Name: Fractionnement subcellulaire pour l’Activation de ERK par traitement de peptides dérivés mitochondriale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Découvrez le fractionnement subcellulaire pour étudier l'activation d'ERK par des peptides dérivés mitochondriaux dans les cellules SH-SY5Y et HEK293. Cette méthode permet d'analyser la localisation des phosphoprotéines.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par une bourse de recherche postdoctorale de Ellison/AFAR in Aging Research Program à SJK, et un prix de la Fondation Glenn et le NIH accorde aux PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Tous les auteurs apparaissent dans le film.

1. traitement de peptide aux cellules <ol><li>plaque 2 millions SH-SY5Y ou cellules HEK293 (2 x 10 6) dans un 10 cm plat et cultivent pour 2 jours</li> <li>(facultatif) l’autre jour, laver les cellules avec sans sérum Dulbecco &#39; s mise à jour le Eagle media moyen (DMEM) une fois et incuber avec sérum DMEM gratuit du jour au lendemain si le traitement doit être fait dans les médias libres sériques.</li>
	<li>Le jour 3, dissoudre les peptides S14G-humanin à 0,2 µm filtrée, l’eau distillée et reconstituer leur solution stock de 1mM. 
	Remarque : Les peptides doivent être dissous dans le solvant approprié, qui peut être déterminé par les caractéristiques de la séquence du peptide (par exemple, la charge globale) et peut-être être fourni par le fabricant si les peptides sont disponibles dans le commerce. Par exemple, S14G-humanin, SHLP2 et SHLP6 et MOTS-c se dissolvent dans l’eau. Aliquote les peptides dans un volume approprié (par exemple, 50 μL) pour éviter le gel et dégel des cycles. Une fois décongelé, ne pas les utiliser à nouveau.</li>
	<li>Partie aliquote du pré chauffé contenant du sérum ou des milieux sans sérum dans un 50 mL conique tube et ajouter la solution mère de 1 mM de température ambiante pour en faire une concentration de travail (par exemple, 1 µM, 10 µM).</li>
	<li>Remplacer les médias avec 6 mL de solution de peptide de l’étape 1.4. et incuber les cellules pendant le laps de temps approprié. 
	Remarque : Choisir le temps d’incubation selon votre état de santé qui active ERK.</li>
</ol> 2. Fractionnement subcellulaire de Cytosol et le noyau <ol><li>laver les cellules deux fois avec 10 mL de PBS glacee, gratter les cellules de la plaque dans 5 mL de PBS glacée et transférer la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Aspirer le PBS et Resuspendre le culot dans 200 µL de tampon de fractionnement glacee, (pH HEPES 10 mM = 7,6, 3 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 5 % (v/v) de glycérol, 1 % tensioactif non ionique (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) (n), inhibiteurs de la protéase/phosphatase). 
	NOTE : Pour garder les protéines dans leur état de phosphorylation, inhibiteur de la phosphatase comme ainsi que la protéase inhibiteur doit être fraîchement ajouté et échantillon devra être conservé sur la glace à tout moment. Répétition de gel et dégel cycles d’échantillons doivent être évitées. Aliquotes échantillons en petite quantité (p. ex. 50 μg) avant de les congeler à -80 ° C.</li>
	<li>Incuber le culot remises en suspension sur la glace pendant 15 min et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Recueillir le surnageant comme la fraction cytoplasmique et garder le culot pour la fraction nucléaire.</li>
	<li>Centrifuger le surnageant pour supprimer les débris cellulaires et autres contaminants à 18 000 x g pendant 10 min à 4 ° C et ensuite transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge. Il s’agit de la fraction cytosol.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 200 μL glacée de tampon de lavage (pH HEPES 10 mM = 7,6, 1,5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25 % (v/v) de glycérol, 0,2 mM EDTA, inhibiteurs de la protéase/phosphatase) et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C</li>
	<li>Enlever le surnageant et Resuspendre le culot dans tampon d’extraction glacee, nucléaire 100 μL (pH HEPES 20 mM = 7,6, 1,5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25 % (v/v) de glycérol, 0,2 mM EDTA, inhibiteurs de la protéase/phosphatase) et laisser agir 10 fois (5 s, 10 s large, 30 % amp.) sur glace</li>
