Name: Détecter le Spirochete de la maladie de Lyme, Borrelia Burgdorferi, chez les tiques à l’aide de la PCR nichée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Découvrez la détection de Borrelia burgdorferi chez les tiques par PCR nichée. Cette méthode moléculaire cible les gènes OspA et FlaB pour une surveillance sensible et spécifique de la maladie de Lyme.

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Les auteurs tiennent à remercier Kami Harris pour la conception d’amorce, Ashley McKibbon et Jessica Thomas-Ebbett pour le tournage et John Blakely, Alexandra Foley-Eby, Chris Langley, Julie Lewis, Kelsey McIntyre, Ashley McKibbon, Chris Zinck et Rosie le chien pour ses apparitions dans le vidéo. A. M. K. a été soutenu par la Fondation canadienne de recherche de la maladie de Lyme, et le projet a été financé par les Sciences naturelles et génie conseil recherche du Canada (CRSNG). M. K. B. W. reçu un salaire financement de la Fondation de l’Innovation Nouveau-Brunswick (FINB).

1. isolement contre les tiques
<ol><li>Tiques par collecte sur le terrain, ou une surveillance passive des vétérinaires et des membres du public de l’acquisition. Tiques doivent être tuées par congélation, placés dans un sac scellé et envoyé par la poste à température ambiante.<ol>
<li>À l’aide d’un formulaire de soumission, recueillir des informations sur la date et le lieu géographique de la rencontre, statut d’attachement tique, espèces hôtes et voyage l’histoire récente de l’hôte.</li>
		<li>PCR nichée étant intrinsèquement vulnérable à la contamination, s’assurer que l’espace de travail de laboratoire est mis en place pour minimiser les croix-exposition d’échantillons. Cela implique l’exécution de différents éléments du protocole en espaces distincts, dédiés bien isolés les uns des autres qui sont soigneusement nettoyés et stérilisés, et veiller à ce que tous les instruments sont exemptes de contaminants.</li>
		<li>À la réception de l’échantillon, photographier la tique et de déterminer les espèces, le stade de développement, sexe et statut d’engorgement par comparaison à une clé d’identification32 .</li>
		<li>Dans des conditions aseptiques, coupent la tique à l’aide d’une lame de rasoir stérile ou un scalpel et placer les fragments de deux tiques dans des tubes de microcentrifuge distinct.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour extraire l’ADN total, utiliser toute méthode d’isolement qui génère un modèle compatible PCR ; Ce protocole montre une approche axée sur la chélation simple.<ol>
<li>Commencez par ajouter un volume approprié (souvent entre 50-200 µL) d’un réactif de chélation lytique au fragment de la tique. Le montant précis dépendra de l’état de taille et de l’engorgement de spécimen ; lignes directrices devraient être fournies par le fabricant. Homogénéiser à l’aide d’un pilon microtube.</li>
		<li>Incuber les échantillons dans un bain-marie à 60 ° C pendant 45 min, puis vortexer brièvement.</li>
		<li>Centrifuger les échantillons pendant 4 min à 16 276 x g (13 300 tr/min) dans une micro-centrifugeuse bureau.</li>
		<li>Transférer surnageant dans un microtube frais, étiqueté, contenant 50 µL isopropanol, mélanger par inversion et re-centrifuger comme (1.2.3).</li>
		<li>Éliminer le surnageant et rincer le granule d’ADN avec 50 µL d’éthanol 70 %.</li>
		<li>Enlever l’excès d’éthanol avec une pipette et laisser le culot à sécher à l’air à température ambiante pendant 15 minutes.</li>
		<li>Pour remettre en suspension les ADN, ajouter 50 µL de 1 mM Tris pH 7.0 et incuber les échantillons dans un bain-marie pendant 1 h à 60 ° C. L’ADN peut maintenant être conservé à-20 ° C pour des analyses moléculaires.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. nested PCR Detection of Borrelia OspA et graisse.
Remarque : Un aperçu général des principes de la PCR et des pratiques est fourni par Lorenz, 201233.
<ol><li>Synthétiser, ou obtenir des Borrelia gène-spécifiques internes et externes amorces. Voir le tableau 1 pour les amorces, leurs tailles respectives amplicon et températures de fusion.</li>
</ol><table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Nom de l’apprêt</td>
			<td>Gène cible</td>
			<td colspan="2">Séquence (5' - 3')</td>
			<td>Taille de l’amplicon</td>
			<td>Température de recuit</td>
		</tr>
<tr>
<td>Graisse sur Fw</td>
			<td>Graisse</td>
			<td colspan="2">gcatcactttcagggtctca</td>
			<td rowspan="2">503 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Graisse sur Rv</td>
			<td>Graisse</td>
			<td colspan="2">tggggaacttgattagcctg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Graisse en Fw</td>
			<td>Graisse</td>
			<td colspan="2">ctttaagagttcatgttggag</td>
			<td rowspan="2">447 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Graisse en Rv</td>
			<td>Graisse</td>
			<td colspan="2">tcattgccattgcagattgt</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA Out Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">cttgaagttttcaaagaagat</td>
			<td rowspan="2">487 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA Out Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">caactgctgacccctctaat</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA LF</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">acaagagcagacggaaccag</td>
			<td rowspan="2">350 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA dans Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">ttggtgccatttgagtcgta</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Intérieurs et extérieurs amorces pour nPCR de Borrelia burgdorferiFlaB et OspA. Dans la pratique, les amorces de graisse détecter B. burgdorferi s.s. et autre apparenté Borrelia genospecies, tandis que des amorces OspA capturent seulement de b. burgdorferi s.s. Amplification de deux locus indiquerait B. burgdorferi. s.s.
<ol start="2"><li>Les stériliser un cabinet PCR avec UV lumière et 70 % d’éthanol. Remarque : Pour minimiser la contamination potentielle des échantillons, cet espace de travail doit être distincte de l’emplacement de la dissection de la tique, extraction de l’ADN et électrophorèse sur gel.<ol>
<li>Pour la première manche PCR, utiliser les amorces externes avec le modèle ADN récupéré à l’étape 1.0 ci-dessus et mis en place le mélange réactionnel, tel que décrit dans le tableau 2. En parallèle, effectuer positif contrôle exécute consistant en vérifié Borrelia ADN et contrôle négatif exécute notamment les réactions non-modèle pour détecter la contamination réactif et aérosols. Ajouter l’ADN à l’extrémité pour minimiser le risque de contamination de réactifs. S’assurer que chaque tube est fermé en tout temps lorsque les réactifs ne sont pas ajoutés et fermer les tubes immédiatement après l’addition de l’ADN, et avant que les autres tubes sont ouverts.</li>
		<li>Programmez un thermocycleur comme suit : 95 ° C pendant 5 min ; 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s, recuit température pendant 30 s, 72 ° C pendant 45 s ; 72 ° C pendant 5 min ; maintenez à 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer la deuxième série de PCR semblable à la première réaction, sauf utiliser les amorces internes avec 2 µL du premier produit PCR (produit à la section 2.2.2). NOTE : Volumes de réaction sont encore fournis dans le tableau 2. Il faut pour éviter la contamination croisée des amplicons en veillant à ce que l’ADN modèle est ajouté en dernier et que les seuls tubes correspondant à un échantillon sont ouverts à la fois. 
	 
