Name: Établir des modèles de souris pour troubles neurologiques Zika Viro-induite à l’aide de stratégies d’Injection intracérébrale : embryonnaires, néonatals et adultes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Découvrez une méthode d'injection intracérébrale pour établir des modèles murins d'infection par le virus Zika à différents stades du développement. Cette technique permet d'étudier la pathogenèse virale et les troubles neurologiques associés.

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Les auteurs aimerait remercier les Dr Abdellatif Benraiss à l’Université de Rochester pour son mentorat et des discussions pertinentes à l’apprentissage des adultes chirurgicaux et des techniques de nouveau-né. Les auteurs aimerait également remercier Dr James Lauderdale à UGA pour l’utilisation de son équipement stéréotaxique et discussions liées à la mise en place de la méthodologie utilisée pour cette technique et à la promotion de la Fondation Collège de recherches scientifiques (ARCS) pour leur appui et notre soutien de NIH (NINDS accorde R01NS096176-02, R01NS097231-01 et F99NS105187-01).

Tous les animaux utilisent protocoles suivre les directives de protection des animaux de l’Université de Californie du Sud et de l’Université de Georgie. Méthodes d’euthanasie pour les mères enceintes et les adultes sont effectuées selon les protocoles approuvés : asphyxie de dioxyde de carbone, suivie d’une dislocation cervicale comme méthode secondaire afin d’assurer l’euthanasie. Les chiots nouveau-nés sont euthanasiés par décapitation.
ATTENTION : Le protocole suivant consiste à manipuler un virus pathogène. Les précautions appropriées doivent être prises lors de la manipulation du virus. Tous les protocoles doivent être approuvés par l’accord préalable du Comité institutionnel approprié à utiliser.
1. embryonnaire Inoculation intracérébrale du Virus Zika
<ol><li>Pour enfichage enceintes chronométré, envisager de midi le jour après l’accouplement comme E0.5. Appariement des souris à la fin de la journée et vérifier les fiches tôt le matin afin de réduire la variabilité du temps de l’accouplement.</li>
	<li>Préparer l’aiguille de verre avant la chirurgie. Tirez l’aiguille coupée à 1/3 de sa longueur, puis affiner à un angle de 45° à l’aide d’un broyeur d’une micropipette avec une goutte d’eau jusqu'à ce que le pore est dimensionné pour 50-70 µm. cocher aiguille les embouts sous un stéréoscope pour la qualité et de la rupture.</li>
	<li>Gardez le virus aliquote sur la glace. Juste avant la chirurgie, charger le mélange d’injection de ZIKV dans l’aiguille d’injection de verre préparés. Assembler la seringue d’injection étanche (volume de 50 µL), luer-lock et tubes et saturer la seringue Assemblée avec le tube avec de l’huile minérale. Une fois saturés, fixer l’aiguille et tirer ~ 6-7 µL ZIKV dans l’aiguille (~ 1 µL est 1,7 × 106 TCID50/mL).</li>
	<li>Injecter des enceintes C57BL/6J ou 129S1/SvImJ souris avec des embryons E14.5 jour embryonnaire (pour injection intracrânienne) ou des embryons de E10.5 (pour injection intra-utérine) avec le chlorhydrate de kétamine (80-100 mg/kg) et de xylazine (5-10 mg/kg) diluée dans une solution saline stérile par voie intrapéritonéale pour induire l’anesthésie chez la mère. Alternativement, anesthésier les mères à l’isoflurane surveillé isoflurane fournie par inhalation, avec récupération d’effluents gazeux, le cas échéant. Injecter la buprénorphine-SR (0.5-1.0mg/kg) par voie sous-cutanée pour induire une analgésie.</li>
	<li>Test du pincement anesthésiés mères sur le bout de l’orteil ou la queue et puis disposez-les en position couchée sur un bloc de chauffage approuvé par animal (pad thermique de 100 x 200 2. 5 mm). La pince de pincée d’orteil n’est pas stérile et ne servent pas à manipuler le tissu en chirurgie. Alternativement, mains gantées peuvent servir à tester le réflexe de retrait orteil pincée. Remarque : Reportez-vous à votre personnel vétérinaire institutionnel pour la périopératoire préféré méthode de chauffage. Une couverture a été placée entre ce coussin chauffant et l’animal.</li>
	<li>Ajouter pommade ophtalmique pour les yeux.</li>
