Name: Fractionnement subcellulaire pour l’Activation de ERK par traitement de peptides dérivés mitochondriale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Découvrez le fractionnement subcellulaire pour étudier l'activation d'ERK par des peptides dérivés mitochondriaux dans les cellules SH-SY5Y et HEK293. Cette méthode permet d'analyser la localisation des phosphoprotéines.

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Ce travail a été soutenu par une bourse de recherche postdoctorale de Ellison/AFAR in Aging Research Program à SJK, et un prix de la Fondation Glenn et le NIH accorde aux PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Tous les auteurs apparaissent dans le film.

1. traitement de peptide aux cellules <ol><li>plaque 2 millions SH-SY5Y ou cellules HEK293 (2 x 10 6) dans un 10 cm plat et cultivent pour 2 jours</li> <li>(facultatif) l’autre jour, laver les cellules avec sans sérum Dulbecco &#39; s mise à jour le Eagle media moyen (DMEM) une fois et incuber avec sérum DMEM gratuit du jour au lendemain si le traitement doit être fait dans les médias libres sériques.</li>
	<li>Le jour 3, dissoudre les peptides S14G-humanin à 0,2 µm filtrée, l’eau distillée et reconstituer leur solution stock de 1mM. 
	Remarque : Les peptides doivent être dissous dans le solvant approprié, qui peut être déterminé par les caractéristiques de la séquence du peptide (par exemple, la charge globale) et peut-être être fourni par le fabricant si les peptides sont disponibles dans le commerce. Par exemple, S14G-humanin, SHLP2 et SHLP6 et MOTS-c se dissolvent dans l’eau. Aliquote les peptides dans un volume approprié (par exemple, 50 μL) pour éviter le gel et dégel des cycles. Une fois décongelé, ne pas les utiliser à nouveau.</li>
	<li>Partie aliquote du pré chauffé contenant du sérum ou des milieux sans sérum dans un 50 mL conique tube et ajouter la solution mère de 1 mM de température ambiante pour en faire une concentration de travail (par exemple, 1 µM, 10 µM).</li>
	<li>Remplacer les médias avec 6 mL de solution de peptide de l’étape 1.4. et incuber les cellules pendant le laps de temps approprié. 
	Remarque : Choisir le temps d’incubation selon votre état de santé qui active ERK.</li>
</ol> 2. Fractionnement subcellulaire de Cytosol et le noyau <ol><li>laver les cellules deux fois avec 10 mL de PBS glacee, gratter les cellules de la plaque dans 5 mL de PBS glacée et transférer la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Aspirer le PBS et Resuspendre le culot dans 200 µL de tampon de fractionnement glacee, (pH HEPES 10 mM = 7,6, 3 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 5 % (v/v) de glycérol, 1 % tensioactif non ionique (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) (n), inhibiteurs de la protéase/phosphatase). 
	NOTE : Pour garder les protéines dans leur état de phosphorylation, inhibiteur de la phosphatase comme ainsi que la protéase inhibiteur doit être fraîchement ajouté et échantillon devra être conservé sur la glace à tout moment. Répétition de gel et dégel cycles d’échantillons doivent être évitées. Aliquotes échantillons en petite quantité (p. ex. 50 μg) avant de les congeler à -80 ° C.</li>
	<li>Incuber le culot remises en suspension sur la glace pendant 15 min et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Recueillir le surnageant comme la fraction cytoplasmique et garder le culot pour la fraction nucléaire.</li>
	<li>Centrifuger le surnageant pour supprimer les débris cellulaires et autres contaminants à 18 000 x g pendant 10 min à 4 ° C et ensuite transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge. Il s’agit de la fraction cytosol.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 200 μL glacée de tampon de lavage (pH HEPES 10 mM = 7,6, 1,5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25 % (v/v) de glycérol, 0,2 mM EDTA, inhibiteurs de la protéase/phosphatase) et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C</li>
	<li>Enlever le surnageant et Resuspendre le culot dans tampon d’extraction glacee, nucléaire 100 μL (pH HEPES 20 mM = 7,6, 1,5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25 % (v/v) de glycérol, 0,2 mM EDTA, inhibiteurs de la protéase/phosphatase) et laisser agir 10 fois (5 s, 10 s large, 30 % amp.) sur glace</li>