	<li>Centrifuger à 18 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge. Il s’agit de la fraction nucléaire.</li>
	<li>Quantifier la quantité de protéine à un dosage BCA</li></ol>
 3. Fraction mitochondrique brute <ol><li>laver les cellules dans chaque plat de 10 cm avec 10 mL de PBS glacée, ajouter 5 mL de PBS glacée et détacher les cellules à l’aide d’un grattoir de cellules. 
	Remarque : Utiliser trois plats de 10 cm de cellules pour obtenir un bon rendement des mitochondries pour Western Blotting.</li>
	<li>Transférer la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL et combiner tous de trois plats de 10 cm dans un tube conique de 15 ml.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 600 x g pendant 10 min à 4 ° C.</li>
	<li>Aspirer le PBS et Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon d’isolement des mitochondries glacé (10 mM Tris-MOPS, EGTA/Tris de 1 mM, 200 mM de Sucrose, ajuster le pH = 7,4).</li>
	<li>Homogénéiser les cellules à 25 coups d’un homogénéisateur de 2 mL avec pilon enduit polytétrafluoroéthylène sur glace 
	Remarque : Cette étape est essentielle pour maintenir l’intégrité mitochondriale et maximiser le rendement de la fraction mitochondriale. Le nombre de coups doit être optimisé pour chaque type de cellule. Refroidir l’homogénéisateur avant de commencer la procédure.</li>
	<li>Transférer l’homogénat dans un tube de microcentrifuge et centrifuger à 600 x g pendant 10 min à 4 ° C et retirer les noyaux et ininterrompu de cellules il.</li>
	<li>Recueillir le surnageant, transférez-le dans un nouveau tube de microcentrifuge et il centrifuger à 7 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. 
	Remarque : Le pellet est lâche, recueillir le liquide surnageant avec soin et essayez de ne pas déranger le culot.</li>
	<li>Enlever le surnageant et Resuspendre le culot avec 200 μL de tampon d’isolement de mitochondries glacee transvaser la solution dans un nouveau tube de microcentrifuge. Centrifuger le tube à 7 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.</li>
	<li>Répéter l’étape 3,8 pour laver le culot. Il n’est pas nécessaire de transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge dans cette étape.</li>
	<li>Supprimer le surnageant de la pastille lavée et remettre en suspension l’extrait concentré contenant des mitochondries avec 50 μL de tampon de RIPA.</li>
	<li>Incuber la suspension sur la glace pendant 10 min.</li>
	<li>Centrifuger la suspension à 16 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge. Il s’agit de la fraction mitochondriale.</li>
	<li>Quantifier la quantité de protéine à un dosage BCA.</li>
</ol> 4. Western Blot pour les protéines spécifiques de la Phospho <ol><li>réaliser une électrophorèse SDS-polyacrylamide (8-16 % premade gel) et la protéine de transfert d’une membrane PVDF 4.</li>
	<li>Incuber la membrane avec 5 % de BSA dans TBST (0,1 % Polysorbate 20) pendant 30 min à température ambiante pour bloquer les sites de fond non-spécifiques. 
	Remarque : Pour la détection de la protéine phosphorylée, bloquer la membrane avec BSA pas de lait. Le lait contient caséine, une phosphoprotéine abondante, qui se traduit par un signal non spécifique élevé.</li>
	<li>Incuber la membrane avec l’anticorps primaire (anti-phospho-ERK1/2) à 4 ° C jusqu’au lendemain.</li>
	<li>Le lendemain, lavez la membrane avec un mélange TBST (0,1 % polysorbate 20), trois fois pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Incuber la membrane avec l’anticorps secondaire (anti-lapin HRP) pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver la membrane avec un mélange TBST (0,1 % polysorbate 20), trois fois pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Incuber la membrane avec une solution ECL et la membrane dans l’analyseur d’image d’image.</li>
	<li>Bande de la membrane avec décapage tampon pendant 15 min à température ambiante et laver la membrane avec un mélange TBST trois fois pendant 5 min.</li>
	<li>Répéter les étapes à l’aide de 4,2 à 4,7 l’anticorps de ERK1/2 anti-total.</li>
	<li>Pour vérifier la pureté de chaque fraction, exécutez SDS-PAGE et effectuer des immunoblots utilisant des anticorps reconnaissant des marqueurs pour chaque compartiment (p. ex., Lamin B1 pour noyau, GAPDH pour cytosol et TOM20 des mitochondries).</li>
</ol>