	<li>Raser la surface de l’abdomen et stériliser avec l’iode et d’alcool trois fois. Alterner les lingettes d’iode et d’alcool ; essuyer dans un mouvement circulaire en dehors du site chirurgical.</li>
	<li>Drapé de la peau qui entoure le site de la chirurgie avec des chiffons stériles pour éviter la contamination de l’incision et les instruments. Remarque : L’ouverture de la draperie ne doit pas être plus grand que le site chirurgical préparé ; aucun cheveux ne doivent être considérés dans l’ouverture de la draperie.</li>
	<li>Pincer la peau de la mère de son abdomen avec une pince et couper le bas de l’abdomen dans une ligne de 1 à 1,5 cm sur la ligne sagittale médiane avec des ciseaux chirurgicaux stériles. Cette coupe dans la peau et plus loin dans la cavité abdominale afin que les embryons sont maintenant exposés. NOTE : Les ciseaux chirurgicaux est utilisés pour inciser la peau et la couche péritonéale. Gants et instruments stériles sont utilisés pour chaque intervention chirurgicale.</li>
	<li>Couper une fente au milieu d’une petite gaze stérile et appliquer sur le dessus de l’ouverture chirurgicale. Hydrater avec du sérum physiologique stérile. Tirez sur les embryons à travers la fente pour se reposer sur la gaze stérile, avec soin pour n'enlever pas plus de 4-5 embryons, en se concentrant sur une corne utérine en même temps.</li>
	<li>Hydrater les embryons avec une solution saline stérile avant et tout au long de l’inoculation pour s’assurer qu’ils ne s’assèchent pas. Garder une trace de dont les embryons sont injectés et leur position dans la corne utérine. Embryons individuels sont donc considérés comme des expériences distinctes, que les embryons ne changent pas de position tout en développant dans l’utérus. (Passez à l’étape de 1,15 pour injection intra-utérine).</li>
	<li>Placez délicatement une spatule sous la tête de l’embryon. Éclairer les embryons bien avec une lampe de visualiser les sutures de la tête et le crâne. Remarque : Une technique aseptique est suivie, y compris des instruments et des gants chirurgicaux stériles. Après des éléments non stériles (comme la lampe) sont manipulées, gants devraient être remplacés par nouveaux gants stériles avant de manipuler des instruments stériles et zones.</li>
	<li>Position de la tête en manipulant l’embryon avec la lampe (derrière la tête pour une visibilité) et doigts libres jusqu'à ce que la tête de l’embryon est remontée directement contre la paroi de l’utérus et maintenue en place avec la main non dominante. NOTE : Positionnement de l’embryon est une partie essentielle et la technique qui prend la plupart de la pratique. Trop forte pression du doigt peut endommager les membranes embryonnaires conduisant à la détermination de la létalité et pas assez de pression risquent de compliquer l’injection.</li>
	<li>Utiliser les vaisseaux sanguins, le long de la suture du crâne comme guide. Injecter le virus ZIKV (~ 1 µL, 1,7 × 106 MEX1 isolat mexicain TCID50/mL-44) dans les ventricules latéraux du cerveau embryonnaire E14.5 avec l’assemblé seringue et une aiguille. Utiliser les fluides comme une injection simulée.</li>
	<li>Pour améliorer la rétention de la grossesse, éviter l’injection virale de deux embryons à côté les ovaires et les deux embryons à côté le vagin supérieur (Figure 1 a). Dans l’ensemble, pas plus de 6 embryons sont injectées par portée pour réduire le temps de la chirurgie et de prévenir la perte de l’embryon.</li>
	<li>Remettre les embryons injectés dans les mères enceintes et remplir la cavité abdominale avec ~ 0,5 mL de solution saline stérile. Pour fermer, de suture tout d’abord les deux le muscle péritonéal abdominal et puis ensuite suturer la couche externe de la peau avec 4,0 sutures stériles. Il est préférable d’utiliser des sutures interrompus ; Il y a possibilité de déhiscence de la plaie si la souris mâche la suture.</li>
	<li>Placez votre souris dans une cage partiellement reposant sur un coussin chauffant pour permettre à la souris échapper à un espace non chauffé si nécessaire. Surveiller les mères qu’ils se rétablissent (1-2 h) de l’anesthésie. Développer les embryons après que chirurgie pour variait selon les expériences individuelles.</li>
