La surexpression et la purification de l'être humain Cis -prenyltransférase dans Escherichia coli

L’objectif global de ce protocole est de surexprimer et de purifier la cis-prényltransférase humaine optimisée pour les codons dans des conditions non dénaturantes et d’analyser son activité enzymatique. La procédure est démontrée avec la cis-prényltransférase eucaryote à longue chaîne déhydrodolichyl diphosphate synthase, ou DHDDS. Cette méthode peut faire progresser notre compréhension de la synthèse des isoprénoïdes et fournir des informations clés sur le mécanisme physiopathologique de la rétinite pigmentaire liée aux mutations dans les DHDDS.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple, rentable et permet de gagner du temps. Il peut également être généralisé pour la production en grande quantité d’autres protéines cis-prényltransférases. Commencez cette procédure par le clonage d’une expression de DHDDS humain, comme décrit dans le protocole texte.

Remettez les cellules en suspension dans le tampon A, un microgramme par millilitre de DNase I et un mélange d’inhibiteurs de protéase. Ensuite, homogénéisez les cellules remises en suspension à l’aide d’un homogénéisateur en verre téflon. Perturbez les cellules avec un microfluidiseur ou équivalent à 12 000 à 15 000 psi.

Ensuite, centrifugez le lysat cellulaire à 40 000 fois g pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. Récupérer le surnageant contenant la fraction soluble. Chargez le surnageant sur une colonne de chromatographie d’affinité métallique immobilisée au cobalt de cinq à 10 millimètres avec de l’imidazole de 10 millimolaires.

Après l’avoir chargée dans un appareil de chromatographie liquide à protéines rapides, effectuez un lavage minutieux de la colonne avec le tampon A dans 10 millimolaires d’imidazole afin de réduire la liaison aux protéines non spécifiques. Commencer le programme FPLC. Éluer les protéines surexprimées avec le tampon A complété par 250 millimolaires d’imidazole.

Après l’élution, retirez l’imidazole à l’aide de 53 millilitres d’une colonne de dessalage préparative équilibrée avec le tampon A.Ensuite, ajoutez de la protéase TEV marquée à l’hexahistidine aux protéines éluées pour éliminer leur fusion DHDDS de thiorédoxine marquée à l’hexahistidine. Incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, chargez les protéines clivées sur une colonne de chromatographie d’affinité métallique immobilisée au cobalt équilibrée avec le tampon A complété par cinq millimolaires d’imidazole.

Prélevez le flux pour éliminer la thiorédoxine et la protéase TEV marquées à l’hexahistidine clivées. Concentrez le débit à une vitesse comprise entre trois et quatre millilitres à l’aide d’un filtre centrifuge de 30 kilodaltons de poids moléculaire. Ensuite, chargez la protéine concentrée sur une colonne de chromatographie d’exclusion de taille Superdex 200 équilibrée avec le tampon A pour la purification finale.

Placez les échantillons dans un rack à 96 puits dans un collecteur de fractions. La protéine élue sous forme de dimère. Sélectionnez les fractions pertinentes en comparant le profil d’élution à une courbe d’étalonnage de colonne.

À ce stade, évaluez la pureté de la préparation à l’aide de SDS-PAGE. Enfin, déterminez la concentration protéique nécessaire pour l’expérimentation en aval et la congélation instantanée des aliquotes de protéines concentrées purifiées dans de l’azote liquide. Conservez les aliquotes à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation.

Pour s’assurer de la capacité de la protéine à supporter les cycles de gel-dégel, décongelez une aliquote des protéines congelées. Centrifuger l’aliquote à 21 000 fois g pendant 10 minutes pour éliminer les agrégats insolubles. Après la centrifugation, recueillir le surnageant.

Ensuite, chargez les protéines sur une colonne analytique Superdex 200 pré-équilibrée avec TNXB à l’aide d’un système de chromatographie liquide ultra performant. Surveillez la fluorescence du tryptophane pour détecter le profil d’élution de la protéine. Assurez-vous d’avoir une courbe d’étalonnage valide pour l’évaluation de la masse moléculaire, qui est disponible auprès des fabricants de colonnes SEC.

Pour garantir l’activité de la protéine purifiée, mélangez d’abord cinq micromolaires de DHDDS purifiés avec 10 micromolaires de FPP et 50 micromolaires de C14 IPP. Amorcer la réaction dans le tampon A avec 0,5 millimolaire de chlorure de magnésium à 22 à 30 degrés Celsius. Prélever 15 échantillons de microlitres de la réaction à zéro, deux, quatre et six heures après l’extinction immédiate de la réaction par l’ajout de 15 microlitres de tampon A complété par 20 millimolaires d’EDTA.

Ensuite, ajoutez un millilitre de 1-butanol saturé d’eau et tourbillonnez soigneusement pour extraire les produits de réaction. Le protocole peut être arrêté ici, et les échantillons peuvent être conservés pour une lecture ultérieure. Ensuite, ajoutez le cocktail de scintillation aux échantillons.

À l’aide d’un compteur à scintillation, quantifier les produits de réaction en phase butanol englobant le C14 ainsi que la radioactivité de 15 microlitres de la réaction, représentant la radioactivité totale. Enfin, calculez l’incorporation nette de la PIP en C14 à chaque point temporel en calculant le pourcentage utilisé à partir des concentrations totales de PIP en C14 et tracez les résultats en fonction du temps. On s’attend à ce qu’une augmentation de l’incorporation nette de l’IPP C14 soit attendue avec le temps.

Les échantillons obtenus à chaque étape de purification sont présentés ici. Cette analyse SDS-PAGE montre la purification par étapes des DHDDS, ce qui permet d’obtenir un produit hautement purifié. Ce chromatogramme représente les résultats de la chromatographie analytique d’exclusion stérique de l’enzyme purifiée, révélant que la protéine n’est observée que comme un homodimère.

Ici, la flèche indique le volume du vide. Un test d’activité représentatif dépendant du temps révèle que l’incorporation de l’IPP en C14 augmente clairement sur six heures, vérifiant que l’enzyme purifiée est fonctionnelle. Une fois maîtrisée, cette préparation simple peut être réalisée en deux à trois jours, ce qui permet d’obtenir une enzyme très pure et active.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de surexprimer et de purifier la cis-prényltransférase humaine d’E. coli et de mesurer son activité en fonction du temps.