<ol><li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+novel+central+regulator+of+peripheral+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.</a> PloS one. 4 (7), 6334(2009).</li>
<li>Lee, C., Yen, K., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+harbinger+of+mitochondrial-derived+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides.</a> Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).</li>
<li>Kim, S. J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1%2F2%2C+AKT%2C+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Zhang, W., Liu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+signal+pathways+in+the+regulation+of+cell+proliferation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells.</a> Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).</li>
<li>Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP+kinases+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MAP kinases and cell migration.</a> J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).</li>
<li>Cagnol, S., Chambard, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+and+cell+death%3A+mechanisms+of+ERK-induced+cell+death--apoptosis%2C+autophagy+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence.</a> FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).</li>
<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Morrison, D. K., Davis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MAP+kinase+signaling+modules+by+scaffold+proteins+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).</li>
<li>Wainstein, E., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+subcellular+localization+of+ERK%3A+mechanisms+of+translocation+and+role+in+various+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li>
<li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+%28NTS%29+paves+a+way+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+ERK%2FMAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li>
<li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15589366">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li>
<li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+%28ERK1c%29%2C+a+novel+42-kilodalton+ERK%2C+demonstrates+unique+modes+of+regulation%2C+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li>
<li>Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+phosphorylated+ERK%2FMAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li>
<li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis%2C+insulin+sensitivity%2C+and+inflammatory+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li>
<li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stat+family+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li>
<li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517(2016).</li>
<li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25951043">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li>
<li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer%27s+disease-relevant+insults%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li>
</ol>

Pinchas Cohen est actionnaire et consultant pour CohBar, Inc. Kelvin Yen a servi comme consultant pour CohBar, Inc.

Ici, nous avons démontré que humanin induite par le peptide ERK1/2 activation se produit dans deux types de cellules différentes, et la localisation subcellulaire d’activées ERK1/2 peut être différente selon les conditions (p. ex., dose de peptide, point dans le temps et cellule type). Il a été démontré que humanin signaux par l’intermédiaire de deux récepteurs différents22,23, qui peut expliquer les différences de signalisation entre les deux lignées ce...

