Fractionnement subcellulaire pour l’Activation de ERK par traitement de peptides dérivés mitochondriale

L’objectif global de cette expérience est d’identifier la cascade de signalisation en aval impliquée dans les cellules stimulées par des peptides dérivés de mitochondries. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine des peptides dérivés des mitochondries, telles que les voies de signalisation impliquées et l’endroit où cela se produit. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple et relativement facile à réaliser.

Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons examiné la signalisation ERK médiée par l’homme, qui nous a donné des informations limitées sur les faits en aval. La méthode de Kersher à sous-échelle nous a donné une meilleure idée du rôle de la signalisation médiée par l’homme. Le troisième jour après le placage et le lavage deux fois dix à sixième, cellules SH-SY5Y ou HEK293 selon le protocole texte.

Dissoudre les peptides d’humanine S14G dans de l’eau distillée filtrée à deux microns point zéro. Et les reconstituer sous la forme d’une solution mère d’un millimolaire. Aliquote le milieu préchauffé contenant ou sans sérum dans un tube conique de 15 millilitres et ajoutez une solution mère de peptide humanin à température ambiante pour obtenir une concentration de travail.

Remplacez immédiatement le milieu dans les cellules par six millilitres de solution peptidique. Et incubez les cellules pendant la durée appropriée. Utilisez 10 millilitres de PBS glacé pour laver les cellules deux fois.

Ensuite, grattez les cellules de la plaque dans cinq millilitres de PBS glacé. Et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à 500 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Remettez la pastille en suspension dans 200 microlitres de tampon de fractionnement glacé et incubez sur de la glace pendant 15 minutes. Centrifugez le tube à 250 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, prélevez le surnageant sous forme de fraction cytoplasmique et conservez la pastille pour la fraction nucléaire.

Centrifugez le surnageant pour éliminer les débris cellulaires et autres contaminants à 18000 fois G et quatre degrés Celsius pendant dix minutes. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube de micro-centrifugation. Il s’agit de la fraction du cytisol.

Remettez la pastille en suspension dans 200 microlitres de tampon de lavage glacé et centrifugez la solution à 250 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et utilisez 100 microlitres de tampon d’extraction nucléaire glacé pour remettre la pastille en suspension. Ensuite, soniquez l’échantillon sur de la glace 10 fois.

Centrifugez à nouveau l’échantillon. Transférez ensuite le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation. Pour isoler la fraction mitochondriale brute, utilisez 10 millilitres de PBS glacé pour laver les cellules dans chaque boîte de 10 centimètres.

Ajoutez ensuite cinq millilitres de PBS glacé et utilisez un grattoir pour détacher les cellules. Transférez les suspensions cellulaires dans un seul tube conique de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules à 600 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Aspirez le PBS et utilisez un millilitre de tampon d’isolement mitochondrial glacé pour remettre la pastille en suspension. Ensuite, avec un pilon recouvert de polytétrafluoroéthylène sur de la glace, homogénéisez les cellules en 25 coups d’un homogénéisateur de deux millilitres. Transférez l’homogénat dans un tube de micro-centrifugation et centrifugez l’échantillon à 600 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour éliminer les noyaux et les cellules intactes.

Ensuite, récupérez le surnageant, transférez-le dans un nouveau tube de micro-centrifugation et centrifugez la solution à 7000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir retiré le surnageant, remettez la pastille en suspension avec 200 microlitres de tampon d’isolement des mitochondries glacé et transférez la solution dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse. Centrifugez le tube à 7000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après avoir répété le lavage, utilisez 15 microlitres de tampon RIPA pour remettre la pastille en suspension et incubez la suspension sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 16000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Transférez le surnageant, qui est la fraction mitochondriale, dans un nouveau tube.

Quantifier et effectuer le western blot selon le protocole texte. En utilisant la procédure démontrée dans cette vidéo, les cellules HEK293 et SH-SY5Y se sont retirées avec une et 100 micromolaires S14 G humanin, un puissant analogue de l’humanine. Et la forme totale et phosphorylée d’ERK12 à la théanine 202, la tyrosine 204 à partir d’extraits de protéines totales ont été analysées.

Comme on le voit ici, le traitement par l’humanine S14G a montré une augmentation de la phosphorylation de ERK12 et de son site régulateur théanine-202, tyrosine-204. Pour comprendre la cible de l’activation d’ERK12 médiée par S14G humanin, la localisation subcellulaire de ERK12 totale et phosphorylée après un traitement par S14G humanin a été analysée. Comme le montrent ces transferts de Western, dans les cellules HEK293, l’ERK phosphorylé a augmenté à la fois dans le cytoplasme et le noyau, mais pas dans les mitochondries.

Dans les cellules SH-SY5Y, cependant, l’ERK phosphorylé a diminué dans le noyau du cytoplasme et les mitochondries. Ce qui suggère que la phosphorylation d’ERK médiée par l’humanine S14G peut jouer un rôle différent dans différents types de cellules et différentes conditions. Une fois maîtrisé, le fractionnement nucléaire cellulaire peut être effectué en une heure et le fractionnement mitochondrial peut être effectué en une heure et 30 minutes, s’il est effectué correctement.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder tous les échantillons sur de la glace. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, notamment la précipitation co-immune et la spectrométrie de masse, peuvent être effectuées afin de comprendre les cibles en aval des molécules de signalisation.