	<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Composant</td>
				<td>PCR # 1 Volumes</td>
				<td>PCR # 2 Volumes</td>
			</tr>
<tr>
<td>Taq polymérase Master Mix 2 X</td>
				<td>12,5 ΜL</td>
				<td>12,5 ΜL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Eau exempte de nucléase</td>
				<td>8,5 ΜL</td>
				<td>8,5 ΜL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 µM amorces marche avant et arrière</td>
				<td>Amorces externe 1,0 µL</td>
				<td>Amorces internes 1,0 µL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Matrice d’ADN</td>
				<td>µL 2.0, de l’extraction de l’échantillon (1.2.7)</td>
				<td>µL 2.0, du 1er cycle de PCR (2.2.2)</td>
			</tr>
</tbody></table>
Tableau 2 : Mélanges de réaction PCR pour les premiers et deuxième amplifications. 
	 
	<ol>
<li>Programmer le thermocycleur comme avant, mais régler la température de recuit pour accommoder les amorces internes (voir tableau 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. imagerie et électrophorèse sur Gel d’Agarose
Remarque : Pour les instructions de base sur la séparation de l’ADN par électrophorèse, voir Lee et al., 201234.
<ol><li>Préparer un gel d’agarose à 1.2 % en utilisant 20 X SB buffer (0,2 M NaOH, 0,8 M acide borique pH 8), dilué à 1 X et ajouter environ 5 µL de la tache de l’ADN, avant de verser, si avant une coloration du gel est souhaitée.</li>
	<li>Charger 10 µL du produit de la seconde réaction PCR (interne) de chaque expérimentale et échantillon de contrôle, aux côtés d’une échelle de bp 100 (5 µL).<ol>
<li>ELECTROPHORESE pendant 1 h à 107 V (5 v/cm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualiser et documenter le gel à l’aide d’un Transilluminateur et associé de caméra et un logiciel.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Au fil des décennies d’utilisation, techniques basées sur la PCR ont constamment prouvé leur valeur dans la détection des Borrelia de spécimens arthropodes et chez les mammifères, si Borrelia proviennent d’origines environnementales ou cliniques. PCR offre de nombreuses améliorations sur des approches préexistants à la surveillance. Notamment, il n’est pas tributaire de l’élaboration et l’exécution de réactifs d’anticorps et au lieu de cela, peut être facilement adapté pour détecter les nouvelles cibles d’intérêt simplement en modifiant les séquences d’amorces. PCR accueille également l’évaluation de plusieurs loci en parallèle, soit individuellement, soit par une réaction de multiplexe. Il peut être appliqué aux entrées de divers spécimens, y compris les tiques frais et archivées22, animal ou humains fluides corporels et tissus réséqués25. PCR permettent également d’obtenir les amplicons qui peuvent être traitées ultérieurement, par exemple par enzyme de restriction digestion, hybridation de la sonde ou le séquençage, à éclairer une augmentation sur identité microbienne21.
Comme un outil clinique, PCR est théoriquement préférable au diagnostic sérologique standard, car il fournit une indication directe de la présence bactérienne, plutôt que de compter sur la réponse immunitaire de l’hôte comme une mesure secondaire de l’infection. Toutefois, la borréliose de Lyme est associée à une charge microbienne relativement modeste (< 50 organismes/mL d’urine ou de plasma) et spirochetemia transitoire, qui peut donner lieu à faux négatif résulte25. La sensibilité de cette technique à la clinique varie considérablement selon le type de tissu, stade de l’infection et l’état de l’échantillon, se situant entre 12,5 % et 62 % dans les études existantes du sang, liquide céphalorachidien et tissus biopsiés36. Limites de sensibilité moléculaires ne sont pas une préoccupation si la PCR est entrepris à la suite de la culture bactérienne, mais la récupération de spirochètes viables à partir des échantillons cliniques s’est avéré difficile de même. Que récemment les protocoles ont été optimisés pour plus de rendement35. Pendant ce temps, le tube digestif d’une tique adulte infecté peut abriter en moyenne n’importe où de 2 000 au plus 50 000 Borrelia37,38,39, qui est solidement dans la plage de détection du nPCR. Ainsi, le protocole est bien adapté aux efforts de surveillance de tiques.
Malgré ses nombreux avantages, nPCR pose certains défis et la capacité de cette technique de signaler précisément infection tique dépend donc de la sélection stratégique des gènes et des amplicons, méticuleux workflows expérimentales qui récupérer l’ADN de qualité d’après des échantillons tout en minimisant les croix-exposition des échantillons et l’utilisation des contrôles appropriés qui peuvent signaler des contaminants dans l’environnement de laboratoire et des réactifs. Avant toute expérimentation, la portée et les intentions de l’enquête devraient être clairement définies afin que les locus génétiques appropriées et les régions qui y sont, peuvent être sélectionné. Si l’objectif est de fournir un écran non biaisé pour la s.l. causant le Lyme Borrelia burgdorferi complexes, des amorces doivent être créées pour détecter toutes les souches associées avec une affinité semblable et efficacité de l’amplification, sans capture sans rapport avec les organismes25. Nouvelles amorces peuvent être conçues et mises en recouvrement en silico à l’aide d’outils logiciels tels que Primer-BLAST40, bien qu’ils doivent également être validées expérimentalement contre le standard de référence isole avant d’être appliqué aux échantillons indéterminés. L’objectif de la procédure d’extraction de l’ADN est de récupérer le modèle microbienne intacte auprès d’un échantillon d’environnement mixte (tique homogénat). Une étape facultative avant de procéder à la PCR est d’évaluer l’intégrité de l’ADN extrait. En outre, réactions parallèles pourraient être mises en place pour cibler un gène de ménage chez la tique. Cette dernière méthode peut également indiquer la présence d’inhibiteurs dans le mélange réactionnel, fournissant une plus grande confiance que les réactions négatives de Borrelia sont en raison de l’absence de l’organisme et non à la présence d’un contaminant inhibitrice.