	<li>
Injection intra-utérine
	<ol>
<li>Avec une corne utérine et embryons exposés, utiliser une aiguille de seringue et 27G de 1 mL pour injecter des virus de Zika 100 μL (106 TCID50 unités en suspension dans 100 μL DMEM), ou fluide, dans l’espace intra-utérin ou dans le tissu placentaire. Notez quelles les embryons ont été injectés pour les dissections de stade embryonnaire. Voir les travaux déjà publié pour plus de détails18.</li>
		<li>Remettre les embryons injectés dans les mères enceintes et remplir la cavité abdominale avec ~ 0,5 mL de solution saline stérile. Pour fermer, tout d’abord de suture du muscle péritonéal abdominal et puis ensuite suturer la couche externe de la peau avec 4,0 sutures stériles. Il est préférable d’utiliser des sutures interrompus ; Il y a possibilité de déhiscence de la plaie si la souris mâche la suture.</li>
		<li>Placez votre souris dans une cage partiellement reposant sur un coussin chauffant pour permettre à la souris échapper à un espace non chauffé si nécessaire. Surveiller les mères qu’ils se rétablissent (1-2 h) de l’anesthésie. Développer les embryons après que chirurgie pour variait selon les expériences individuelles.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. néonatale Inoculation intracérébrale du Virus Zika : P0/P1
<ol><li>Veiller à ce que les seringues d’injection étanche (volume de 10 µL) et les aiguilles ne sont pas bouchés. Nettoyer et examiner en chargeant trois seringues de 20 mL avec des aiguilles de calibre 26 : l’un avec du sérum physiologique, un éthanol à 70 % et un avec de l’air pour dégager des solutions. Stériliser avec eau de Javel 10 % si déjà utilisé pour l’injection de virus.</li>
	<li>Gardez le virus sur la glace. Charger la seringue en la remplissant avec du sérum physiologique afin de réduire le volume mort dans la seringue et dessiner 0,75 µL de l’air pour séparer le matériel d’injection de la solution saline.</li>
	<li>Créer une chambre de récupération humidifié chauffée pour les petits injectées. À l’aide d’un bloc de chauffage, placer un récipient à fermeture (par exemple, une boîte vide de pointe) avec une gaze stérile et humecter avec du sérum physiologique. Préchauffer avant de commencer les injections.</li>
	<li>Mettre en place le microinjector y compris la pompe et le contrôleur. Déterminer le code de type de périphérique pour la seringue spécifique (c.-à-d.pour une seringue de 10 µL, le type de périphérique est « D »). Déterminer la vitesse d’injection.</li>
	<li>Recueillir les chiots de jour après la naissance, 0 ou 1 (P1/P0) près de l’installation chirurgicale. Charger la seringue d’injection avec le virus. Désinfecter le chiot tête de montage avec 70 % EtOH.</li>
	<li>Envelopper les chiots dans une mince couche de gaze et enterrer complètement dans la glace d’atteindre un État anesthésique. Chiots sont cryoanesthetized pendant 5 min. veiller à ce que les chiots sont suffisamment anesthésiés pour injection en effectuant une pincée de queue/orteil sans réponse. Cela donne à peu près 15 min d’un État anesthésique.</li>
	<li>Placez le chiot sur la tête de montage, stériliser la surface de la tête avec l’iode et l’éthanol (trois fois) et puis essuyer avec une lingette stérile (isopropanol ou 70 % EtOH).</li>
	<li>Marquer lambda avec un marqueur noir et d’enregistrer les coordonnées à lambda à l’aide de l’instrument stéréotaxique. Mesure la distance entre lambda et le bord de le œil et le début des coordonnées stéréotaxiques de lambda calcul de la distance de 2/5 de lambda à l’oeil (pour les deux hémisphères si vous s’injectent les deux).</li>
	<li>Re-vérifier la profondeur anesthésique avant de créer un trou pour le site d’injection. Utiliser une aiguille de calibre 26 pour soigneusement et superficiellement perforer le cuir chevelu et le crâne à l’endroit de l’injection (le crâne est très mou chez les nouveau-nés) pour créer une ouverture pour l’aiguille d’injection.</li>
	<li>Piquez l’aiguille d’injection dans l’endroit percé et une fois que l’aiguille a juste manqué la peau, calculer une profondeur de 1 mm pour le site d’injection (ventricule latéral) à l’aide de l’instrument stéréotaxique.</li>
