Un Multimodal à l’approche d’imagerie basée sur Micro-CT et Fluorescence moléculaire de positons pour une évaluation longitudinale de la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine chez la souris

L’objectif global de cette étude sur un modèle murin de type FPI est de surveiller longitudinalement la fibrose pulmonaire avec des techniques d’imagerie non invasives telles que la FMT et la micro-TDM. Cette méthode peut faire progresser la séquence en ce qui concerne ces événements moléculaires spécifiques se produisant dans la fibrose pulmonaire. Le principal avantage de ces techniques est que les modifications anatomiques d’événements moléculaires spécifiques peuvent être surveillées de manière non invasive.

Les applications de ces technologies s’étendent au traitement de la pathologie de la FPI, car la fusion de la FMT et de la micro-CT représente la possibilité d’étudier la progression de la maladie et l’évaluation de nouvelles thérapies. Commencez par positionner une souris anesthésiée sur la plateforme d’intubation, en la suspendant par ses incisives posées sur le fil. Allumez le laryngoscope, puis prenez une paire de pinces à bout émoussé et ouvrez doucement la bouche.

Placez la lame du laryngoscope vers l’arrière de la bouche jusqu’à ce que l’ouverture de la trachée soit visualisée. Utilisez l’autre main pour insérer le tube d’accouchement connecté à l’extrémité du tube PE dans la trachée. Tournez la valve à trois voies pour délivrer 50 microlitres de bléomycine.

Après l’installation, retirez rapidement le tube de la trachée pour éviter la suffocation. Tenez les souris à la verticale pendant quelques secondes. Pour l’injection de la sonde, prenez la souris par la queue et laissez-la s’agripper au couvercle de la cage.

Ensuite, saisissez les épaules et tenez la souris par la peau. Plongez la queue dans un bécher d’eau tiède pour faire gonfler les veines afin de faciliter la visualisation et l’insertion de l’aiguille. Trouvez les deux veines caudales de chaque côté de la queue, et non l’artère située sous la queue.

Insérez l’aiguille de calibre 26 de la seringue de 1 millilitre chargée de MMP dans la veine et injectez la solution de sonde MMP à 10 millilitres par kilogramme de poids corporel. Pour commencer, initialisez le logiciel d’acquisition de date et ouvrez une nouvelle étude dans la base de données de l’expérience. Avant de commencer l’imagerie, transférez la souris rasée et anesthésiée au milieu de la cassette d’imagerie.

Gardez la souris à plat, bien fixée et légèrement compressée contre les deux fenêtres de la cassette d’imagerie. Ensuite, dans la fenêtre de numérisation du logiciel, cliquez sur Sujet"puis prévisualisez pour voir l’image en direct. Dessinez la région de balayage suffisamment grande pour que les tissus entourant la zone de fluorescence prévue soient capturés.

Une fois le ROY dessiné, cliquez sur Ajouter à la file d’attente de reconstruction, puis sur Scanner, pour imager la souris. Une fois l’acquisition de l’image terminée, retirez la souris de la cassette d’imagerie et remettez-la dans la cage domestique. Quantifiez les picomoles de fluorescence à l’aide de l’outil ROY et réduisez le ROY d’environ 700 à 800 millimètres cubes sur le signal provenant de la région pulmonaire.

Répétez l’imagerie tous les sept jours ou au besoin. Pour obtenir une image par micro-CT, allumez d’abord le micro-CT en appuyant sur le bouton d’alimentation vert et lancez le logiciel pour réchauffer la source de rayons X. Créez la base de données en cliquant sur Nouvelle base de données et construisez le navigateur en fonction du nombre de souris dans l’expérience.

Avant de lancer l’analyse, sélectionnez les paramètres d’acquisition dans la fenêtre de contrôle du logiciel comme suit. Réglez la tension du tube à rayons X à 90 kilovolts, le courant du tube à rayons X CT à 160 micro-angströms, le courant sous tension du tube à rayons X à 80 micro-angströms et le champ de vision à 36 millimètres. Sélectionnez aucune technique de contrôle (pas de technique de gating ou haute résolution) et quatre minutes pour la technique de balayage.

Après avoir anesthésié la souris par inhalation de 3 % d’isoflurane, placez-la sur le lit de l’animal inséré dans le petit alésage avec un cône nasal fournissant un apport constant d’anesthésique. Immobilisez les pattes avec du ruban adhésif sur le lit pour permettre à la poitrine d’être exposée. Ensuite, la porte de l’instrument se ferme et active le mode live pour voir la position de la souris en temps réel en appuyant sur le bouton de capture.

Déplacez le lit de l’animal pour aligner le coffre avec le champ de vision à l’aide des boutons de l’instrument de tomodensitométrie. Une fois la souris centrée, faites pivoter le portique pour confirmer la position optimale du lit en sélectionnant 90 degrés et en cliquant sur Définir"Puis cliquez sur le bouton CT scan. Cliquez sur Oui pour afficher le message indiquant que la source de rayons X sera activée.

Après l’imagerie, remettez les animaux dans la cage et surveillez-les jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis de l’anesthésie. Répétez l’imagerie tous les sept jours ou au besoin. La coloration au trichrome de Masson permet de révéler la morphologie du tissu pulmonaire.

Les images du groupe traité à la bléomycine ont montré un schéma prononcé de fibrose à partir du septième jour, principalement sous forme de masses fibrotiques uniques, et a progressé au 14e jour vers des conglomérats confluents de collagène substitué et est resté inchangé jusqu’au 21e jour. L’imagerie micro-CT répétée a permis de quantifier et de segmenter les voies respiratoires dans les lobes pulmonaires de fibrose. Les voies respiratoires ont été divisées en une partie centrale et une partie distale.

La partie distale des voies respiratoires est le tractus intrapulmonaire et se divise en lobes pulmonaires comme le lobe crânien droit, le lobe moyen droit, le lobe caudal droit, le lobe accessoire droit et le poumon gauche. La quantification du rayon des voies respiratoires a montré une augmentation du rayon chez les souris traitées à la bléomycine par rapport aux témoins salins. Chaque point représente l’erreur-type moyenne de la moyenne de cinq animaux pour un total de 30 souris.

La quantification de la fibrose pulmonaire totale chez des souris excipithérapeutes ou traitées à la bléomycine à différents moments démontre que ces paramètres micro-CT concordent avec les résultats histologiques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée pour le dépistage de drogues de routine. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la fibrose pulmonaire pour explorer l’efficacité du traitement répétitif dans des modèles animaux de type FPI.