La sensibilité accrue de la démarche imbriquée de la PCR se fait aux dépens de contamination potentielle qui génère des résultats faussement positifs. Modèle exogène pourrait être introduit à un échantillon au cours de la dissection de la tique et récupération de l’ADN, ou dans le processus de mise en place des réactions d’amplification interne et externe. Il est donc particulièrement important de suivre les meilleurs protocoles de pratique pour l’ACP afin d’éviter le modèle ou l’amplicon contamination croisée. Ceux-ci incluent l’utilisation de stations de travail distinctes avec des débits indépendants, confinement en PCR et enceintes de sécurité biologique le cas échéant, approfondie chimique et physique de nettoyage et stérilisation des surfaces et des réactifs et la gestion prudente de l’ADN 41. contrôles non-modèle sont également vitales dans l’identification de la contamination des réactifs stocks. Une vulnérabilité particulière de nPCR est l’amplicon manipulation qui se produit lorsque les produits de la première réaction lors du transfert vers le deuxième navire PCR. Puisque l’ADN cible a déjà fait l’objet d’enrichissement exponentiel dans les échantillons positifs, cette étape est particulièrement sujette à la contamination croisée, et un seul tube nPCR protocole a été développé afin de contourner cette limitation. Dans cette approche, les deux ensembles d’amorces pour un gène donné sont additionnées d’un tube à essais qui reste scellé pour les deux tours de PCR31. Les paires d’amorces internes et externes doivent être thermodynamiquement différents, tels que le couple externe amplifie modèle à une haute température de recuit qui est prohibitive pour les amorces internes. Au second tour, la température de recuit est abaissée pour tenir compte de la paire interne. Non seulement cela contourne une étape potentiellement confondant, il permet aussi l’utilisation d’autres mesures de lutte contre la contamination31,42. Toutefois, cette modification peut sacrifier certaines sensibilité. Quel que soit l’approche, augmentant le nombre de réplicats techniques exécutées de façon autonome sur un échantillon aidera à identifier la contamination parasite.
Techniques moléculaires ont continué à évoluer depuis l’introduction du nPCR, et ces nouvelles approches offrent des avantages certains sur les conceptions originales, quoiqu’en augmentation des charges financières. Comme son nom l’indique, PCR quantitative (qPCR ou real time (RT)-PCR) permet pour le dénombrement des agents pathogènes dans un échantillon, tandis que les techniques conventionnelles sont qualitatives nature43. La sensibilité de qPCR est aurait été semblable à celle de nPCR38, bien qu’il peut fluctuer selon l’apprêt caractéristiques28. Une variation de qPCR qui utilise les balises moléculaires (MB) à la place des sondes TaqMan conventionnelles s’est montré aussi prometteur dans la détection de Borrelia dans les échantillons cliniques44,45,46. En raison de leur structure secondaire unique, molecular beacons produisent aurait été plus faible fluorescence de fond et des signaux supérieurs légitimes, permettant ainsi de sensibilité supérieure47. Les évaluations précliniques suggèrent un seuil de détection de potentiel d’entre un et dix spirochètes44,45. Par ailleurs, la technique a été appliquée avec succès dans des réactions multiplexes à détecter simultanément un mammifère hôte gène44 et autres agents pathogènes transmis par des tiques45, qui n’est pas aussi facilement réalisable avec nPCR. Autres modifications de conception incluent la technologie numérique gouttelette PCR (ddPCR), qui permet de quantifier l’ADN sans l’utilisation d’une courbe d’étalonnage39,48. La limite inférieure de détection de cette technique pour Borrelia est également une dizaine de spirochètes/échantillon39. Par rapport aux nPCR, ces approches ont aussi l’avantage de réduire les risques de contamination, car ils n’ont besoin que d’un protocole unique d’amplification.
Si l’objectif de la surveillance est plutôt pour profiler le contenu bactérien varié d’une tique, dépistage de métagénomique ARNr 16 s est une option attrayante49. Bien que cette approche est plus coûteuse et nécessite des séquenceurs d’ADN spécialisés non trouvés dans tous les laboratoires de biologie moléculaire nécessite plus sophistiquée interprétation basée sur la bio-informatique, il peut capturer un large éventail de microbes à plus précisément représenter la charge pathogène du vecteur.
Tandis que qPCR et ses dérivés sont des méthodes de choix pour les applications quantitatives, et métagénomique écrans offrent de vastes inventaires du microbiome tique, une surveillance ciblée des efforts sont préoccupent souvent binaire de signalement de la présence ou l’absence de un ou plusieurs agents pathogènes dans un vecteur. Dans de telles circonstances, ces approches nouvelles, plus élaborées peuvent introduire une complexité inutile et charge financière dans le processus. Pour ces raisons, nPCR a résisté à l’épreuve du temps comme une technique pivotale en tique test.

