Évaluation In Vitro dommages à l’ADN à l’aide du test des comètes

L’objectif général de cette expérience est d’étudier l’efficacité des agents génotoxiques dans les cellules cancéreuses à l’aide d’un test d’électrophorèse sur cellule unique, également appelé test des comètes. Cette procédure est un sens pour mesurer les quatre études toxicologiques génétiques. Et il est applicable à différentes évaluations, telles que la sélection précoce de candidats médicaments et la recherche fondamentale sur les dommages et la réparation de l’ADN.

Cette technique fournit un moyen direct d’évaluer quantitativement les dommages à l’ADN. Et, il est efficace, facile à réaliser et relativement peu coûteux. Préparez l’agarose pour l’enrobage en faisant fondre un pour cent d’agarose au micro-ondes pendant deux à trois minutes ou jusqu’à ce que l’agarose soit complètement fondue.

Trempez une lame de microscope en verre dans l’agarose et utilisez une lingette non pelucheuse pour essuyer un côté de la lame. Posez la diapositive sur une surface plane pour la faire sécher à l’air. Un film d’agarose transparent doit se former après le séchage.

Placez les lames revêtues à 37 degrés Celsius avant utilisation. L’effet thérapeutique de la chimiothérapie est évalué dans des cellules de gliome U251 cultivées dans un milieu DMEM/Ham F-12 complété par 10 % FBS, 100 unités par millilitre de pénicilline et 10 microgrammes par millilitre de streptomycine. Digérez les cellules à l’aide d’un millilitre de trypsine pendant trois minutes, puis neutralisez la trypsine à l’aide d’un milieu DMEM/Ham F-12 avec FBS.

Collectez les cellules dans un tube de 15 millilitres. Et tournez à 300 fois G pendant quatre minutes. Aspirez le support.

Et suspendez les cellules à deux fois 10 à la cinquième cellule par millilitre dans 1x PBS. Les cellules et doivent être préparées immédiatement avant de commencer le test. Et ils doivent être manipulés dans l’obscurité.

Le tout dans la pénombre pour éviter tout dommage. Combinez la suspension cellulaire avec un pour cent d’agarose fondue à faible point de fusion dans un rapport de volume de un à 10. Mélangez doucement en pipetant de haut en bas.

Et pipetez immédiatement 30 microlitres sur une lame. Utilisez la glissière de la pointe de la pipette pour étaler le mélange d’agarose afin d’assurer la formation d’une fine couche. Placez les lames à plat à quatre degrés Celsius, dans l’obscurité, pendant 10 minutes.

Immergez les lames dans une solution de lyse à quatre degrés Celsius, dans l’obscurité pendant une heure à toute la nuit. Pour le test des comètes alcalines, retirez délicatement les lames de la solution de lyse, égouttez l’excès de liquide et immergez-les doucement dans AES, dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant une heure pour permettre le déroulement de l’ADN. Ajoutez de l’AES pré-réfrigéré dans le plateau de lames d’électrophorèse.

Ne dépassez pas 0,5 centimètre au-dessus des toboggans. Placez les lames à l’intérieur et couvrez avec un bouchon. Réglez la tension d’alimentation sur un volt par centimètre et faites fonctionner à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.

Lorsque l’électrophorèse est terminée, drainez l’excès d’AES des lames. Plongez doucement les lames deux fois dans de l’eau distillée à température ambiante pendant cinq minutes à chaque fois. Après cela, plongez doucement les lames dans de l’éthanol à 70 % à température ambiante pendant cinq minutes.

Pour le dosage des comètes neutres, retirez délicatement les lames de la solution de lyse, égouttez l’excès de liquide et immergez-les doucement dans le NES dans l’obscurité, à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez du NES pré-réfrigéré dans le plateau de lames d’électrophorèse, sans dépasser 0,5 centimètre au-dessus des lames. Placez les lames à l’intérieur et couvrez avec un bouchon.

Réglez la tension d’alimentation à un volt par centimètre et faites fonctionner à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes. Vidangez l’excès de tampon des lames. Immergez doucement les lames dans une solution de précipitation d’ADN à température ambiante pendant 30 minutes.

Après 30 minutes, plongez doucement les lames dans de l’éthanol à 70 % à température ambiante pendant 30 minutes. Commencez cette procédure en séchant les lames dans l’obscurité à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, placez 50 à 100 microlitres de solution de coloration d’acide nucléique fluorescent vert sur l’agarose séchée de chaque lame et colorez pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité.

Rincez brièvement les lames à l’eau distillée et séchez-les complètement à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Effectuez l’acquisition et l’analyse d’images immédiatement après la coloration des lames de la comète. Placez une lame sous un microscope fluorescent à l’aide d’un porte-diapositives.

Sélectionnez l’objectif 10X et assurez-vous que le gel d’agarose fait face à l’objectif. Capturez au hasard des images de chaque lame de comète colorée. Évitez les bords et les zones autour des bulles d’air.

Assurez-vous que chaque queue de comète est distribuée horizontalement. Les têtes de comète doivent provenir de la gauche et la queue de la droite. Enregistrez chaque image dans un format binaire avec une tache d’ADN lumineuse et un fond sombre.

Pour l’analyse d’images, chargez d’abord toutes les images dans le logiciel de dosage des comètes, à l’aide du bouton Sélectionner les fichiers à analyser, situé à gauche de la barre d’outils. Une fenêtre d’affichage d’image doit apparaître. Dessinez un cadre de mesure à l’écran et ajustez sa taille en fonction de la comète de la cellule.

Cliquez sur ajuster pour configurer le seuil de la tête, de la comète et de la queue, en fonction de l’image. Cliquez ensuite sur Démarrer les mesures. Sélectionnez une cellule à l’aide de la trame et activez la mesure en cliquant sur le bouton Tester la comète.

Une image d’intensité s’affichera dans la fenêtre des profils, avec les paramètres de mesure sélectionnés. Enregistrez les résultats en cliquant sur le bouton Stocker les résultats. Analysez au moins 50 cellules par traitement.

Les résultats des tests de comètes alcalines et neutres montrent que les queues de comète des cellules UT51 traitées à la doxorubicine étaient plus longues et avaient une intensité d’ADN plus élevée, suggérant une accumulation substantielle d’ADN fragmenté. L’analyse quantitative pour le test des comètes alcalines ou neutres a montré une augmentation significative de la formation de la queue de la comète, après des traitements à la doxorubicine, indiquant des dommages à l’ADN. Un traitement combiné d’un inhibiteur de PARP, l’olaporib, et d’un agent alkylant, le témozolomide, a considérablement augmenté les dommages à l’ADN dans les cellules de gliome, reflétés par l’augmentation de la longueur et de l’intensité du signal de la queue de comète.

Olaporib seul n’a pas introduit de dommages à l’ADN. Alors qu’il a potentialisé l’effet génotoxique du témozolomide. Des images représentatives de cellules de gliome sous traitements simples et combinés ont montré les queues de comète plus longues et de plus haute intensité des cellules traitées avec du témozolomide et de l’olaporib.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures, si elle est exécutée correctement. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la génotoxicité pour mesurer les cassures de chaînes d’ADN dans de nombreux types de cellules ukaryotiques. Comme les cellules cultivées ou les cellules isolées d’organismes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le test des comètes pour étudier l’efficacité d’un agent génotoxique au niveau de la cellule unique. N’oubliez pas que travailler avec le réactif de dégâts peut être extrêmement dangereux. Et les précautions, telles que le port d’une blouse de laboratoire et de gants, doivent toujours être prises lors de la préparation de cette procédure.