Nouvelles études montrent que les peptides dérivés mitochondriale (AMD) jouent des rôles importants de cytoprotection et métabolisme1,2,3. Comprendre la voie de transduction de signal en présence d’AMD nous donne un aperçu du mécanisme par lequel les AMD modulent diverses fonctions. Le premier MDP identifié, humanin, a été montré pour augmenter la kinase de signal-réglée extracellulaire 1/2 (ERK1/2) phosphorylation par l’intermédiaire de son récepteur liaison4,5. Cependant, l’effet en aval de l’activation de ERK1/2 est toujours sous-explorée.
La cascade de ERK1/2 sert de médiateur essentiel dans une variété de processus cellulaires comme la prolifération, la migration cellulaire, métabolisme cellulaire, la survie et l’apoptose6,7,8. Pour orchestrer tous ces processus cellulaires distincts, l’activité et la localisation subcellulaire de ERK1/2 sont étroitement contrôlées par des phosphatases et échafaudage protéines9,10. En plus des modifications post-traductionnelles, la dynamique de la navette de ERK1/2 réglemente également sa signalisation fonction, activité et spécificité11,12. ERK1/2 est principalement localisée dans le cytosol13. Un ensemble de protéines d’ancrage et échafaudage aident à retenir ERK1/2 dans les éléments du cytosquelette, sur la surface des organites ou diffus dans le cytoplasme13. Lors de la stimulation, ERK1/2 est phosphorylé et devient dissocié de ses protéines d’ancrage, ce qui permet la translocation de ERK1/2 aux autres compartiments subcellulaires, y compris le noyau, mitochondries, Golgi et lysosomes14, 15 , 16.
Humanin est connu pour activer la ERK1/2 voie de signalisation, l’activation de ERK1/2 est observée seulement dans les lysats cellulaires totales. Comme décrit auparavant, car la localisation subcellulaire de ERK1/2 joue un rôle crucial dans son effet en aval, l’analyse de la localisation subcellulaire et les concentrations totales de phosphorylés ERK1/2 est nécessaire pour fournir une compréhension globale d’activation de ERK1/2 induite par le humanin et l’activation des cibles en aval.
Pour comprendre les organites cibles de ERK1/2 activé, fractionnement subcellulaire suivi par western blot pour phosphorylés ERK1/2 a été réalisé. Cette méthode peut être facilement mis en œuvre comme il utilise des réactifs et matériel de laboratoire standard. Les compartiments subcellulaires isolés sont d’une grande pureté, permettant que les résultats être interprété de façon directe. Immunomarquage de ERK1/2 peut produire des résultats similaires. Toutefois, certains compartiments subcellulaires sont relativement difficiles à visualiser et exigent des méthodes spéciales de fixation et perméabilisation. ERK1/2 niveaux varient dans les compartiments subcellulaires, et cette variation pourrait provoquer de faux positifs et fausses négatifs signaux quand on regarde les lysats de cellules entières. Par conséquent, un immunoblot utilisant des compartiments subcellulaires isolés nous donne une meilleure compréhension de la localisation de ERK1/2.
La polyvalence de la méthode permet aux modifications du protocole à examiner les effets d’autres stimulants, y compris les autres AMD ou translocation d’autres molécules de signalisation tels que STAT3. Récemment découverts petits humanin-like peptides (SHLPs) sont codés de la région d’ARNr 16 s où humanin est codé, et elles ont des propriétés similaires mais distinctes contre HN17. Par exemple, SHLP2 et SHLP3 activent ERK1/2 après que 8 h bien que humanin active ERK1/2 dans 5 min. examen localisation subcellulaire de ERK1/2 en réponse à différents peptides nous donnera une meilleure compréhension de la biologie de ces peptides. Des preuves nouvelles, ont montré que la localisation subcellulaire de molécules de signalisation joue un rôle crucial dans leurs effets en aval. Par exemple, STAT3 est traditionnellement connu pour être localisés principalement dans le cytosol des cellules au repos, et ensuite il translocation dans le noyau pour activer l’expression des gènes en réponse à des cytokines18. Stat3 également translocation aux mitochondries et régule le cycle de Krebs et ATP production19. Concernant le règlement de l’autophagie, différente localisation subcellulaire de STAT3 module autophagie dans diverses manières20. Par exemple, nucléaire STAT3 transcriptionnellement régule les gènes liés à l’autophagie et agit comme un modulateur de l’autophagie. Cytoplasmique STAT3 inhibe constitutivement autophagie en interagissant avec autophagie molécules de signalisation. Mitochondrial STAT3 inhibe et empêche mitophagy en supprimant le stress oxydatif induit par autophagie. Par conséquent, cette méthode d’isolation compartiment subcellulaire est cruciale pour comprendre le rôle des autres molécules de signalisation ainsi que les ERK1/2.

<table><tbody><tr><td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9102</td><td>Dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>4370</td><td>Dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>Lamine B1</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>12586</td><td>Marqueur nucléaire, dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>5174</td><td>Marqueur cytoplasmique, dilution 1:2 000</td></tr><tr><td>Tom20</td><td>Santa cruz</td><td>SC-17764</td><td>Marqueur mitochondrial, dilution 1:2 000</td></tr><tr><td>anti-Rabbit-HRP conjuguée</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>7074</td><td>Dilution 1:30 000</td></tr><tr><td>RIPA Tampon de lyse et d’extraction</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Boîte de culture</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>HNG peptide</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25mm Filtre Sylinge</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Racleur cellulaire</td><td>FALCON</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Halte et commerce ; Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase (100X)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Pestle Assemblages de broyeurs de tissus avec pilons lisses</td><td>Thomas Scientific</td><td>3432S90</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>8-16 % Mini-PROTEAN TGX Gels de</td> <td>protéines préfabriquéesBIO RAD</td><td>4561104</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot</td> Module <td>BIO RAD</td><td>1658030</td> Trans-Blot Turbo Système de transfert BIO RAD 1704150 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF KIT DE TRANSFERT</td><td>BIO RAD</td><td>1704272</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrats</td> de transfert <td>BIO RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>Restore</td> <td>Western blotThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur, Medel : FB120</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>695320-07-12</td><td></td></tr></tbody></table>

fractionnement subcellulaire pour l’activation de erk par traitement de peptides dérivés mitochondriale