La maladie de Lyme (LD) est l’infection de transmission vectorielle plus répandue dans l’hémisphère Nord, et son incidence ne cesse d’augmenter de1. Cette maladie invalidante est causée par des pathogènes de la borréliose de Lyme (LB) complexe (communément dénommée Borrelia burgdorferi sensu lato, ou s.l.), qui comprend historiquement pathogène prédominant nord-américain, B. spirocheteal Borrelia sensu stricto (s.s), en plus de b. afzelii et b. garinii, qui sont répandus dans toute l’Europe et l’Asie et sont des espèces de nouveaux pertinence clinique2,3. Ces bactéries sont transmises aux humains par la morsure de tiques infectées de Ixodes 2. Bien que les principaux vecteurs d’Amérique du Nord sont I. scapularis et I. pacificus, plusieurs espèces au sein de ce genre ne se harbor et transmettre la bactérie4. Chez l’homme, b. burgdorferi peuvent provoquer des symptômes multisystémiques touchant la peau, articulations, coeur, système nerveux, les glandes endocrines, tractus gastro-intestinal et organes internes5,6,7, 8,9,10. Le Center for Disease Control and Prevention évalue actuellement plus 300 000 nouveaux cas humains chaque année dans les États-Unis11,12. Alors que le pronostic est souvent favorable lorsque la maladie est diagnostiquée et traitée dans les premiers stades, des études ont suggéré que n’importe où entre 10 % et 60 % des patients qui ont reçu le schéma d’antibiothérapie recommandé a continué à ressentir des symptômes après le traitement cessation, dans un phénomène appelé Syndrome de la maladie de Lyme pour le traitement Post (PTLDS)13,14,15. En outre, les délais d’intervention clinique peuvent survenir par suite du manque de conscience d’une morsure de tique, présentation non spécifiques de la maladie initiale et la faible sensibilité des traditionnelles axées sur la sérologie diagnostics lorsqu’il est utilisé au début de l’infection. Incapacité à traiter rapidement et correctement permet progression de symptômes qui peut se manifester de plus en plus débilitante complications16,17. Prévention de la maladie de Lyme est donc un élément fondamental de la gestion des risques. Stratégies pour lutter contre cette menace grandissante comprennent des mesures de surveillance robuste pour indiquer la prévalence de l’agent pathogène chez les tiques et d’identifient les régions géographiques d’intérêt.
Cet article démontre l’utilité de la réaction en chaîne de polymérase imbriqués (nPCR) comme outil de dépistage moléculaire permettant d’identifier des tiques infectées. Pour augmenter la spécificité, deux gènes de Borrelia sont utilisées pour l’amplification parallèle. B la flagelline (graisse) code pour une protéine de filament principal du flagelle18, et le gène est localisé sur le chromosome linéaire unique, alors que le produit de la lipoprotéine de Outer surface protéine A (OspA) intervient dans l’intestin de la tique la colonisation, et est codé plasmide19,20. Le flux de travail se compose de collection tique, extraction de l’ADN, puis une première ronde de la PCR pour détecter les Borrelia-loci spécifiques. PCR ultérieur utilise le produit de la première réaction comme un nouveau modèle pour générer des fragments d’amplification plus petits, interne. Une tique est considéré comme positive pour Borrelia burgdorferi , lorsque des amplicons intérieures de deux gènes de Borrelia peuvent être détectées par électrophorèse sur gel d’agarose.
Fois la technique nPCR et la graisse et l’OspA gènes cibles, ont été largement utilisées pour la surveillance écologique et de la détection clinique du spirochète de Lyme depuis le début des années 1990,21,22,23 ,24,25. Avant l’élaboration de protocoles moléculaires, les tiques ont été évalués en soumettant le contenu intestinal anti -Borrelia immunofluorescence (IF) coloration, culture microbienne, ou une combinaison des deux26. Ces approches souffrent de limitations inhérentes, notamment la croissance lente et fastidieuse de Borrelia27, problèmes de performances des anticorps et l’exigence de tiques vivants pour IF traitement21. PCR a été adopté afin de fournir une identification rapide, sensible et spécifique des vecteurs infectés. Il offre des améliorations marquées sur la méthode traditionnelle, y compris une application directe indépendante de la culture pour les types divers de spécimens, comme les tiques mortes et archivées qui seraient autrement impropres pour le test21,22 . Expérimentaux imbriquée de plus améliorer la spécificité et la sensibilité de la PCR classique en employant deux ensembles distincts d’amorces gène-spécifiques dans deux séries consécutives d’amplification25,28.
Succès expérimental est critique dépend de la conception de sélection et d’amplicon gène stratégique. Pour évaluer avec précision la présence de Borrelia burgdorferi, amorces doivent détecter les agents pathogènes concernés sans réagissant avec fièvre récurrente spirochètes aussi dans le genre Borrelia . Dans le cas de la graisse, cette spécificité est obtenue en ciblant une région variable interne de la gène, plutôt que les séquences flanquantes relativement conservées qui sont partagées par diverses bactéries (Figure 1)24,29 , 30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig1.jpg"> Figure 1 : la notion de nPCR, tel qu’illustré à l’aide de Borrelia FlaB gène comme cible. Les extrémités 5' et 3' du gène sont communes aux organismes au-delà Borrelia burgdorferi s.l., rendant ces régions impropres à l’évaluation spécifique des agents pathogènes causant le Lyme. En utilisant les séquences d’intérieurs moins conservée en tant que cibles d’apprêt, deux cycles de PCR sont exécutées pour détecter un amplicon final, interne. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Dans un essai de leur capacité discriminatoire, intérieur FlaB amorces ont été évaluées avec plus de 80 différents isolats de Borrelia et trouvés pour identifier uniquement celles associées à la maladie de Lyme,24. La limite inférieure de détection de nPCR a été documentée à entre six24 et dix31 bactéries de culture pure, bien que la sensibilité peut être encore améliorée en éponger l’amplicon Sud et hybridation un radiomarqué ou sonde de chimiluminescence. Les techniques de couplage permet de réduire le seuil de détection à un spirochète unique31. Par comparaison directe, PCR tour conventionnel, unprobed a été trouvé pour signaler la présence d’au moins 104 spirochètes31. Toutefois, il est à noter que la sensibilité sera plus faible lorsque vous travaillez avec des échantillons cliniques et environnementaux complexes, en raison de la présence massive d’ADN indépendant et de possibles substances inhibitrices. Ces défis peuvent être contournées en grande partie par l’utilisation de nPCR.
Malgré les progrès réalisés dans les technologies moléculaires au cours des dernières décennies, nPCR reste une technique discontinue dans les efforts de surveillance moderne. Si le soin dans la conception et l’exécution du présent protocole, c’est une approche relativement simple, puissante et adaptable pour capturer la présence d’agents pathogènes dans les tiques vectrices.