	<li>Une fois que l’aiguille descend à la profondeur de l’injection, la microinjector d’injecter de programme : 1 µL de virus, à un taux de 10 nL/s, en injectant environ 1 µL plus 1,5 min (~ 1 μl 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV).</li>
	<li>Lorsque l’injection terminée, attendre 30 s et retirer l’aiguille en incréments de 0,5 mm en tournant la vis (sur le dos), attendre 30 s après chaque incrément. Remarque : Ceci réduit la fuite du virus injecté.</li>
	<li>Une fois enlevé, soit charger rapidement l’aiguille et la seringue avec davantage de virus (différents virus ou fausses contrôles doivent être chargés dans des seringues/aiguilles séparées) ou retirer le chiot de la tête de montage à la chambre humidifiée préchauffée. Surveiller le chiot toutes les quelques minutes pour jauger la récupération. Remplacer les chiots avec sa litière.</li>
</ol>3. adulte Inoculation intracérébrale du Virus Zika
<ol><li>Injecter à des souris adultes par voie intrapéritonéale avec le chlorhydrate de kétamine (80-100 mg/kg) et de xylazine (5-10 mg/kg) diluées dans du sérum physiologique stérile pour induire l’anesthésie. Injecter la buprénorphine-SR (0.5-1.0mg/kg) par voie sous-cutanée pour induire une analgésie. TEP/queue pincer la souris pour s’assurer de son état d’anesthésie et par la suite monter sur l’instrument stéréotaxique (avec un coussin chauffant) pour immobiliser la tête au cours de la chirurgie.</li>
	<li>Pommade ophtalmique s’ajoute les yeux pour éviter que les yeux de la souris se dessèchent pendant la chirurgie. Raser le cuir chevelu à partir derrière les yeux vers le début des oreilles. Stériliser la peau exposée avec iode et 70 % EtOH trois fois. Alterner les lingettes d’iode et d’alcool ; essuyer dans un mouvement circulaire en dehors du site chirurgical.</li>
	<li>Re-vérifier la profondeur anesthésique avant l’incision de la peau. À l’aide d’un scalpel, faire une incision de 0,5 cm le long de la ligne sagittale médiane de la tête à l’endroit stérilisé, exposant bregma. À l’aide d’un mouvement de roulis avec un coton-tige, dégager la surface du crâne des tissus méningés, tout en poussant simultanément la peau loin des sites d’injection.</li>
	<li>A partir de bregma, alignez le foret chirurgicale et identifier les sites d’injection en utilisant les coordonnées suivantes : AP-0,50 mm, ML : +/-1,5 mm. à l’aide de la pédale de contrôle, percer le crâne lentement quant à percer seulement OS jusqu'à ce qu’un trou a été autorisé pour l’aiguille.</li>
	<li>Remplacer la perceuse avec la pompe de microinjector et la seringue étanche (volume de 10 µL) sur le stéréotaxiques. Laissant une bulle d’air petit entre le virus et la solution saline, dessiner ~ 4-5 µL de virus. Déterminer le code de type de périphérique pour le volume de la seringue spécifique (c’est à dire, D pour seringue de volume 10 μL). Piquez l’aiguille à DV :-1,50 mm de la surface du cerveau. Pour injecter 1 µL de virus, programmer un taux de 10 nL/s, en injectant environ 1 µL plus 1,5 min.</li>
	<li>Lorsque l’injection terminée, attendre 30 s et retirer l’aiguille en incréments de 0,5 mm, attendre 30 s après chaque tour. Cela réduit les reflux et la fuite du virus injecté.</li>
	<li>Lors de l’administré est finis, utiliser des pinces pour détacher la peau et pour récupérer le crâne exposé. Suture le cuir chevelu en arrière à l’aide de 4,0 sutures et retirer la souris de l’instrument stéréotaxique. Place la souris dans une cage partiellement reposant sur un coussin chauffant pour permettre à la souris échapper à un espace non chauffé si nécessaire et de contrôler qu’ils se rétablissent (1-2 h) de l’anesthésie.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Décrite ici est une méthode pour l’inoculation intracérébrale de la ZIKV à des stades embryonnaires, néonatals et adultes d’enquête sur les dommages induits par ZIKV dans le développement du cerveau. Bien que simple, il y a quelques considérations que les enquêteurs devraient prendre pour assurer la qualité de l’étude et la sécurité des personnes impliquées.
Ministère de l’environnement est étroitement liée à ZIKV du genre flavivirus. Ministère de l’environnement n’a pas été liée causalement a...