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Peptides dérivés mitochondrial (AMD) sont une nouvelle classe de peptides qui sont codées par des cadres de lecture ouvert petit au sein d’autres gènes connus du génome mitochondrial. Les AMD ont une grande variété d’effets biologiques tels que la protection des neurones contre l’apoptose, l’amélioration des marqueurs métaboliques et protégeant les cellules de la chimiothérapie. Humanin a été le premier MDP à découvrir et est la plus étudiée peptide parmi la famille des MDP. Les récepteurs membranaires et les voies de signalisation en aval de humanin ont été soigneusement caractérisés. Les AMD supplémentaires telles que des MOTS-c et SHLP1-6 ont été découvertes plus récemment et les mécanismes de signalisation n’ont pas encore à élucider. Nous décrivons ici une méthode fondés sur la culture de cellules pour déterminer la fonction de ces peptides. En particulier, les techniques de fractionnement cellulaire en combinaison avec western blot permettent la détermination quantitative de l’activation et la translocation de la molécule de signalisation importante. Bien qu’il existe d’autres méthodes de fractionnement cellulaire, celle décrite ici est une méthode simple et directe. Ces méthodes peuvent être utilisées pour élucider plus loin le mécanisme d’action de ces peptides et d’autres agents thérapeutiques.

À l’aide de la procédure présentée ici, nous avons traité des cellules HEK293 et SH-SY5Y avec 1 μM et 100 μM S14G-humanin, un humanin puissant analogiques21, respectivement, dans toutes les médias pour les périodes indiquées (Figure 1A et Figure 1 B). nous avons ensuite examiné la forme totale et phosphorylée de ERK1/2 au Thr202/Tyr204 , extraits de ...

Ce protocole décrit comment stimuler les cellules avec des peptides dérivés mitochondriale et évaluer la signalisation cascade et la localisation des phospho-protéines.

Fractionnement subcellulaire pour l’Activation de ERK par traitement de peptides dérivés mitochondriale