	<li>Centrifuger à 18 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge. Il s’agit de la fraction nucléaire.</li>
	<li>Quantifier la quantité de protéine à un dosage BCA</li></ol>
 3. Fraction mitochondrique brute <ol><li>laver les cellules dans chaque plat de 10 cm avec 10 mL de PBS glacée, ajouter 5 mL de PBS glacée et détacher les cellules à l’aide d’un grattoir de cellules. 
	Remarque : Utiliser trois plats de 10 cm de cellules pour obtenir un bon rendement des mitochondries pour Western Blotting.</li>
	<li>Transférer la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL et combiner tous de trois plats de 10 cm dans un tube conique de 15 ml.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 600 x g pendant 10 min à 4 ° C.</li>
	<li>Aspirer le PBS et Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon d’isolement des mitochondries glacé (10 mM Tris-MOPS, EGTA/Tris de 1 mM, 200 mM de Sucrose, ajuster le pH = 7,4).</li>
	<li>Homogénéiser les cellules à 25 coups d’un homogénéisateur de 2 mL avec pilon enduit polytétrafluoroéthylène sur glace 
	Remarque : Cette étape est essentielle pour maintenir l’intégrité mitochondriale et maximiser le rendement de la fraction mitochondriale. Le nombre de coups doit être optimisé pour chaque type de cellule. Refroidir l’homogénéisateur avant de commencer la procédure.</li>
	<li>Transférer l’homogénat dans un tube de microcentrifuge et centrifuger à 600 x g pendant 10 min à 4 ° C et retirer les noyaux et ininterrompu de cellules il.</li>
	<li>Recueillir le surnageant, transférez-le dans un nouveau tube de microcentrifuge et il centrifuger à 7 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. 
	Remarque : Le pellet est lâche, recueillir le liquide surnageant avec soin et essayez de ne pas déranger le culot.</li>
	<li>Enlever le surnageant et Resuspendre le culot avec 200 μL de tampon d’isolement de mitochondries glacee transvaser la solution dans un nouveau tube de microcentrifuge. Centrifuger le tube à 7 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.</li>
	<li>Répéter l’étape 3,8 pour laver le culot. Il n’est pas nécessaire de transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge dans cette étape.</li>
	<li>Supprimer le surnageant de la pastille lavée et remettre en suspension l’extrait concentré contenant des mitochondries avec 50 μL de tampon de RIPA.</li>
	<li>Incuber la suspension sur la glace pendant 10 min.</li>
	<li>Centrifuger la suspension à 16 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge. Il s’agit de la fraction mitochondriale.</li>
	<li>Quantifier la quantité de protéine à un dosage BCA.</li>
</ol> 4. Western Blot pour les protéines spécifiques de la Phospho <ol><li>réaliser une électrophorèse SDS-polyacrylamide (8-16 % premade gel) et la protéine de transfert d’une membrane PVDF 4.</li>
	<li>Incuber la membrane avec 5 % de BSA dans TBST (0,1 % Polysorbate 20) pendant 30 min à température ambiante pour bloquer les sites de fond non-spécifiques. 
	Remarque : Pour la détection de la protéine phosphorylée, bloquer la membrane avec BSA pas de lait. Le lait contient caséine, une phosphoprotéine abondante, qui se traduit par un signal non spécifique élevé.</li>
	<li>Incuber la membrane avec l’anticorps primaire (anti-phospho-ERK1/2) à 4 ° C jusqu’au lendemain.</li>
	<li>Le lendemain, lavez la membrane avec un mélange TBST (0,1 % polysorbate 20), trois fois pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Incuber la membrane avec l’anticorps secondaire (anti-lapin HRP) pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver la membrane avec un mélange TBST (0,1 % polysorbate 20), trois fois pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Incuber la membrane avec une solution ECL et la membrane dans l’analyseur d’image d’image.</li>
	<li>Bande de la membrane avec décapage tampon pendant 15 min à température ambiante et laver la membrane avec un mélange TBST trois fois pendant 5 min.</li>
	<li>Répéter les étapes à l’aide de 4,2 à 4,7 l’anticorps de ERK1/2 anti-total.</li>
	<li>Pour vérifier la pureté de chaque fraction, exécutez SDS-PAGE et effectuer des immunoblots utilisant des anticorps reconnaissant des marqueurs pour chaque compartiment (p. ex., Lamin B1 pour noyau, GAPDH pour cytosol et TOM20 des mitochondries).</li>
</ol>