Microcéphalie est un état résultant de l’évolution de cerveau défectueux caractérisée par plus petit que la taille moyenne de la tête chez le nouveau-né. Enfants avec microcéphalie présentent une série de symptômes qui peuvent comprendre un retard de développement, saisie, déficience intellectuelle, surdité, troubles de la vue et problèmes avec le mouvement et l’équilibre, entre autres, selon la gravité de la maladie et causer1,2,3. Cette condition est multifactorielle dans la nature, avec agent génétique, infectieux et des facteurs environnementaux liés aux provoquant une microcéphalie4,5,6,7,8, 9. Avant le déclenchement de 2015-2016 ZIKV, 8 enfants sur 10 000 naissances ont été diagnostiqués avec microcéphalie aux États-Unis selon le CDC10. Sur Février 1st de 2016, l’Organisation mondiale de la santé a déclaré le virus Zika un enjeu de santé publique d’urgence de l’International en raison de l’augmentation alarmante des diagnostics de microcéphalie associée à une infection ZIKV mères11, 12. Une étude récente de la CDC sur les cas ZIKV aux États-Unis suggère que la maternelle ZIKV infection entraîne un risque 20 fois pour un enfant de développer une microcéphalie par rapport aux personnes non infectées et 4 % de mères ZIKV infecté des USA ont donné lieu à enfants avec microcéphalie11. Le taux d’anomalies congénitales associées à une microcéphalie pendant la grossesse de l’infection de ZIKV au Brésil ont été signalés ont touché jusqu'à 17 % des bébés de mères infectées, ce qui indique qu’en Amérique latine des autres facteurs peuvent contribuer à l’augmentation du risque 13. alors que nous savons que le ZIKV peut entraîner une microcéphalie et pathogenèse progénitrices neurales cellulaire (NPC) population7,8,14, la pathogenèse complete de ZIKV dans le développement du cerveau reste insaisissable. Il est important de développer des modèles animaux afin d’étudier les mécanismes de la maladie qui sous-tendent les anomalies du cerveau associées à une infection ZIKV.
Etudier directement l’effet de la ZIKV sur le développement du cerveau, nous avons tout d’abord développé un modèle de souris à l’aide de l’inoculation intracérébrale du cerveau (E14.5) 14,5 de jour embryonnaire avec ZIKV7. Ce stade a été choisi car il est considéré comme représentant de la fin du premier trimestre de la gestation humaine14. Chiots peuvent survivre jusqu'à jour après la naissance 5 (P5) avec cette méthode d’injection intracérébrale embryonnaire (~ 1 µL de 1,7 x 106 vitroplants dose infectieuse (TCID50/mL)). Ces chiots postnatals présentent une gamme des phénotypes de même chez les nourrissons humains infectés y compris les ventricules, perte neuronale, raréfaction axonale, astrogliosis et microglial activation12,15. Un cerveau de souris nouveau-né est relativement immature, proche du stade de développement du cerveau humain au milieu de la gestation,16, et développement de cerveau de souris comprend une composante majeure de postnatale. Afin d’étudier plus tard infections stade de gestation, une méthode d’infection postnatale est également décrite. Les nouveau-nés infectés par ZIKV au P1 sont capables de survivre jusqu'à à 13 jours après injection. Infection de sang-né un stade adulte a été décrit chez la souris auparavant17 mais nécessite l’utilisation de facteurs de la transcription de facteur régulateur (IRF) de l’interféron (IFN) IRF-3, -5, souche triple-7. Ce protocole décrit une méthode d’inoculation ZIKV intraventriculaire pour contourner la désactivation de la réponse antivirale du modèle murin chez l’adulte. Alors que cela contourne le système immunitaire murin, cette voie d’injection n’imite pas directement la voie typique d’infection. Pour résoudre cette divergence, l’expérimentateur peut exécuter directement une infection intra-utérine de ZIKV au lieu de la voie intracrânienne. Adopté du précédent travail18, nous avons décrit brièvement cette technique dans le présent protocole embryonnaire de l’infection.
Les souches de virus Zika mis en oeuvre avec cette technique sont l’isolat mexicain MEX1-447,19 et l’africain isoler M.-766, isolé en 194720. Zika MEX1-44 a été isolé au Chiapas, au Mexique en janvier de 2016 d’un infecté Aedes aegypti moustique. Nous avons obtenu ce virus avec la permission par le biais de l’University of Texas Medical Branch à Galveston (UTMB). En outre, le sérotype de virus de la Dengue 2 (DENV2) a été inoculé à l’aide de cette technique dans une étude de comparaison. DENV2, souche S16803 (séquence GenBank GU289914), a été isolé dans un échantillon de patient de Thaïlande en 1974 et repiquées dans les cellules C6/36. Le virus a été repiquée deux fois dans les cellules Vero par le centre de référence mondial pour virus émergents et les arbovirus (WRCEVA) avant les injections de souris. Cela démontre que cette technique fonctionne aussi bien pour les diverses souches de ZIKV et autres flavivirus qui peuvent avoir un impact sur le développement du cerveau.