<table><tbody><tr><td>Armoire de sécurité biologique LabGard Classe II, Type A2</td><td>Nuaire</td><td>ES AIR NU-543&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>0,22 mm d’épaisseur</td></tr><tr><td>Tubes Microfuge (Microtubes 1,5 mL)</td><td>Axygen</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>AquaGenomic&nbsp ;</td><td>MultiTarget Pharmaceuticals</td><td>2030</td><td>Réactif d’extraction d’ADN</td></tr><tr><td>Microtube Pestle</td><td>Diamed</td><td>DIATEC610-1551</td><td>Conçu pour tubes de 1,5 ml</td></tr><tr><td>Bain-marie - Isotemp 202</td><td>Fishse Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Labnet</td><td>S0100 CAN</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge 24D Microcentrifugeuse numérique</td><td>Labnet</td><td>C2400</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Amorce Synthesis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cabinet</td><td>Misonix</td><td>PCR6-482</td><td></td></tr><tr><td>Tube PCR avec capuchons plats 0,2 mL</td><td>VWR</td><td>20170-012</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix 2x</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td>L’eau est livrée avec le GTG</td></tr><tr><td>Spectrafuge Mini</td><td>Labnet</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Tache d’ADN sûre 10 000X Concentration</td><td>EDVOTEK</td><td>608</td><td></td></tr><tr><td>Froggarose LE (Agarose de qualité biologie moléculaire)</td><td>FroggaBio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>GD 100 bp Échelle d’ADN</td><td>FroggaBio</td><td>DM001-R500&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Bloc d’électrophorèse&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>VWR 105</td><td>EC Apparatus Corporation</td></tr><tr><td>Fluor-S MultiImager&nbsp ;</td><td>BioRad</td><td>170-7700 (N° de série 433B0154)</td><td></td></tr><tr><td>Quantité Un logiciel d’analyse 1-D (V. 4.5.2)</td><td>BioRad</td><td>1709600</td><td></td></tr></tbody></table>

