Protocole amélioré pour l’immunoprécipitation de la chromatine du Muscle squelettique de souris

L’objectif global de cette procédure est de préparer la chromatine à partir du muscle squelettique de souris adulte. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la régulation des gènes et les fibres musculaires squelettiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de préparer de la chromatine de qualité ChIP à partir du muscle squelettique de la souris.

Un tissu physiquement résistant avec une teneur élevée en protéines structurelles. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous cherchions à caractériser les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’atrophie musculaire à l’utilisation du gluco, qui nécessite l’identification des récepteurs gluco-articulés, des sites de liaison à l’ADN dans les fibres musculaires squelettiques de souris. La démonstration de la procédure sera assurée par Shilpy Joshi, une post-doctorante de notre laboratoire.

Pour commencer cette procédure, récupérez les muscles des membres postérieurs gelés ou fraîchement disséqués. Ensuite, hachez les muscles dans un tube à essai de deux millilitres, contenant un millilitre de tampon hypotonique glacé pour obtenir une préparation homogène de petits morceaux, à l’aide de ciseaux fins. Ensuite, laissez le tube agiter sur un agitateur de paillasse à quatre degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes.

Ensuite, transférez le tissu disséqué dans un tube à fond rond de 14 millilitres contenant quatre millilitres de tampon hypotonique froid. Homogénéisez le tissu haché à l’aide d’un homogénéisateur mécanique pendant 15 à 30 secondes. Ensuite, transférez l’homogénat dans un tube de 15 millilitres.

Ajoutez un tampon hypotonique froid pour obtenir 10 millilitres de l’échantillon et fixez l’homogénat avant de passer à la souris suivante. Dans cette procédure, ajoutez du formaldéhyde à l’échantillon pour obtenir une concentration finale de 1 %. Et puis secouez pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, ajoutez de la glycine pour obtenir une concentration finale de 0,125 molaire dans chaque tube pour arrêter la fixation. Et agitez pendant cinq à 10 minutes à température ambiante. Après cela, homogénéisez le lysat fixé, à l’aide d’une dounce lâche.

Ensuite, transférez-le dans un tube de 15 millilitres et centrifugez-le à 1000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir des noyaux et des débris cellulaires. Après cinq minutes, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de tampon hypotonique frais. Filtrez le lysat à travers une crépine de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres.

À l’aide d’une pointe de pipette, lavez le filtre avec un millilitre de tampon hypotonique froid. Ensuite, filtrez à nouveau le filtrat à travers une crépine de 40 micromètres. Par la suite, transférez le filtrat dans un tube de 15 millilitres.

Et centrifuger à 1000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir la pastille nucléaire. Après avoir jeté le surnageant, utilisez un millilitre de tampon hypotonique pour regrouper les trois granulés et transférez-les dans un tube de 1,5 à deux millilitres. Centrifuger à 1000 g pendant cinq minutes.

Ensuite, évaluez le volume de la pastille nucléaire par rapport à des tubes contenant un volume connu de liquide et mettez-la en suspension dans un tampon de sonication jusqu’à trois à quatre fois le volume nucléaire emballé. Par la suite, sonicez la suspension pendant 10 à 15 minutes à quatre degrés Celsius, à l’aide d’un sonicateur. Centrifugez l’échantillon soniqué et transférez le surnageant de chromatine dans un tube frais de 1,5 millilitre.

Pour dé-réticuler, prenez 30 microlitres de chromatine dans un tube à essai de 1,5 millilitre et ajoutez 20 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires et 450 microlitres d’eau. Complétez le volume à 500 microlitres et incubez à 65 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, effectuez un traitement avec un microlitre de protéinase K, 10 microlitres de deux tris molaires à pH 6,8 et 10 microlitres d’EDTA 0,5 molaire pendant une heure à 42 degrés Celsius.

Ensuite, effectuez une extraction régulière de phénol-chloroforme chloroforme et précipitez l’ADN avec un volume d’acétate de sodium et deux volumes d’éthanol à 100 % pendant une heure à moins 80 degrés Celsius ou une nuit à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, granulez l’ADN par centrifugation à 13 500 g pendant 15 minutes. Décantez le surnageant et lavez soigneusement la pastille avec de l’éthanol froid à 70 % et centrifugez-la à nouveau pendant cinq minutes.

Ensuite, décantez le surnageant et faites sécher la pastille à l’air. Après cela, remettez la pastille en suspension dans le volume d’origine du tampon tris HCl EDTA. Mesurer la concentration d’ADN dans un spectrophotomètre par des absorbants à 260 nanomètres, 280 nanomètres.

Par la suite, pipetez 500 à 1000 nanogrammes d’ADN avec une échelle de la taille d’un ADN sur des voies séparées d’un gel d’agarose à 1,5 %. Et effectuer une électrophorèse pour évaluer la taille des fragments de chromatine. Pour optimiser, l’homogénéisation a été effectuée pendant 15 secondes ou 45 secondes à deux vitesses, 18 000 et 22 000 tr/min.

Dans toutes les conditions, les noyaux pouvaient être séparés des débris tissulaires, mais le rendement était optimal en utilisant une vitesse plus faible. Les noyaux peuvent également être préparés en les faisant couler pendant trois à cinq minutes. Mais l’homogénéisation mécanique est la méthode de choix car les rendements optimaux des noyaux peuvent être obtenus en aussi peu que 15 secondes, ce qui permet un gain de temps important, surtout si plusieurs échantillons doivent être traités.

En utilisant ce protocole, jusqu’à 2,7 fois 10 à sept noyaux de 500 milligrammes de tissu peuvent être isolés pour générer 100 microgrammes de chromatine. La chromatine préparée de cette manière donne des résultats nets et de haute qualité dans les expériences de séquençage ChIP. Comme l’illustrent les niveaux élevés de K27 acétylé de l’histone H3 et de l’ARN polymérase 2 au locus de Desmond exprimé par le muscle.

La spécificité de la fibre musculaire est démontrée par un signal faible ou absent aux loci Pecam1 et Vcam1 qui ne sont pas exprimés dans le muscle. Lors de cette procédure, il est important d’immerger correctement la sonde de l’homogénéisateur dans l’échantillon pour éviter la mousse, pour nettoyer la sonde entre les échantillons et pour optimiser la fragmentation de la chromatine. La chromatine préparée de cette manière a été utilisée avec succès pour le bien de ChIP pour cartographier l’occupation des facteurs de transcription à l’échelle du génome et devrait également convenir aux techniques de capture de confirmation de la chromatine.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie à la recherche dans le domaine de la génomique, pour explorer la régulation des gènes dans le muscle squelettique de souris. La procédure peut également être appliquée aux muscles du rat et aux biopsies de patients humains. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser l’homogénéisation mécanique, suivie de la purification des noyaux fixés au formaldéhyde pour préparer la chromatine du muscle squelettique pour l’immunoprécipitation.

N’oubliez pas que travailler avec du formaldéhyde, du phénol, du chloroforme et de la protéinase K peut être dangereux. Des précautions telles que le port de gants et de lunettes doivent être prises. Les étapes impliquant ces réactifs doivent être effectuées sous une cagoule.