Name: Haut débit séquençage parallèle à la mesure de remise en forme de Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants durant Golden syrien Hamster Infection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Découvrez le séquençage transposon haut débit pour identifier les gènes de virulence de Leptospira interrogans chez le hamster doré syrien. Cette méthode permet de cribler de nombreux mutants avec peu d'animaux.

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Ce travail a été soutenu par un prix de mérite d’affaires des anciens combattants (à D.A.H.) et un Institut National de la santé accorde le R01 AI 034431 (à D.A.H.).

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Bien que les résultats de notre expérience pilote pour hamster contestée par voie intrapéritonéale avec 42 L. interrogans mutants sont présentés17, gageons que plus grandes piscines de mutants peuvent être projetés par Tn-suiv. Parce que la fréquence des transconjugants est faible (100-200 transconjugants/accouplement), plusieurs accouplements sont nécessaires pour générer un nombre suffisant de mutants pour les grandes expériences de Tn-Seq. Maintenir un grand nombre de mutants dans des ...

Identification des gènes de virulence pour certaines bactéries, comme Leptospira spp., est difficile en raison du nombre limité d’outils génétiques disponibles. Une approche couramment utilisée est la création d’une collection de mutants par mutagenèse aléatoire transposon, suivie de l’identification du site d’insertion dans chaque mutant et test de virulence des mutants de transposon individuels dans un modèle animal. Cette approche est longue et coûteuse et nécessite un grand nombre d’animaux.
Lorsque la mutagénèse aléatoire a été d’abord développé pour le pathogène Leptospira interrogans, gènes impliqués dans la virulence ont été identifiés en testant différents mutants dans un modèle animal1. Mutants ont été sélectionnés selon des critères comme leurs rôles potentiels dans la signalisation ou la motilité ou leur prédit la membrane externe ou surface emplacement. Comme la majorité des leptospires gènes codent pour des protéines hypothétiques de fonction inconnue2, sélection des mutants basé sur ces limites de critères la capacité à découvrir des gènes de virulence de leptospires roman.
Plus récemment, piscines de mutants de transposon L. interrogans ont été examinés pour l’agent infectieux dans les modèles3hamster et souris. Chaque animal a été contestée avec une piscine de 10 mutants. Infectiosité d’un mutant a été marquée comme étant positif s’il a été détecté par PCR des cultures obtenues à partir de sang et les reins. Test de PCR a été laborieux car il exigeait une réaction de PCR individuelle pour chaque mutant dans la piscine. Parce que la fréquence de chaque mutant dans les cultures n’avait pas été évaluée, l’approche était biaisée vers l’identification des mutants très atténués.
Nous décrivons un transposon séquençage (Tn-Seq) technique, comme une stratégie pour dépister plus efficacement les gènes de virulence. TN-seq consistant en la création d’une bibliothèque de mutants par mutagénèse du transposon suivie par séquençage parallèle massive4,5,6. Brièvement, transposon mutants sont mis en commun, inoculés dans animaux et par la suite récupérés de différents organes (sortie piscines). L’ADN de la piscine de sortie est extraite et digéré par les enzymes de restriction ou cisaillée par sonication. Deux cycles de PCR ciblant les jonctions des sites d’insertion de transposon sont effectuées. Cette étape permet l’ajout de l’adaptateur nécessaire pour le séquençage. Les produits PCR obtenus sont analysés par séquençage haut-débit pour identifier le site d’insertion de transposon de chaque mutant de la piscine ainsi que de leur abondance relative, qui est comparé à la composition initiale du bassin de mutant.
Le principal avantage de cette approche est la capacité à l’écran simultanément un grand nombre de mutants avec un petit nombre d’animaux. TN-Seq n’exige pas la connaissance préalable des sites d’insertion de transposon qui augmente les chances de découvrir des nouveaux Leptospira-certains gènes impliqués dans la virulence avec moins de temps et une plus grande efficacité. Parce que le fardeau de leptospires dans les tissus est relativement élevée en rongeur modèles susceptibles d’être mortelles infections (typiquement 104 à 108 bactéries/g de tissu)7,8,9 , ainsi que dans des hôtes réservoirs 10,11, les tissus peuvent être analysés directement sans avoir à la culture, réduire les biais en raison de la croissance in vitro .
Dans les études de Tn-Seq avec la plupart des bactéries pathogènes décrites à ce jour, la haute fréquence de mutagenèse insertionnelle permis infection avec grandes piscines contenant des mutants ayant collectivement plusieurs insertions transposon rapprochés au sein de chaque gène4 ,12,13,14. TN-Seq a également été développé pour une bactérie dont la fréquence de la mutagénèse est beaucoup inférieur6. Avec Leptospira, une bibliothèque de mutants de transposons peut être générée en introduisant le transposon sur un plasmide mobilisable par conjugaison tel que décrit par Slamti et al.15. Toutefois, la fréquence de la mutagénèse transposon de L. interrogans est faible. Lorsque le transposon Himar1 a été introduit dans un plasmide conjugatif, la fréquence de transconjuguant a été signalée comme seuls 8,5 x 10-8 par destinataire de cellules souche de L. interrogans16 Lai et est susceptible d’être de même pauvre avec la plupart des autres souches de L. interrogans. Le protocole décrit ici est en partie basé sur conçu pour Borrelia burgdorferi, dont la fréquence de la mutagénèse insertionnelle transposon est également faible6.
Pour notre expérience pilote avec le protocole17, nous avons mené mutagénèse du transposon avec L. interrogans serovar Manilae souche L495 en raison du succès des autres groupes à isoler des mutants d’insertion de transposon dans la souche ainsi que sa faible DL50 (dose létale) pour virulence1. Nous avons projeté 42 mutants par Tn-Seq et identifié plusieurs candidats mutants défectueux dans la virulence, dont deux avec insertions dans un gène de l’adénylate cyclase du candidat. Une évaluation individuelle des deux mutants chez les hamsters ont confirmé qu’ils étaient déficients en virulence17.