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

L’objectif global de cette expérience est d’identifier la cascade de signalisation en aval impliquée dans les cellules stimulées par des peptides dérivés de mitochondries. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine des peptides dérivés des mitochondries, telles que les voies de signalisation impliquées et l’endroit où cela se produit. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple et relativement facile à réaliser.Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons examiné la signalisation ERK médiée par l’homme, qui nous a donné des informations limitées sur les faits en aval. La méthode de Kersher à sous-échelle nous a donné une meilleure idée du rôle de la signalisation médiée par l’homme. Le troisième jour après le placage et le lavage deux fois dix à sixième, cellules SH-SY5Y ou HEK293 selon le protocole texte.Dissoudre les peptides d’humanine S14G dans de l’eau distillée filtrée à deux microns point zéro. Et les reconstituer sous la forme d’une solution mère d’un millimolaire. Aliquote le milieu préchauffé contenant ou sans sérum dans un tube conique de 15 millilitres et ajoutez une solution mère de peptide humanin à température ambiante pour obtenir une concentration de travail.Remplacez immédiatement le milieu dans les cellules par six millilitres de solution peptidique. Et incubez les cellules pendant la durée appropriée. Utilisez 10 millilitres de PBS glacé pour laver les cellules deux fois.Ensuite, grattez les cellules de la plaque dans cinq millilitres de PBS glacé. Et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à 500 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Remettez la pastille en suspension dans 200 microlitres de tampon de fractionnement glacé et incubez sur de la glace pendant 15 minutes. Centrifugez le tube à 250 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, prélevez le surnageant sous forme de fraction cytoplasmique et conservez la pastille pour la fraction nucléaire.Centrifugez le surnageant pour éliminer les débris cellulaires et autres contaminants à 18000 fois G et quatre degrés Celsius pendant dix minutes. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube de micro-centrifugation. Il s’agit de la fraction du cytisol.Remettez la pastille en suspension dans 200 microlitres de tampon de lavage glacé et centrifugez la solution à 250 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et utilisez 100 microlitres de tampon d’extraction nucléaire glacé pour remettre la pastille en suspension. Ensuite, soniquez l’échantillon sur de la glace 10 fois.Centrifugez à nouveau l’échantillon. Transférez ensuite le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation. Pour isoler la fraction mitochondriale brute, utilisez 10 millilitres de PBS glacé pour laver les cellules dans chaque boîte de 10 centimètres.Ajoutez ensuite cinq millilitres de PBS glacé et utilisez un grattoir pour détacher les cellules. Transférez les suspensions cellulaires dans un seul tube conique de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules à 600 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Aspirez le PBS et utilisez un millilitre de tampon d’isolement mitochondrial glacé pour remettre la pastille en suspension. Ensuite, avec un pilon recouvert de polytétrafluoroéthylène sur de la glace, homogénéisez les cellules en 25 coups d’un homogénéisateur de deux millilitres. Transférez l’homogénat dans un tube de micro-centrifugation et centrifugez l’échantillon à 600 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour éliminer les noyaux et les cellules intactes.Ensuite, récupérez le surnageant, transférez-le dans un nouveau tube de micro-centrifugation et centrifugez la solution à 7000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir retiré le surnageant, remettez la pastille en suspension avec 200 microlitres de tampon d’isolement des mitochondries glacé et transférez la solution dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse. Centrifugez le tube à 7000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Après avoir répété le lavage, utilisez 15 microlitres de tampon RIPA pour remettre la pastille en suspension et incubez la suspension sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 16000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Transférez le surnageant, qui est la fraction mitochondriale, dans un nouveau tube.Quantifier et effectuer le western blot selon le protocole texte. En utilisant la procédure démontrée dans cette vidéo, les cellules HEK293 et SH-SY5Y se sont retirées avec une et 100 micromolaires S14 G humanin, un puissant analogue de l’humanine. Et la forme totale et phosphorylée d’ERK12 à la théanine 202, la tyrosine 204 à partir d’extraits de protéines totales ont été analysées.Comme on le voit ici, le traitement par l’humanine S14G a montré une augmentation de la phosphorylation de ERK12 et de son site régulateur théanine-202, tyrosine-204. Pour comprendre la cible de l’activation d’ERK12 médiée par S14G humanin, la localisation subcellulaire de ERK12 totale et phosphorylée après un traitement par S14G humanin a été analysée. Comme le montrent ces transferts de Western, dans les cellules HEK293, l’ERK phosphorylé a augmenté à la fois dans le cytoplasme et le noyau, mais pas dans les mitochondries.Dans les cellules SH-SY5Y, cependant, l’ERK phosphorylé a diminué dans le noyau du cytoplasme et les mitochondries. Ce qui suggère que la phosphorylation d’ERK médiée par l’humanine S14G peut jouer un rôle différent dans différents types de cellules et différentes conditions. Une fois maîtrisé, le fractionnement nucléaire cellulaire peut être effectué en une heure et le fractionnement mitochondrial peut être effectué en une heure et 30 minutes, s’il est effectué correctement.Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder tous les échantillons sur de la glace. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, notamment la précipitation co-immune et la spectrométrie de masse, peuvent être effectuées afin de comprendre les cibles en aval des molécules de signalisation.

subcellular-fractionation-for-erk-activation-upon-mitochondrial

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale des cellules souches embryonnaires humaines peuvent être analysées à l'aide des tests d'activité de gel.

Palpage pour activité complexe mitochondrial dans les cellules souches embryonnaires humaines

Les effets de l'activation de la protéine kinase C (PKC) isozymes de la fonction mitochondriale associés à la respiration et la phosphorylation oxydative et sur la viabilité cellulaire sont décrites. L'approche technique s'adapte adénoviral de façon sélective surexprimer isoenzymes de PKC dans une culture cellulaire primaire et une variété de tests pour déterminer les fonctions mitochondriales et l'état énergétique de la cellule.

