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Test de biotinylation de la surface cellulaire

Cell-surface Biotinylation Assay

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Cell Biology

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Cell-surface Biotinylation Assay

4.7: An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

4.9: FM Dyes in Vesicle Recycling

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09:13 min

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April 30, 2023

Overview

Une cellule peut réguler la quantité de protéines particulières sur la membrane de la cellule par endocytose, suivant quelles protéines de surface de cellules sont effectivement séquestrés dans le cytoplasme. Une fois dans une cellule, ces protéines de surface peuvent être détruits ou « recyclés » vers la membrane. L’analyse de surface biotinylation de cellules fournit aux chercheurs un moyen d’étudier ces phénomènes. La technique utilise un dérivé de la biotine de petites molécules, qui peut marquer des protéines de surface et ensuite être clivé chimiquement. Toutefois, si la protéine de surface est mégacaryocyte, la dérivée de la biotine est protégée du clivage. Ainsi, en analysant l’étiquette de biotine mégacaryocyte clivés, les chercheurs peuvent évaluer les quantités de protéines de surface intériorisées.

Dans cette vidéo, nous passons en revue les concepts qui sous-tendent l’analyse biotinylation, plonger dans la structure chimique de la dérivée de la biotine et le mécanisme de son décolleté. Il est suivi par un protocole généralisé de la technique et enfin, une description de comment les chercheurs utilisent actuellement il pour étudier la dynamique des protéines de surface de cellules différentes.

Procedure

Marquage des protéines de surface de cellules avec de la biotine présente un outil puissant pour étudier les voies de transport cellulaire impliqués dans la régulation des protéines membranaires. Une cellule tient étroitement réglementé des protéines à la surface, afin qu’il peut recevoir et répondre aux informations extracellulaires via plusieurs voies de signalisation. Endocytose, un processus d’engloutissement, est suggérée pour être impliqués dans la régulation de ces protéines de surface de cellules en provoquant leur internalisation. Par conséquent, l’étiquetage ces protéines avant qu’ils soient mégacaryocyte avec des agents comme la biotine aide les scientifiques à quantifier leur internalisation et d’étudier leur rôle dans les voies cellulaires.

Dans cette vidéo, nous discuterons les principes et la méthodologie des tests de surface cellulaire biotinylation et explorer d’une certaine manière dans laquelle les scientifiques adaptent cette méthode aujourd’hui.

Revoyons tout d’abord les principes qui sous-tendent l’analyse de surface cellulaire biotinylation.

Comme mentionné précédemment, les cellules utilisent voies endocytose pour réguler la densité spatio-temporelle et la distribution de protéines de surface. Intériorisé les protéines sont transportées par voies cellulaires spécifiques, après quoi ils peuvent être shuntés pour le lysosome pour dégradation, ou recyclés remontent vers la surface de la cellule d’activité continue. Surface cellulaire biotinylation est conçue pour mesurer ces processus.

La balise utilisée dans ce test, biotine, également connu sous le nom de vitamine H — est une petite molécule soluble dans l’eau. Un dérivé couramment utilisé de biotine pour des expériences de marquage de la surface est la sulfo-NHS-SS-biotine, qui se compose du groupe sulfo, groupe ester N-hydroxy succinimide, le pont disulfure et bien sûr de biotine. Nous allons simplifier cette énorme structure en remplaçant la biotine avec la lettre « b ».

Le groupe sulfo dans cette structure confère une charge forte qui rend cette forme de membrane de biotine imperméants. Marquage des protéines de surface de cellule s’effectue en ajoutant des sulfo-NHS-SS-biotine aux cellules maintenues à une température qui est restrictive d’endocytose. Le groupe NHS réagit avec les amines primaires sur les protéines de surface, formant des liaisons covalentes.

Ensuite, les cellules marquées sont déplacés à une température qui est permissive à l’endocytose, au cours de laquelle certaines des protéines marquées vont être internalisés. Enfin, les cellules sont ramena à la température restrictive pour arrêter l’endocytose. Afin de quantifier précisément les protéines intériorisées, un agent réducteur hydrophile, membrane-imperméants — comme le L-glutathion — est ajouté. Ceci réagissent avec les ponts disulfures sur biotine sulfo-NHS-SS unendocytosed et cleave groupes de biotine au large. À ce stade, autres protéines biotinylées sont ceux dont les étiquettes ont été protégés contre l’agent réducteur parce qu’ils étaient auparavant internalisées.

Les cellules sont ensuite lysées et protéines biotinylées mégacaryocyte sont isolés pour être quantifié. Isolement est généralement réalisée en ajoutant des lysats cellulaires à perles synthétiques recouvertes de streptavidine. Streptavidine ayant une affinité extrêmement élevée pour la biotine, les protéines biotinylées se fixent aux talons enrobés. Une série de mesures pour éliminer les protéines contaminantes et enfin une étape d’élution, de lavage est effectuée pour libérer des protéines liées. Les protéines cibles peuvent ensuite être analysés par techniques comme le Western Blot.