<table><tbody><tr><td>Sulfate de kanamycine à partir de Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>Acide 2,6-diaminopimélique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1377</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de spectinomycine pentahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Axio Lab A1 microscope avec condensateur à fond noir</td><td>Zeiss</td><td>490950-001-000</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification de sang et de tissus DNeasy</td><td>Qiagen</td><td>69504/69506</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Purification PCR</td><td>Qiagen</td><td>28004/28006</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de purification PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104/28106</td><td></td></tr><tr><td>Modèle 505 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-505</td><td></td></tr><tr><td>2.5" Corne de tasse</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-4625</td><td></td></tr><tr><td>Perle Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td>Étape 3.1.2.4</td></tr><tr><td>Désoxynucléotidyltransférase terminale</td><td>Promega</td><td>M828C</td><td></td></tr><tr><td>Master mix Phusion</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531</td><td>Préparation des banques génomiques, étape 3.4.</td></tr><tr><td>DreamTaq Master Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>K9011/K9012</td><td>Identification du site d’insertion du transposon, étape 1.2.</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>ddCTP</td><td>Affymetrix/ USBProducts</td><td>77112</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermocycleur</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 fluorimètre</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>étape 3.6.</td></tr><tr><td>Kit de dosage Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851/Q32854</td><td>étape 3.6.</td></tr><tr><td>Technologies de vie</td> des <td>tubes d’essai Qubit</td><td>Q32856</td><td>étape 3.6.</td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 (1X)</td><td>Gibco</td><td>20012-027 20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel jetable No10</td><td>Feather</td><td>2975#10</td><td></td></tr><tr><td>Plastique K2 EDTA 2 ml tubes</td><td>BD vacutainer</td><td>367841</td><td></td></tr><tr><td>seringue U-100 avec 26G x &frac12 ; &rdquo; aiguille</td><td>BD vacutainer</td><td>329652</td><td>défi IP, étape 2.2.1.</td></tr><tr><td>Seringue à embout Luer-Lok de 3 mL</td><td>BD vacutainer</td><td>309657</td><td>Ponction cardiaque, étape 2.4.2.</td></tr><tr><td>Aiguille 25G X 5/8"</td><td>BD vacutainer</td><td>305901</td><td>Ponction cardiaque, étape 2.4.2.</td></tr><tr><td>Base en verre fritté de 25 mm avec bouchon</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002502</td><td>Système d’unité de filtration, étape 1.1.7.</td></tr><tr><td>Pince à ressort en aluminium de 25 mm</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002503</td><td>Système d’unité de filtration, étape 1.1.7.</td></tr><tr><td>Entonnoir en verre borosilcate de 15 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002514</td><td>Système d’unité de filtration, étape 1.1.7.</td></tr><tr><td>Fiole Erlenmeyer à bras latéral de 125 ml</td><td>Système d’unité de filtration EMD Millipore</td><td>XX1002505</td>, <td>étape 1.1.7.</td></tr><tr><td>Filtre en acétate-cellulose VVPP (taille des pores 0,1 mm ; diamètre 25 mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>VVLP02500</td><td></td></tr></tbody></table>

haut débit séquençage parallèle à la mesure de remise en forme de leptospira interrogans transposon insertion mutants durant golden syrien hamster infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un transposon séquençage (Tn-Seq) technique pour identifier et quantifier des mutants de Leptospira interrogans altérés de remise en forme au cours de l’infection de hamsters syriens dorés. TN-Seq combine la mutagénèse aléatoire transposon avec la puissance de la technologie de séquençage haut-débit. Animaux est mis au défi avec une piscine de mutants transposon (entrée piscine), suivie de la récolte du sang et des tissus quelques jours plus tard afin d’identifier et de quantifier le nombre de mutants dans chaque organe (sortie piscines). Les piscines de sortie sont comparés à la piscine d’entrée afin d’évaluer l’aptitude en vivo de chaque mutant. Cette approche permet le dépistage d’une grande piscine de mutants dans un nombre limité d’animaux. Avec des modifications mineures, ce protocole peut être effectué avec n’importe quel modèle animal de la leptospirose, modèles hôte réservoir comme les rats et les infections aiguës comme les hamsters, ainsi que des études in vitro . TN-Seq fournit un outil puissant à l’écran pour des mutants présentant des défauts de remise en forme in vivo et in vitro .