détecter le spirochete de la maladie de lyme, borrelia burgdorferi, chez les tiques à l’aide de la pcr nichée

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

La maladie de Lyme est une infection grave à transmission vectorielle qui est causée par la Borrelia burgdorferi sensu lato famille des spirochètes, qui sont transmis aux humains par la morsure de tiques Ixodes infectées. Le principal agent étiologique en Amérique du nord est Borrelia burgdorferi sensu stricto. Régions géographiques risque l’expansion, il est prudent de soutenir les programmes de surveillance robuste qui peuvent mesurer les taux d’infection de tiques et communiquer les résultats aux cliniciens vétérinaires et du grand public. La technique moléculaire de réaction en chaîne de polymérase imbriqués (nPCR) a longtemps été utilisée à cette fin, et il reste dans la détection de Borrelia dans les tiques et la faune de manière centrale, peu coûteux et robuste.
Cet article illustre l’application de nPCR de cocher des extraits d’ADN pour identifier les spécimens infectés. Deux indépendants cible de b. burgdorferi , gènes codant Flagelline B (graisse) et protéine de surface externe A (OspA), ont été largement utilisés avec cette technique. Le protocole implique collection tique, extraction de l’ADN, puis une première ronde de la PCR pour détecter chacune des deux Borrelia-loci spécifiques. Subséquente d’amplification génique (PCR) utilise le produit de la première réaction comme un nouveau modèle pour générer des fragments d’amplification plus petits, interne. La démarche imbriquée améliore la spécificité et la sensibilité de la PCR classique. Une tique est considérée comme positive pour l’agent pathogène lorsque des amplicons intérieures de deux gènes de Borrelia peuvent être détectées par électrophorèse sur gel d’agarose.