Depuis maintenant, vous savez les concepts qui sous-tendent le dosage biotinylation, regardons un protocole généralisé montrant la façon d’effectuer cette procédure pour mesurer l’endocytose des protéines de surface.

Commencez par des cellules cultivées refroidis à 4° C. Placez-les sur la glace pour maintenir la température qui est restrictive d’endocytose. Ensuite, la membrane imperméable sulfo-NHS-SS-biotine réactif est ajouté, et les cellules sont incubées dans l’obscurité pendant environ 30 minutes. Cela laisse suffisamment de temps pour les étiquettes de la biotine fixer par liaison covalente à des protéines de surface. Les cellules sont ensuite retirés de glace et incubés à 37° C pendant environ 30 minutes. À cette température, les protéines de surface biotinylés sont mégacaryocyte. Après l’incubation, les cellules sont refroidis à 4° C, et un agent réducteur hydrophile comme L-glutathion est ajouté. Il réagit avec liaisons disulfide et libère les groupes de biotine de marqué, unendocytosed protéines.

Ensuite, les cellules sont lysées par centrifugation, donc rompre les membranes cellulaires et en exposant les protéines biotinylées. Suite à cela, lysats sont ajoutés à la Streptavidine perles et protéines biotinylées sont autorisés à lier. Perles sont lavés avec froid tamponnée au phosphate salin et éluée avec un tampon contenant des détergents et agents réducteurs. Ces réactifs dénaturent les protéines liées hors perles et permettent leur récupération dans l’éluat. Protéines dans l’éluat sont séparées sur la base de leur masse moléculaire par électrophorèse sur gel. Enfin, Western Blot et sondant de la tache avec des protéines spécifiques anticorps permettre la visualisation de la protéine cible. Pourcentage mégacaryocyte protéine peut être quantifié à partir des masses volumiques la bande qui en résulte.

Maintenant que vous comprenez la méthodologie de cellule biotinylation, regardons comment il est utilisé dans des expériences spécifiques.

L’application la plus courante de ce protocole biotinylation est de mesurer le taux d’endocytose des protéines de surface de cellules spécifiques. Ici, les scientifiques ont été intéressés par l’évaluation de l’internalisation du transporteur de la dopamine ou DAT. En suivant le protocole standard, les scientifiques ont pu mesurer le pourcentage du mégacaryocyte DATs. Il s’agit d’une voie représentant immunoblot montrant T, correspondant au montant « total » des protéines avant l’internalisation, lane S est pour les échantillons « stripped » où les cellules sont jamais autorisés à procéder par endocytose mais traités avec l’agent réducteur et lane je représente les résultats des protéines « intériorisées ».

En plus de tout mesurer endocytose des protéines de surface, scientifiques examinent aussi les effets des médicaments sur ce processus. Dans cette étude, les chercheurs ont évalué la masse surfacique des fichiers DAT dans la réponse au traitement avec un activateur de la protéine kinase C (PKC), dont l’action a été suggérée pour induire l’internalisation de la DAT. Les scientifiques l’ont confirmé en adaptant le protocole biotinylation in vitro pour utilisation dans un test ex vivo sur des tissus cérébraux de souris. Les données ont révélé une perte de quelque 30 % de DAT de la membrane cellulaire, en réponse à l’activation de la PKC.

Enfin, en ajustant le dosage biotinylation, les scientifiques peuvent également mesurer recyclage des protéines membranaires. Ici, les chercheurs enquêtaient sur la protéine de surface canal, CFTR, chargé des ions chlorure. Pour évaluer le recyclage, chercheurs effectué un protocole standard biotinylation dans un groupe de cellules et modifié le protocole pour le deuxième groupe de cellules en ajoutant des étapes après clivage biotine hors les protéines de surface unendocytosed. Ces étapes supplémentaires inclus l’élévation de la température à 37° C pour permettre le recyclage de certains de l’intériorisation, biotine tag protéines réceptrices. En calculant la différence entre les protéines intériorisées avant et après le recyclage a lieu, ces scientifiques ont été en mesure de quantifier le pourcentage CFTR recyclé vers la membrane.

Vous avez regardé juste introduction de JoVE à la surface cellulaire biotinylation dosage. Cette vidéo décrit les étapes de la procédure de ce test et a expliqué la réaction se produisant à chaque étape. Enfin, nous avons exploré quelques expériences exemple démontrant l’applicabilité de cette méthode. Comme toujours, Merci pour regarder !

Transcript

Labeling of cell surface proteins with biotin presents a powerful tool to study cellular transport pathways involved in regulating membrane proteins. A cell maintains a tightly regulated set of proteins at the surface, so that it can receive and respond to extracellular information via several signaling pathways. Endocytosis, a process of engulfing, is suggested to be involved in regulation of these cell surface proteins by causing their internalization. Therefore, labeling these proteins before they are endocytosed with agents like biotin helps scientists quantify their internalization and study their roles in cellular pathways.

In this video, we will discuss the principles and methodology of cell-surface biotinylation assays, and explore some ways in which scientists are adapting this method today.

Let’s first review the principles behind the cell-surface biotinylation assay.