<table><tbody><tr><td>Arbre d’entraînement flexible Perceuse Moteur suspendu</td><td>Leica</td><td>39416001</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Stereotax</td><td>Kopf</td><td>04557R</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 Contrôleur de pompe à microseringue</td><td>WPI</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>UMP3 UltraMicroPump</td><td>WPI</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Modulamp</td> Schott-Luer-lock <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubing (calibre 19)</td><td>Hamilton</td><td>90619</td><td></td></tr><tr><td>Point de fusion Capillaire</td><td>Kimble</td><td>34500-99</td><td>Aiguille en verre</td></tr><tr><td>Fluoro-Max : Rouge Microsphères fluorescentes</td><td>Thermo Scientific</td><td>R25</td><td>Pas de dilution ; Utilisation pour les injections de pratique</td></tr><tr><td>10 & micro ; L, Modèle 1701 LT SYR</td><td>Hamilton</td><td>80001</td><td>pour l’inoculation embryonnaire</td></tr><tr><td>10 &micro ; L, Modèle 1701 RN SYR, Petit NDL amovible, 26s ga, 2 po, point style 2</td><td>Hamilton</td><td>80030</td><td>pour nouveau-né/adulte</td></tr><tr><td>4-0 Ethilon Nylon Sutures</td><td>Ethicon-Mineral</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Oil</td><td>VWR-micropipette</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>extracteur Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Grinder</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Fastgreen FCF Dye</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td>injecter avec 0,5 % Dye</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flavivirus antigène</td><td>anticorps Millipore</td><td>MAB10216</td><td>ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3)</td></tr><tr><td>Pax6</td><td>DBHB</td><td>Pax6-s</td><td>ms IgG1 1:20</td></tr></tbody></table>