nPCR est une approche élégante, d’augmenter la spécificité et la sensibilité de détection des pathogènes, particulièrement lorsque les échantillons environnementaux complexes sont incriminés. Comme illustré à la Figure 1, deux cycles de PCR ciblant une région stratégique du Borrelia FlaB locus (et OspA, non illustré) peuvent signaler la présence de la bactérie Borrelia burgdorferi grâce à la génération de la court intérieure amplicons. Lorsque résolu par électrophorèse sur gel, les graisse et OspA produits de réaction de chaque graduation peuvent être visuellement a marqué et comparés à des contrôles. Dans la Figure 2, identificateurs unique spécimen sont prévus le long de la partie supérieure de chaque gel et contrôles non-modèle et aérosols sont représentés à gauche et à droite, respectivement, adjacents à des échelles.
Amplicon robuste bandes sont clairement visibles dans certains échantillons expérimentaux, et ils sont facilement distingués des amorces excédentaires et l’ADN résiduel (Figure 2). Basé sur les principes de conception expérimentale, une tique est considéré comme positive pour Borrelia en parallèle des contrôles négatifs ne montrent aucune amplification et amplicons intérieures proviennent des amorces de la graisse et l’OspA . Dans ce cas, spécimens T907 T604 et T606 correspond aux critères de surveillance de l’agent pathogène de Lyme (Figure 2). By Contrast, T923 n’était positif pour l' OspA, un résultat pour lequel il y a plusieurs explications possibles : A) la tique d’origine a été négative pour Borrelia, mais la préparation extérieure ou intérieure de OspA PCR a été faussement contaminée par modèle ADN (Notez que la contamination systémique des réactifs a été écartée par l’intermédiaire du contrôle négatif), B) la tique conduites Lyme Borrelia, mais modèle faibles montants ou les erreurs expérimentales ont empêché l’amplification de la graisse, ou C) un organisme était présent qui contient la séquence de OspA conservée, mais manquait de flagelline ou avait une identité insuffisante dans la région ciblée de graisse de recuire pour les amorces. En effet, les similitudes de séquences OspA ont été relevées dans une variété d’organismes, y compris les plantes et les animaux28. La situation inverse, amplification des plus conservé le gène de la flagelline , mais pas le gène de l’OspA , pourrait indiquer une espèce apparentée de Borrelia . Dans la pratique, ce protocole donne des résultats positifs single OspA plus que ne le font les amorces de graisse , ce qui suggère que le scénario « A » est l’explication la moins probable. Sans plus loin l’analyse expérimentale du spécimen litigieux, cependant, il n’est pas possible de déterminer la source du résultat positif unique. Augmentation du nombre de réplicats techniques effectuées sur des échantillons équivoques peut aider à concilier leur véritable statut, puisque tous les contaminants qui ont été faussement présentés aux réactions précédentes ne serait pas présents dans l’ADN archivé. Toutefois, si des réactions subséquentes avec ces amorces ne parviennent pas à fournir des résultats concluants, autres locus Borrelia puissent être examinés par PCR. Amplicons générés par ces réactions puissent également être séquencé et comparées entre les isolats afin d’assigner l’identité et estimer le degré de divergence de la souche. SAPI et ses collaborateurs fournissent un exemple de ce flux de travail à l’aide d’échantillons cliniques humains35.
Tous les facteurs pris en compte, les critères décrits de protocole et l’interprétation ont été estimées à produire des fausses positifs et de fausses négatifs taux de 0,17 % et 0,0063 %, respectivement.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig2.jpg"> Figure 2 : Détection de Borrelia burgdorferi chez les tiques individuels par nPCR de FlaB et OspA. Codes assignés à chaque graduation sont représentées dans la partie supérieure des gels et identités aligneraient verticalement pour signaler la détection de l’OspA et graisse dans chaque échantillon. Lanes intitulé B à gauche des contrôles d’image représentent non-modèle, alors qu’un (voies de droite) sont des contrôles d’aérosol pour capturer la contamination de l’environnement de laboratoire. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

PCR nichée est une technique sensible, spécifique et simple qui peut être appliquée aux tiques QU'ADN extraits pour sonder pour Borrelia burgdorferi, l’agent causal de la maladie de Lyme. La première expérience PCR utilise des amorces de gène-spécifique pour générer des amplicons longs, qui deviennent alors des modèles pour une réaction à l’aide d’amorces internes.

Détecter le Spirochete de la maladie de Lyme, Borrelia Burgdorferi, chez les tiques à l’aide de la PCR nichée