As mentioned earlier, cells use endocytic pathways to regulate the spatiotemporal density and distribution of surface proteins. Internalized proteins are transported through specific cellular pathways, following which they can be either shunted to the lysosome for degradation, or recycled back to the cell surface for continued activity. Cell-surface biotinylation is designed to measure these processes.

The tag used in this assay, biotin—also known as vitamin H—is a small, water-soluble molecule. A commonly used derivative of biotin for surface labeling experiments is the sulfo-NHS-SS-biotin, which consists of the sulfo group, the N-hydroxy succinimide ester group, the disulfide bond, and of course biotin. Let’s simplify this huge structure by replacing biotin with the letter “B.”

The sulfo group in this structure imparts a strong charge that makes this form of biotin membrane impermeant. Labeling of cell surface proteins is done by adding sulfo-NHS-SS-biotin to cells maintained at a temperature that’s restrictive to endocytosis. The NHS group reacts with the primary amines on surface proteins, forming covalent bonds.

Then, the labeled cells are moved to a temperature that is permissive to endocytosis, during which some of the labeled proteins will be internalized. Finally, cells are moved back to the restrictive temperature to stop endocytosis. In order to specifically quantify internalized proteins, a hydrophilic, membrane-impermeant reducing agent—like L-glutathione—is added. This will react with the disulfide bonds on unendocytosed sulfo-NHS-SS biotin, and cleave biotin groups off. At this point, remaining biotinylated proteins are those whose labels were protected from the reducing agent because they were previously internalized.

Cells are then lysed, and the endocytosed biotinylated proteins are isolated to be quantified. Isolation is usually performed by adding cell lysates to synthetic beads coated with streptavidin. Since streptavidin has an extremely high affinity for biotin, the biotinylated proteins attach themselves to the coated beads. A series of washing steps to remove contaminating proteins, and lastly an elution step, is performed to release bound proteins. The target proteins can then be analyzed by techniques like Western blotting.

Since now you know the concepts behind the biotinylation assay, let’s look at a generalized protocol showing how to perform this procedure to measure endocytosis of surface proteins.

Start with cultured cells cooled to 4°C. Place them on ice to maintain the temperature that is restrictive to endocytosis. Next, the membrane impermeable sulfo-NHS-SS-biotin reagent is added, and cells are incubated in the dark for approximately 30 minutes. This allows sufficient time for biotin labels to covalently attach to the surface proteins. Cells are then removed from ice and incubated at 37°C for approximately 30 minutes. At this temperature, biotinylated surface proteins are endocytosed. Following incubation, the cells are cooled to 4°C, and a hydrophilic reducing agent like L-glutathione is added. This reacts with disulfide bonds and releases the biotin groups from labeled, unendocytosed proteins.

Next, cells are lysed by centrifugation, thus breaking cell membranes and exposing biotinylated proteins. Following this, lysates are added to streptavidin-coated beads and biotinylated proteins are allowed to bind. Beads are washed with cold phosphate buffered saline and eluted with a buffer containing detergents and reducing agents. These reagents denature bound proteins off beads and enable their recovery in the eluate. Proteins in the eluate are separated on the basis of their molecular mass by gel electrophoresis. Lastly, Western blotting and probing of the blot with protein-specific antibodies allow visualization of the target protein. Percentage endocytosed protein can be quantified from the resulting band densities.

Now that you understand the methodology of cell biotinylation, let’s look at how it’s used in specific experiments.

The most common application of this biotinylation protocol is to measure the endocytic rate of specific cell surface proteins. Here, scientists were interested in evaluating the internalization of dopamine transporter or DAT. By following the standard protocol, scientists were able to measure the percentage of endocytosed DATs. This is a representative immunoblot showing lane T, corresponding to “total” amount of protein before internalization, lane S is for “stripped” samples where cells were never allowed to proceed through endocytosis but treated with reducing agent, and lane I represents results of “internalized” proteins.

In addition to just measuring endocytosis of surface proteins, scientists also examine the effects of drugs on this process. In this study, researchers assessed the surface density of DATs in response to treatment with an activator of protein kinase C (PKC), whose action has been suggested to induce DAT internalization. Scientists confirmed this by adapting the in vitro biotinylation protocol for use in an ex vivo assay on mouse brain tissue. The data revealed an approximately 30% loss of DAT from the cell membrane, in response to PKC activation.

Lastly, by tweaking the biotinylation assay, scientists can also measure recycling of membrane proteins. Here, researchers were investigating the surface channel protein, CFTR, responsible for conducting chloride ions. To assess recycling, researchers performed a standard biotinylation protocol in one group of cells, and modified the protocol for the second group of cells by adding steps after cleaving biotin off of the unendocytosed surface proteins. These additional steps included raising the temperature back to 37°C to allow recycling of some of the internalized, biotin tagged receptor proteins. By calculating the difference between the internalized proteins before and after recycling takes place, these scientists were able to quantify percent CFTR recycled back to the membrane.

You just watched JoVE’s introduction to cell-surface biotinylation assay. The video described the procedural steps of this assay, and explained the reaction occurring at each step. Lastly, we explored some example experiments that demonstrated the applicability of this method. As always, thanks for watching!

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