Établir des modèles de souris pour troubles neurologiques zika viro-induite à l’aide de stratégies d’injection intracérébrale : embryonnaires, néonatals et adultes

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

Le virus Zika (ZIKV) est un flavivirus actuellement endémique dans le Nord, centrale et l’Amérique du Sud. Il est maintenant établi que le ZIKV peut entraîner une microcéphalie et des anomalies cérébrales supplémentaires. Toutefois, le mécanisme sous-jacent à la pathogenèse de ZIKV dans le cerveau en développement reste peu clair. Les méthodes chirurgicales intracérébrales sont fréquemment utilisés dans la recherche en neurosciences pour répondre aux questions sur le développement cérébral normal et anormal et le fonctionnement du cerveau. Ce protocole utilise des techniques chirurgicales classiques et décrit des méthodes qui permettent de maladie neurologique humaine du ZIKV-associés-modèle dans le système nerveux de la souris. Alors que l’inoculation directe cerveau ne modélise pas le mode normal de transmission du virus, la méthode permet aux enquêteurs à poser des questions ciblées sur la conséquence après infection de ZIKV du cerveau en développement. Ce protocole décrit des stades embryonnaires, néonatals et adultes d’inoculation intraventriculaire de ZIKV. Une fois maîtrisé, cette méthode peut devenir une technique simple et reproductible qui ne prend que quelques heures à effectuer.

Images représentatives de nos méthodes d’injection pour l’inoculation de la ZIKV du cerveau embryonnaire sont affichés dans les diagrammes illustrant les injections intracérébrales (Figure 1 a) et intra-utérine et des injections d’intraplacental (Figure 1 b), illustrant la passant le barrage enceinte et embryons doivent être lus et orientés pour la chirurgie (protocole embryonnaire inoculation). Figure 2 a</s...

Nous décrivons ici une méthode pour établir un modèle de Zika Viro-induite microcéphalie chez la souris. Ce protocole inclut des méthodes pour l’inoculation intracérébrale embryonnaire, néonatale et adulte-stade du virus Zika.

Établir des modèles de souris pour troubles neurologiques Zika Viro-induite à l’aide de stratégies d’Injection intracérébrale : embryonnaires, néonatals et adultes

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

L’objectif global des méthodes chirurgicales présentées ici est d’établir des modèles in vivo d’infection intracrânienne par le virus Zika. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le terrain, telles que la pathologie et le mécanisme de l’infection par le virus Zika dans le cerveau à la fois au stade précoce et ultérieur du développement ainsi qu’au stade adulte. Le principal avantage de cette technique est que l’infection de direction du cerveau peut facilement être réalisée.Les implications de cette technique s’étendent aux thérapies ou aux diagnostics de microcéphalie induite par le virus Zika ou d’autres troubles neurodéveloppementaux. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la pathogenèse du virus Zika, elle peut également être appliquée pour étudier d’autres infections à flavivirus dans le cerveau, comme le virus de la dengue. Juste avant l’intervention chirurgicale, chargez le mélange d’injection du virus Zika dans une aiguille d’injection en verre préparée en assemblant d’abord la seringue d’injection étanche au gaz de 50 microlitres, l’accessoire Luer-lock et la tubulure.Imprégnez la seringue et le tube assemblés d’huile minérale. Une fois sat

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Cette vidéo montre la génération d’un modèle murin expérimental de paludisme cérébral. Des sporozoïtes isolés de moustiques femelles infectées par Plasmodium berghei sont injectés dans les veines de la queue d'une souris restreinte, entraînant une rupture de la barrière hémato-encéphalique et une inflammation cérébrale, provoquant un paludisme cérébral. Ce modèle de souris infectée offre un outil précieux pour étudier in vivo la pathologie microvasculaire associée au paludisme cérébral.

Génération d’un modèle murin de paludisme cérébral expérimental à l’aide de sporozoïtes dérivés de moustiques hôtes

Cette vidéo démontre l’établissement d’un modèle in vitro d’infection par le virus Zika dans un cerveau en développement. Les organoïdes cérébraux humains contenant des rosettes de cellules souches, de cellules progénitrices neurales (NPC) et de neurones sont infectés par le virus Zika. Le virus infecte les PNJ et déclenche l’apoptose, perturbant le développement des organoïdes.