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</ol>

Pinchas Cohen est actionnaire et consultant pour CohBar, Inc. Kelvin Yen a servi comme consultant pour CohBar, Inc.

Ici, nous avons démontré que humanin induite par le peptide ERK1/2 activation se produit dans deux types de cellules différentes, et la localisation subcellulaire d’activées ERK1/2 peut être différente selon les conditions (p. ex., dose de peptide, point dans le temps et cellule type). Il a été démontré que humanin signaux par l’intermédiaire de deux récepteurs différents22,23, qui peut expliquer les différences de signalisation entre les deux lignées ce...

Nouvelles études montrent que les peptides dérivés mitochondriale (AMD) jouent des rôles importants de cytoprotection et métabolisme1,2,3. Comprendre la voie de transduction de signal en présence d’AMD nous donne un aperçu du mécanisme par lequel les AMD modulent diverses fonctions. Le premier MDP identifié, humanin, a été montré pour augmenter la kinase de signal-réglée extracellulaire 1/2 (ERK1/2) phosphorylation par l’intermédiaire de son récepteur liaison4,5. Cependant, l’effet en aval de l’activation de ERK1/2 est toujours sous-explorée.
La cascade de ERK1/2 sert de médiateur essentiel dans une variété de processus cellulaires comme la prolifération, la migration cellulaire, métabolisme cellulaire, la survie et l’apoptose6,7,8. Pour orchestrer tous ces processus cellulaires distincts, l’activité et la localisation subcellulaire de ERK1/2 sont étroitement contrôlées par des phosphatases et échafaudage protéines9,10. En plus des modifications post-traductionnelles, la dynamique de la navette de ERK1/2 réglemente également sa signalisation fonction, activité et spécificité11,12. ERK1/2 est principalement localisée dans le cytosol13. Un ensemble de protéines d’ancrage et échafaudage aident à retenir ERK1/2 dans les éléments du cytosquelette, sur la surface des organites ou diffus dans le cytoplasme13. Lors de la stimulation, ERK1/2 est phosphorylé et devient dissocié de ses protéines d’ancrage, ce qui permet la translocation de ERK1/2 aux autres compartiments subcellulaires, y compris le noyau, mitochondries, Golgi et lysosomes14, 15 , 16.
Humanin est connu pour activer la ERK1/2 voie de signalisation, l’activation de ERK1/2 est observée seulement dans les lysats cellulaires totales. Comme décrit auparavant, car la localisation subcellulaire de ERK1/2 joue un rôle crucial dans son effet en aval, l’analyse de la localisation subcellulaire et les concentrations totales de phosphorylés ERK1/2 est nécessaire pour fournir une compréhension globale d’activation de ERK1/2 induite par le humanin et l’activation des cibles en aval.
Pour comprendre les organites cibles de ERK1/2 activé, fractionnement subcellulaire suivi par western blot pour phosphorylés ERK1/2 a été réalisé. Cette méthode peut être facilement mis en œuvre comme il utilise des réactifs et matériel de laboratoire standard. Les compartiments subcellulaires isolés sont d’une grande pureté, permettant que les résultats être interprété de façon directe. Immunomarquage de ERK1/2 peut produire des résultats similaires. Toutefois, certains compartiments subcellulaires sont relativement difficiles à visualiser et exigent des méthodes spéciales de fixation et perméabilisation. ERK1/2 niveaux varient dans les compartiments subcellulaires, et cette variation pourrait provoquer de faux positifs et fausses négatifs signaux quand on regarde les lysats de cellules entières. Par conséquent, un immunoblot utilisant des compartiments subcellulaires isolés nous donne une meilleure compréhension de la localisation de ERK1/2.
La polyvalence de la méthode permet aux modifications du protocole à examiner les effets d’autres stimulants, y compris les autres AMD ou translocation d’autres molécules de signalisation tels que STAT3. Récemment découverts petits humanin-like peptides (SHLPs) sont codés de la région d’ARNr 16 s où humanin est codé, et elles ont des propriétés similaires mais distinctes contre HN17. Par exemple, SHLP2 et SHLP3 activent ERK1/2 après que 8 h bien que humanin active ERK1/2 dans 5 min. examen localisation subcellulaire de ERK1/2 en réponse à différents peptides nous donnera une meilleure compréhension de la biologie de ces peptides. Des preuves nouvelles, ont montré que la localisation subcellulaire de molécules de signalisation joue un rôle crucial dans leurs effets en aval. Par exemple, STAT3 est traditionnellement connu pour être localisés principalement dans le cytosol des cellules au repos, et ensuite il translocation dans le noyau pour activer l’expression des gènes en réponse à des cytokines18. Stat3 également translocation aux mitochondries et régule le cycle de Krebs et ATP production19. Concernant le règlement de l’autophagie, différente localisation subcellulaire de STAT3 module autophagie dans diverses manières20. Par exemple, nucléaire STAT3 transcriptionnellement régule les gènes liés à l’autophagie et agit comme un modulateur de l’autophagie. Cytoplasmique STAT3 inhibe constitutivement autophagie en interagissant avec autophagie molécules de signalisation. Mitochondrial STAT3 inhibe et empêche mitophagy en supprimant le stress oxydatif induit par autophagie. Par conséquent, cette méthode d’isolation compartiment subcellulaire est cruciale pour comprendre le rôle des autres molécules de signalisation ainsi que les ERK1/2.