Évaluation des fonctions mitochondriales et la viabilité cellulaire dans les cellules rénales surexprimant la protéine kinase C Isozymes

Cette procédure illustre comment isoler du cerveau de souris adulte les membranes des mitochondries associées à l'urgence ou la SMMA et les glycosphingolipides-fractions enrichies en microdomaines de MMA propres et préparations mitochondriales.

Les mitochondries associées à membranes ER (SMMA) et glycosphingolipides microdomaines enrichis (GEM): Isolement à partir de cerveau de souris

La comparaison du potentiel de membrane mitochondriale entre les échantillons fournit des informations précieuses sur l’état cellulaire. Les étapes détaillées de l’isolement des mitochondries et de l’évaluation de la réponse aux inhibiteurs et aux découpleurs à l’aide de la fluorescence sont décrites. La méthode et l’utilité de ce protocole sont illustrées par l’utilisation d’une culture cellulaire et d’un modèle animal de stress cellulaire.

Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

Ici, nous décrivons comment étudier la localisation mitochondriale d’une kinase (cycle cellulaire), et comment déterminer sa position sous-mitochondriale ainsi que les substrats/cibles mitochondriaux potentiels. L’expression forcée de protéines dans les mitochondries fournit un outil utile pour étudier les conséquences fonctionnelles de la localisation mitochondriale d’une protéine d’intérêt.

Approches expérimentales pour l&#39;étude mitochondrial Localisation et fonction d&#39;une cellule du cycle nucléaire Kinase, Cdk1

Les protéines kinases sont des enzymes de signalisation hautement évoluées et des échafaudages qui sont essentiels pour la transduction du signal inter et intracellulaire. Nous présentons un protocole pour mesurer l'activité de la kinase par l'utilisation d'adénosine triphosphate radiomarqué ([γ- 32 P] ATP), une méthode fiable pour faciliter l'élucidation de la régulation de la signalisation cellulaire.

Dosage de l&#39;activité des protéines kinase avec ATP radiomarqué

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les membrane plasmique, cytoplasme et les mitochondries des cellules U937 sans l’utilisation de la centrifugation à grande vitesse. Cette technique peut servir à purifier les fractions subcellulaires pour un examen subséquent de la localisation de la protéine par immunoblotting.

Fractionnement de cellules des cellules U937 en l’Absence de Centrifugation à haute vitesse

Malgré les progrès récents, de nombreuses protéines mitochondriales de levure restent encore avec leurs fonctions complètement inconnues. Ce protocole fournit une méthode simple et fiable pour déterminer la localisation de la soumissionochondriale des protéines, ce qui a été fondamental pour l’élucidation de leurs fonctions moléculaires.

Évaluation de la localisation des protéines submitochondriales dans la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae

Le présent protocole met en évidence l’application de la technique de transfert Western pour étudier les fonctions et les activités du cotransporteur neuronal K-Cl KCC2. Le protocole décrit l’étude de la phosphorylation de KCC2 sur les sites régulateurs de kinases Thr906/1007 par transfert Western. En outre, des méthodes supplémentaires pour confirmer l’activité de KCC2 sont brièvement mises en évidence dans ce texte.

Etude des fonctions et activités du co-transporteur neuronal K-CL KCC2 par transfert Western

Les RASopathies sont des syndromes génétiques multisystémiques causés par l’hyperactivation de la voie RAS-MAPK. Des variants potentiellement pathogènes en attente de validation émergent en permanence alors que de mauvaises preuves précliniques limitent le traitement. Ici, nous décrivons notre protocole in vivo pour tester et valider les niveaux d’activation ERK associés à RASopathy et sa modulation pharmacologique au cours de l’embryogenèse par imagerie FRET en direct chez le poisson-zèbre...

Un protocole efficace pour évaluer la modulation de l’activité ERK dans des modèles précoces de poisson zèbre du syndrome de Noonan via la microscopie FRET en direct et l’immunofluorescence

Découvrez le fractionnement subcellulaire pour étudier l'activation d'ERK par des peptides dérivés mitochondriaux dans les cellules SH-SY5Y et HEK293. Cette méthode permet d'analyser la localisation des phosphoprotéines.

Fractionnement subcellulaire pour l’Activation de ERK par traitement de peptides dérivés mitochondriale

Explorer plus de vidéos