Développement d’un modèle in vitro de l’infection par le virus Zika dans les organoïdes cérébraux

Cette vidéo montre la génération d’un modèle de souris avec une infection du SNC. Un chiot allaitant reçoit une injection du virus à la fois par voie intracrânienne et intrapéritonéale. Le virus se propage, infectant le SNC, provoquant la mort des cellules neuronales et l’inflammation. Le chiot est évalué pour détecter les symptômes d’infection à mesure que la maladie progresse.

Génération d’un modèle murin avec une infection du système nerveux central

La vidéo démontre l’injection intracérébrale d’une suspension du virus Zika chez une souris adulte pour induire une neurodégénérescence. Une souris anesthésiée est fixée dans un cadre stéréotaxique et un trou est percé dans le crâne exposé pour l’injection. Une suspension du virus Zika est injectée dans le tissu cérébral. L’infection virale provoque une inflammation, conduisant à une neurodégénérescence.

Établissement d’un modèle de neurodégénérescence induite par le virus Zika chez une souris adulte

Cette vidéo montre une procédure permettant d’infecter des cellules souches neurales fœtales humaines avec le virus Zika. Les cellules infectées peuvent être utilisées pour d’autres études.

Infection par le virus Zika des cellules souches neurales fœtales

Ici, nous démontrons une technique de transduction neuronale généralisée par injection intraventriculaire d’un virus adéno-associé dans le cerveau de souris néonatale.  Cette méthode offre un moyen rapide et facile d’obtenir l’expression à vie des transgènes délivrés par le virus.

Injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée

Ce protocole décrit une technique utilisée pour modéliser l’infection par le virus Zika du cerveau humain en développement. À l’aide de type sauvage ou lignées de cellules de tige machiné, chercheurs peuvent utiliser cette technique pour découvrir les différents mécanismes ou traitements qui peuvent affecter le début infection du cerveau et qui en résulte une microcéphalie chez les embryons de Zika infectées par le virus.

Modélisation d’infection par le Virus de Zika du développement cerveau humain In Vitro à l’aide de cellules souches dérivées cérébrale organoïdes

Cet article décrit les méthodes qui sont utilisés pour étendre le cerveau foetal humain des cellules souches neurales dans la culture, ainsi que comment les différencier en divers sous-types neuronales et les astrocytes, en mettant l’accent sur l’utilisation des cellules souches neurales pour étudier l’infection par le virus Zika.

Zika Virus Infection du cerveau foetal humain cultivé des cellules souches neurales pour analyse immunocytochimique

Un protocole pour évaluer les réponses de cellules T spécifiques de l’antigène dans les organes d’immunoprivileged du Ifnar1- / - modèle murin pour l’infection de virus (ZIKV) de Zika est décrite. Cette méthode est essentielle pour étudier les mécanismes cellulaires de la protection et immunopathogenèse des vaccins ZIKV et est également précieuse pour leur évaluation de l’efficacité.

Évaluation des réponses de cellules T spécifiques du Virus Zika dans les organes Immunoprivileged des Ifnar1 infecté les souris- / -

Ici, nous présentons un protocole pour créer un modèle murine immunocompétent d'IC (Institut de recherche sur le cancer) de l'infection de système nerveux central pour montrer le développement de la neuropathie. La surveillance des désordres encéphalitiques virales aigues par des scores identiques de maladie pourrait être exécutée pour montrer la neuropathie virus-induite de dengue in vivo.

Un modèle murine de la dengue virus induite par l'encéphalite virale aigue comme la maladie

L'objectif du protocole est de démontrer les techniques utilisées pour étudier les maladies virales en isolant et en quantifiant le virus Zika, à partir de plusieurs organes d'une souris après l'infection.

Isolement et quantification du virus Zika à partir de plusieurs organes dans une souris

Découvrez une méthode d'injection intracérébrale pour établir des modèles murins d'infection par le virus Zika à différents stades du développement. Cette technique permet d'étudier la pathogenèse virale et les troubles neurologiques associés.

Établir des modèles de souris pour troubles neurologiques Zika Viro-induite à l’aide de stratégies d’Injection intracérébrale : embryonnaires, néonatals et adultes (Vidéo) | JoVE Journal

Établir des modèles de souris pour troubles neurologiques Zika Viro-induite à l’aide de stratégies d’Injection intracérébrale : embryonnaires, néonatals et adultes

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