<table><tbody><tr><td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9102</td><td>Dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>4370</td><td>Dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>Lamine B1</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>12586</td><td>Marqueur nucléaire, dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>5174</td><td>Marqueur cytoplasmique, dilution 1:2 000</td></tr><tr><td>Tom20</td><td>Santa cruz</td><td>SC-17764</td><td>Marqueur mitochondrial, dilution 1:2 000</td></tr><tr><td>anti-Rabbit-HRP conjuguée</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>7074</td><td>Dilution 1:30 000</td></tr><tr><td>RIPA Tampon de lyse et d’extraction</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Boîte de culture</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>HNG peptide</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25mm Filtre Sylinge</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Racleur cellulaire</td><td>FALCON</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Halte et commerce ; Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase (100X)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Pestle Assemblages de broyeurs de tissus avec pilons lisses</td><td>Thomas Scientific</td><td>3432S90</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>8-16 % Mini-PROTEAN TGX Gels de</td> <td>protéines préfabriquéesBIO RAD</td><td>4561104</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot</td> Module <td>BIO RAD</td><td>1658030</td> Trans-Blot Turbo Système de transfert BIO RAD 1704150 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF KIT DE TRANSFERT</td><td>BIO RAD</td><td>1704272</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrats</td> de transfert <td>BIO RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>Restore</td> <td>Western blotThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur, Medel : FB120</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>695320-07-12</td><td></td></tr></tbody></table>

fractionnement subcellulaire pour l’activation de erk par traitement de peptides dérivés mitochondriale