Création d’une bibliothèque de mutants de transposon dans L. interrogans par conjugaison nécessite une unité de filtration, comme illustré à la Figure 1. Nous avons récupéré des transconjugants 100-200 de chaque croisement.
Le site d’insertion de transposon est identifié dans chaque mutant par séquençage du produit PCR généré par PCR semi aléatoire qui cible à la fin du transposon et hôte a...

Nous décrivons ici une technique qui associe une mutagenèse par transposon séquençage haut-débit pour identifier et quantifier des mutants de leptospires transposon dans les tissus après une contestation des hamsters. Ce protocole peut être utilisé à des mutants de l’écran de survie et de la diffusion chez les animaux et peut également être appliqué à des études in vitro .

Haut débit séquençage parallèle à la mesure de remise en forme de Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants durant Golden syrien Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

L’objectif global de cette technique de séquençage de transposons à haut débit est d’identifier et de quantifier les mutants de transposons présentant des défauts de fitness in vivo et in vitro, et ainsi d’identifier les gènes Leptospira impliqués dans la virulence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des Leptospira, telles que l’identification des gènes impliqués dans la colonisation, la dissémination et la survie des bactéries dans l’hôte. Le principal avantage de cette technique est qu’un grand nombre de mutants peuvent être criblés avec un nombre limité d’animaux.Bien que cette méthode ait été conçue pour examiner la valeur adaptative des mutants de Leptospira interrogans dans le modèle de hamster atteint de leptospirose aiguë, elle peut également être appliquée par le biais de modèles d’infection chronique, d’études in vitro et d’autres souches de Leptospira. Kritel Lourdault et Karen Evangelista, toutes deux post-doctorantes de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Tout d’abord, assemblez une unité de filtration.Placez la base sur un erlenmeyer à bras latéral de 125 millilitres. Positionnez un filtre en acétate cellulos

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Enterobacter sp. UEE grandit dans un milieu de sels glucose minimes. Les auxotrophes sont générées par le transformant avec un transposome qui se insère de manière aléatoire dans le génome de l'hôte. Les mutants sont trouvés par des répliques de milieu complexe à un milieu minimal. Gènes interrompus sont identifiés par le sauvetage des gènes et le séquençage.

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Coxiella burnetii est une bactérie intracellulaire Gram négatif obligatoire responsable de la maladie zoonotique la fièvre Q. Nous décrivons ici des procédés pour la génération de mutants de transposon Coxiella fluorescent ainsi que l'identification et l'analyse automatisée de l'internalisation, la réplication et cytotoxiques phénotypes résultants.

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Présenté ici est une méthode simple pour créer une bibliothèque d’insertion haute densité transposon dans Escherichia coli ou Shigella flexneri utilisant la conjugaison bactérienne. Ce protocole permet la création d’une collection de centaines de milliers de mutants uniques chez les bactéries par l’insertion de génomique au hasard d’un transposon.

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Pronucléaire injection (PN) du cluster régulièrement entrecoupées courtes répétitions palindromiques (CRISPR) et le système CRISPR-associated protein-9 nucléase (CRISPR/Cas9) est une méthode très efficace pour produire génétiquement hamsters syriens dorés. Ici, les auteurs décrivent le protocole détaillé d’injection de PN pour la production des hamsters de knock-out du gène avec le système CRISPR/Cas9.

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Cette approche moléculaire pour déterminer la forme physique bactérienne facilite la détection précise et précise des micro-organismes à l'aide de codes-barres d'ADN génomique uniques qui sont quantifiés par l'intermédiaire du PCR numérique. Le protocole décrit le calcul de  l'indice concurrentiel des souches de Salmonella; cependant, la technologie est facilement adaptable aux protocoles exigeant la quantification absolue de n'importe quel organisme génétiquement malléable.

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Nous décrivons une méthode pour générer des bibliothèques mutantes transposons saturantes chez les bactéries gramnégatives et la préparation subséquente des bibliothèques d’amiplicons d’ADN pour le séquençage à haut débit. À titre d’exemple, nous nous concentrons sur l’agent pathogène ESKAPE, Acinetobacter baumannii, mais ce protocole est accessible à un large éventail d’organismes gramnégatifs.

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Le séquençage par insertion de transposons comme outil pour élucider les facteurs de colonisation bactérienne dans un symbiote Burkholderia gladioli de coléoptères Lagria villosa

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Ce protocole propose un flux de travail modulaire BSL-2 combinant des tests de biomasse cristalline-violet, des cinétiques à contraste de phase en accéléré, une cartographie confocale 3D/matricielle, une ultrastructure SEM, et un module d’infection à hamster in vivo pour cultiver, quantifier, caractériser et étudier le rôle fonctionnel du biofilm Leptospira , permettant une évaluation standardisée des mutants et des interventions anti-biofilm à travers les laboratoires.

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