions. Assurez-vous qu’il y a du fluide dans le réservoir et stockez toujours les fractions collectées sur de la glace. Une fois que toutes les fractions ont été collectées, arrêtez la centrifugeuse et collectez 50 millilitres dans un tube conique, étiqueté stop.Des cellules granulaires sont prélevées dans chacune des fractions et utilisent une analyse en aval, comme la cytométrie en flux ou le western blot, au besoin. Un graphique linéaire montrant le diamètre moyen des cellules en fractions d’élutriation successives est présenté. Notez que plus le diamètre de la cellule est grand, plus le nombre de fractions auquel elle élue est élevé.Les résultats de l’analyse de tri des cellules activées par fluorescence montrent la teneur en ADN des cellules dans chacune des 20 fractions d’élutriation. Les premières fractions, F1 à F5, contiennent presque exclusivement des cellules avec du contenu en ADN 2N représentant des cellules en phase G1. Un mélange de cellules dans les phases G1 et S a été observé dans les fractions intermédiaires, F6 à F9. Et des cellules avec un contenu en ADN 4N, représentant des cellules de G2 à M, ont été observées à partir de F10.On voit ici les résultats du western blot obtenus en sondant les niveaux de protéines liées au cycle cellulaire dans des fractions regroupées de cellules en phase G1 et en phase G2 à M. Comme prévu, les teneurs en phospho-Rb et en cycline B ont été plus élevées dans les rangées G2 à M que dans les rangées G1. Le signal de la cycline D un était faible, mais néanmoins détectable dans le pool G1 et indétectable dans le pool G2 à M.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de prendre son temps et de s’assurer que le système d’élutriation est correctement assemblé et que tous les matériaux et solutions sont préparés. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse du cycle cellulaire, les tests de viabilité cellulaire et les immunoblots peuvent être effectuées afin d’interroger comment les composés thérapeutiques peuvent agir d’une manière dépendante de la phase du cycle cellulaire.

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Préparation des cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en Phases de Cycle de cellules différentes par élutriation centrifuge (Vidéo) | JoVE Journal

Préparation des cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en Phases de Cycle de cellules différentes par élutriation centrifuge

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