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

La maladie de Lyme est une maladie débilitante causée par l’agent pathogène spirochète Borrelia burgdorferi sensu lato. La bactérie est transmise à l’homme par la morsure d’une tique infectée et provoque des symptômes multisystémiques qui peuvent affecter la peau, les articulations, le cœur et le système nerveux. Les activités quotidiennes comme la promenade du chien et la randonnée peuvent exposer les gens à un risque accru de contracter la maladie de Lyme.Les stratégies de lutte contre cette menace croissante comprennent donc des mesures de surveillance robustes qui peuvent indiquer la prévalence de l’agent pathogène chez les tiques et identifier les régions géographiques préoccupantes. Cette vidéo démontre l’utilité de la réaction en chaîne polymère imbriquée comme outil de criblage moléculaire de Borrelia. Pour augmenter spécifiquement, les gènes de la protéine A de la surface externe et de la flagelline B sont ciblés pour l’amplification.Le flux de travail commence par la collecte de tiques, l’extraction de l’ADN, puis une première série de PCR pour détecter les loci spécifiques à Borrelia. La PCR de second tour utilise le produit de la première réaction comme nouveau modèle pour générer des fragments d’amplification interne plus petits. Une tique est considérée comme positive pour l’agent pathogène lorsque les amplicons internes des deux gènes Borrelia peuvent être détectés par électrophorèse sur gel d’agarose.La surveillance passive fait appel à l’aide de citoyens et de vétérinaires pour recueillir et soumettre les tiques à des fins d’analyse. Dans le cadre de ce processus, il est important de saisir des informations telles que l’hôte de la tique, la date et le lieu de la rencontre. En laboratoire, les tiques doivent d’abord être photographiées et identifiées sur la base d’une comparaison morphologique avec des clés standard.La sensibilité de la PCR imbriquée rend cette technique vulnérable à la contamination, de sorte que chaque étape du traitement des échantillons doit se dérouler dans un endroit distinct et propre, et plusieurs contrôles doivent être inclus pour s’assurer que les réactifs et l’environnement sont exempts de contaminants. Une fois que l’espace de travail a été convenablement préparé, coupez la tique en deux dans une enceinte de sécurité biologique stérilisée et placez-en la moitié dans un tube de microcentrifugation. Toute procédure d’isolement de l’ADN qui permet d’obtenir un modèle compatible avec la PCR peut être utilisée.Cette vidéo montre une extraction simple de l’ADN basée sur la chélation. Pour commencer, ajoutez un volume approprié de tampon de chélation lytique en fonction de la taille du fragment de tique et homogénéisez à l’aide d’un pilon à microtubes. Incuber les échantillons dans un bain-marie à 60 degrés Celsius pendant 45 minutes, vortex, puis centrifuger le contenu.En attendant, préparez de nouveaux tubes de microcentrifugation pour chaque échantillon en aliquotant 50 micromètres d’isopropanol. Transférez le surnageant dans le nouveau tube de microcentrifugation, mélangez par inversion et recentrifugez comme précédemment. Cette fois, jetez le surnageant et rincez la pastille d’ADN avec de l’éthanol à 70 %.Retirez le liquide résiduel à l’aide d’une pipette et faites sécher la pastille à l’air libre pendant 15 minutes à température ambiante. Enfin, ajoutez 50 micromètres de Tris de 1 millimolaire à chaque pastille et incubez pendant une heure dans un bain-marie à 60 degrés pour remettre l’ADN en suspension. Les échantillons peuvent désormais être stockés à moins 20 degrés Celsius pour de futures analyses moléculaires.Commencez par stériliser une armoire PCR à l’aide de lumière UV et d’éthanol à 70 %. Le cocktail réactionnel se compose d’un mélange maître contenant la polymérase, de l’eau, des amorces externes directes et inverses et l’ADN extrait lors de la procédure précédente. Des réactions distinctes sont mises en place pour détecter l’OspA et le FlaB indépendamment dans chaque échantillon de tique.Centrifugez les échantillons, placez-les dans un thermocycleur et programmez la machine. L’expérience PCR initiale utilise des amorces externes spécifiques au gène qui produisent de longs amplicons. Les produits PCR de la première réaction deviennent alors le modèle pour l’amplification ultérieure.Cette PCR imbriquée utilise des amorces spécifiques au gène qui se renouvellent dans le premier amplicon pour produire de nouveaux fragments d’ADN plus courts. Le produit de la deuxième réaction peut maintenant être chargé à côté d’une échelle de référence de masse moléculaire sur un gel d’agarose à 1,2 % et électrophorisé pendant une heure. Enfin, visualisez le gel à l’aide d’un transilluminateur.Dans cet exemple, chaque couloir représente un échantillon de tique différent, analysé à la fois pour l’OspA et le FlaB. Les amplicons ne sont présents que dans certaines des voies. Bien que ces deux échantillons aient tous deux généré des produits PCR pour OspA, un seul d’entre eux a capturé FlaB.Un échantillon doit produire des bandes pour que les deux gènes soient considérés comme positifs. L’inspection visuelle des produits PCR permet ainsi de déterminer le statut Borrelia de chaque tique. Dans l’ensemble, la PCR imbriquée est une technique sensible, spécifique et relativement simple qui peut être appliquée à la surveillance de Borrelia.Les données générées dans le cadre de ces initiatives peuvent aider à identifier les régions géographiquement préoccupantes pour la maladie de Lyme et à estimer la prévalence de cet agent pathogène dans la nature.

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