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Peptides dérivés mitochondrial (AMD) sont une nouvelle classe de peptides qui sont codées par des cadres de lecture ouvert petit au sein d’autres gènes connus du génome mitochondrial. Les AMD ont une grande variété d’effets biologiques tels que la protection des neurones contre l’apoptose, l’amélioration des marqueurs métaboliques et protégeant les cellules de la chimiothérapie. Humanin a été le premier MDP à découvrir et est la plus étudiée peptide parmi la famille des MDP. Les récepteurs membranaires et les voies de signalisation en aval de humanin ont été soigneusement caractérisés. Les AMD supplémentaires telles que des MOTS-c et SHLP1-6 ont été découvertes plus récemment et les mécanismes de signalisation n’ont pas encore à élucider. Nous décrivons ici une méthode fondés sur la culture de cellules pour déterminer la fonction de ces peptides. En particulier, les techniques de fractionnement cellulaire en combinaison avec western blot permettent la détermination quantitative de l’activation et la translocation de la molécule de signalisation importante. Bien qu’il existe d’autres méthodes de fractionnement cellulaire, celle décrite ici est une méthode simple et directe. Ces méthodes peuvent être utilisées pour élucider plus loin le mécanisme d’action de ces peptides et d’autres agents thérapeutiques.

À l’aide de la procédure présentée ici, nous avons traité des cellules HEK293 et SH-SY5Y avec 1 μM et 100 μM S14G-humanin, un humanin puissant analogiques21, respectivement, dans toutes les médias pour les périodes indiquées (Figure 1A et Figure 1 B). nous avons ensuite examiné la forme totale et phosphorylée de ERK1/2 au Thr202/Tyr204 , extraits de ...

Ce protocole décrit comment stimuler les cellules avec des peptides dérivés mitochondriale et évaluer la signalisation cascade et la localisation des phospho-protéines.

Fractionnement subcellulaire pour l’Activation de ERK par traitement de peptides dérivés mitochondriale

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

L’objectif global de cette expérience est d’identifier la cascade de signalisation en aval impliquée dans les cellules stimulées par des peptides dérivés de mitochondries. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine des peptides dérivés des mitochondries, telles que les voies de signalisation impliquées et l’endroit où cela se produit. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple et relativement facile à réaliser.Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons examiné la signalisation ERK médiée par l’homme, qui nous a donné des informations limitées sur les faits en aval. La méthode de Kersher à sous-échelle nous a donné une meilleure idée du rôle de la signalisation médiée par l’homme. Le troisième jour après le placage et le lavage deux fois dix à sixième, cellules SH-SY5Y ou HEK293 selon le protocole texte.Dissoudre les peptides d’humanine S14G dans de l’eau distillée filtrée à deux microns point zéro. Et les reconstituer sous la forme d’une solution mère d’un millimolaire. Aliquote le milieu préchauffé contenant ou sans sérum dans un tube conique de 15 millilitres et ajoutez une solution mère de peptide humanin à tempéra

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Dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale des cellules souches embryonnaires humaines peuvent être analysées à l'aide des tests d'activité de gel.

Palpage pour activité complexe mitochondrial dans les cellules souches embryonnaires humaines

Les effets de l'activation de la protéine kinase C (PKC) isozymes de la fonction mitochondriale associés à la respiration et la phosphorylation oxydative et sur la viabilité cellulaire sont décrites. L'approche technique s'adapte adénoviral de façon sélective surexprimer isoenzymes de PKC dans une culture cellulaire primaire et une variété de tests pour déterminer les fonctions mitochondriales et l'état énergétique de la cellule.

Évaluation des fonctions mitochondriales et la viabilité cellulaire dans les cellules rénales surexprimant la protéine kinase C Isozymes

De nombreux ARNm codant pour des protéines mitochondriales sont associés à la membrane externe de la mitochondrie. Nous décrivons un procédé de fractionnement subcellulaire visant à l'isolement des mitochondries de levure avec ses ARNm et des ribosomes associés. Ce protocole peut être appliqué à des cellules cultivées dans des conditions diverses dans le but de révéler les mécanismes de localisation des ARNm et traduction localisée près des mitochondries.

Isolement des ARNm associés aux mitochondries de levure pour étudier les mécanismes de traduction localisée

Ici, nous décrivons comment étudier la localisation mitochondriale d’une kinase (cycle cellulaire), et comment déterminer sa position sous-mitochondriale ainsi que les substrats/cibles mitochondriaux potentiels. L’expression forcée de protéines dans les mitochondries fournit un outil utile pour étudier les conséquences fonctionnelles de la localisation mitochondriale d’une protéine d’intérêt.

Approches expérimentales pour l&#39;étude mitochondrial Localisation et fonction d&#39;une cellule du cycle nucléaire Kinase, Cdk1

Les protéines kinases sont des enzymes de signalisation hautement évoluées et des échafaudages qui sont essentiels pour la transduction du signal inter et intracellulaire. Nous présentons un protocole pour mesurer l'activité de la kinase par l'utilisation d'adénosine triphosphate radiomarqué ([γ- 32 P] ATP), une méthode fiable pour faciliter l'élucidation de la régulation de la signalisation cellulaire.

Dosage de l&#39;activité des protéines kinase avec ATP radiomarqué

Saisie par électrochocs (ECS) est un modèle animal expérimental de la thérapie par électrochocs pour dépression sévère. ECS dans le monde stimule l’activité dans l’hippocampe, conduisant à la synaptogénèse et la plasticité synaptique. Nous décrivons ici les méthodes pour l’induction de ECS chez les rats et pour fractionnement subcellulaire de leur hippocampe pour examiner les changements induits par saisie en protéines synaptiques.

Par électrochocs saisies chez le rat et le fractionnement de leur hippocampe pour examiner la saisie-induced Changes in densité postsynaptique protéines

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les membrane plasmique, cytoplasme et les mitochondries des cellules U937 sans l’utilisation de la centrifugation à grande vitesse. Cette technique peut servir à purifier les fractions subcellulaires pour un examen subséquent de la localisation de la protéine par immunoblotting.

Fractionnement de cellules des cellules U937 en l’Absence de Centrifugation à haute vitesse

Le laser femtoseconde étroitement focalisé peut fournir la stimulation précise aux cellules en étant couplé dans une microscopie confocale permettant l'observation et la photostimulation en temps réel. La photostimulation peut activer des événements moléculaires cellulaires, y compris la voie de signalisation ERK et les éclairs mitochondriaux des espèces réactives d'oxygène.

Photostimulation par Femtosecond Laser Actives Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells Photo

Malgré les progrès récents, de nombreuses protéines mitochondriales de levure restent encore avec leurs fonctions complètement inconnues. Ce protocole fournit une méthode simple et fiable pour déterminer la localisation de la soumissionochondriale des protéines, ce qui a été fondamental pour l’élucidation de leurs fonctions moléculaires.

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Les RASopathies sont des syndromes génétiques multisystémiques causés par l’hyperactivation de la voie RAS-MAPK. Des variants potentiellement pathogènes en attente de validation émergent en permanence alors que de mauvaises preuves précliniques limitent le traitement. Ici, nous décrivons notre protocole in vivo pour tester et valider les niveaux d’activation ERK associés à RASopathy et sa modulation pharmacologique au cours de l’embryogenèse par imagerie FRET en direct chez le poisson-zèbre...

Un protocole efficace pour évaluer la modulation de l’activité ERK dans des modèles précoces de poisson zèbre du syndrome de Noonan via la microscopie FRET en direct et l’immunofluorescence

Découvrez le fractionnement subcellulaire pour étudier l'activation d'ERK par des peptides dérivés mitochondriaux dans les cellules SH-SY5Y et HEK293. Cette méthode permet d'analyser la localisation des phosphoprotéines.

Fractionnement subcellulaire pour l’Activation de ERK par traitement de peptides dérivés mitochondriale

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