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Advanced Biology

Le test TUNEL

The TUNEL Assay

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Cell Biology

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JoVE Science Education Cell Biology

The TUNEL Assay

4.12: Detecting Reactive Oxygen Species

4.15: Annexin V and Propidium Iodide Labeling

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08:12 min

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April 30, 2023

Overview

Une des caractéristiques de l’apoptose est la fragmentation de l’ADN nucléaire par les nucléases. Ces enzymes sont activées par des caspases, la famille de protéines qui exécute le programme de mort cellulaire. Essai TUNEL est une méthode qui tire parti de cette fonctionnalité pour détecter les cellules apoptotiques. Dans ce test, une enzyme appelée transférase terminale de deoxynucleotidyl catalyse l’addition de nucléotides dUTP jusqu’aux extrémités 3′ de fragments d’ADN. À l’aide de dUTPs qui sont étiquetés avec des tags chimiques qui peuvent produire la fluorescence ou la couleur, les cellules apoptotiques peuvent être spécifiquement identifiées.

Vidéo de JoVE sur l’essai TUNEL commence par discuter comment cette technique peut être utilisée pour détecter les cellules apoptotiques. Nous passons ensuite à travers un protocole général pour effectuer des essais TUNEL sur coupes tissulaires et visualiser les résultats en utilisant la microscopie à fluorescence. Enfin, plusieurs applications de l’analyse à la recherche actuelle seront couverts.

Procedure

L’essai TUNEL est plus couramment utilisé pour détecter les cellules en apoptose, ce qui est une forme de mort cellulaire programmée. L’apoptose est un processus biologique important au cours du développement et pour le maintien de l’homéostasie tissulaire. TUNEL coloration permet pour la visualisation et la quantification des cellules apoptotiques. Cela aide les scientifiques à tester l’efficacité de nouveaux traitements pour les troubles dont l’apoptose est inhibée, comme dans le cancer, ou amélioré, comme la neurodégénérescence.

Cette vidéo vous expliquera comment l’essai TUNEL peut être utilisé pour étiqueter des cellules en apoptose, un protocole étape par étape pour réaliser ce procédé dans des sections de tissu, et comment les chercheurs appliquent cette technique afin de comprendre les mécanismes de mort cellulaire.

Avant de plonger dans le protocole de l’essai TUNEL, nous allons discuter les principes qui sous-tendent cette technique.

Une des nombreuses caractéristiques caractéristique de l’apoptose est la fragmentation de l’ADN. Comment la fragmentation de l’ADN se produit-elle ? L’apoptose est effectuée par des enzymes appelées caspases présents dans le cytosol. Leur rôle principal est de cliver les protéines afin de démanteler la cellule. En outre, les caspases activer une enzyme appelée caspase-activated DNase, ou CAD, en détachant de son inhibiteur — la CISD. Activés CAD est une endonucléase qui se déplace vers le noyau et Clive l’ADN chromosomique.

Clivage de l’ADN provoque finalement l’accumulation de fragments d’ADN avec les extrémités ébréchées, et l’essai TUNEL Fluorescent étiquettes ces entaillé les extrémités des fragments d’ADN, permettant aux scientifiques détecter l’apoptose. Mais comment cela se passe-t-il ? Pour cela vous devez comprendre la réaction de TUNEL. TUNEL est synonyme de terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-fin d’étiquetage. Les deux principaux réactifs TUNEL sont transférase terminale de deoxynucleotidyl, TdT et uridine triphosphate ou dUTP, qui peut-être être étiqueté fluorescent pour la facilité de détection.

Afin de comprendre la réaction de TUNEL, revenons sur les cellules apoptotiques avec des fragments d’ADN. Ces entaillé fragments ont des groupes hydroxyles libres 3′. Une fois que vous ajoutez les réactifs TUNEL à un échantillon contenant des cellules apoptotiques, les fluorescent étiquetés dUTPs joindre à ces groupes d’hydroxyle 3′ avec l’aide de l’enzyme catalyseur TdT. Les cellules colorées à l’aide de cette procédure sont appelés cellules TUNEL, qui peuvent ensuite être visualisées à l’aide de la microscopie de fluorescence.

Maintenant que vous comprenez les principes fondamentaux et les concepts qui sous-tendent l’essai TUNEL, nous allons décrire un protocole général pour effectuer cette technique dans des sections de tissu. Les principales étapes de l’essai TUNEL incluent le tissu d’intérêt, perméabilisation du tissu, ajout de réactifs TUNEL, arrêt de la réaction de TUNEL et enfin l’analyse de fixation.

Tout d’abord, le tissu d’intérêt doit être fixé afin de préserver les structures biologiques. Fixation fonctionne par réticulation des protéines dans les cellules. Pour l’essai TUNEL, les tissus peuvent être fixées en les ajoutant à une solution contenant de paraformaldéhyde à 4 % pendant 4 à 24 heures à 4° C. Après fixation, cryosection le tissu en fines tranches de 10 µm ou moins.

L’étape suivante est la perméabilisation, ce qui permet des réactifs comme l’enzyme TdT de pénétrer dans le noyau de la cellule. Perméabilisation des sections de tissu peut être effectuée en ajoutant le tissu à la solution de protéinase K de 5 à 15 minutes à 37° C. Rincer les coupes de tissus avec une solution saline tamponnée au phosphate dans un agitateur orbital pendant 15-30 minutes à température ambiante.

Après perméabilisation, l’enzyme TdT et dUTPs fluorescent étiquetés sont ajoutés à des coupes de tissus, ainsi qu’un étiquetage tampon contenant du cobalt qui agit comme un cofacteur de la réaction de TUNEL. Ensemble, le mélange réactionnel de TUNEL et la section de tissu sont incubés pendant 1 à 3 heures à 37° C et abri de la lumière pour éviter la fluorescence de l’effacement.

Après l’incubation, tampon de butée est ajouté à la section de tissu de cesser la réaction de TUNEL, et après une courte période d’incubation les sections sont lavées avec un tampon phosphate salines. Enfin, des coupes de tissus colorés à l’aide de dUTP fluorescent étiqueté sont visualisées à l’aide de la microscopie de fluorescence et évalué pour la localisation des cellules dans un tissu donné TUNEL. On peut quantifier la mort cellulaire simplement en comptant le pourcentage de cellules TUNEL dans une section de tissu donné.

Maintenant que vous avez vu comment exécuter l’essai TUNEL pour détecter les cellules apoptotiques, nous allons discuter de comment ce test peut être utilisé pour traiter les questions posées par les biologistes cellulaires.

La mort cellulaire se produit dans le cadre normal du développement pour la sculpture des tissus et des structures et pour l’élimination des cellules inutiles. Par conséquent, scientifiques intéressent dans l’étude de ce phénomène l’effet de l’exposition prénatale à différentes substances sur l’apoptose au cours du développement. Ici, les scientifiques se sont intéressés en examinant l’effet de l’exposition prénatale à l’alcool sur le développement du cerveau. Les résultats de coloration de TUNEL effectuées sur le cerveau foetal a révélé une augmentation de l’apoptose dans les tissus qui ont été exposés avant leur naissance à l’alcool, par rapport aux animaux témoins.

Les scientifiques utilisent également l’essai TUNEL pour enquêter sur l’apoptose en réponse à une infection bactérienne. Dans cette expérience, les scientifiques a développé un modèle de pneumonie en injectant des souris avec Pseudomonas aeruginosa, qui induit une inflammation pulmonaire. Ensuite, les tissus pulmonaires a été supprimé et TUNEL coloration a été réalisée afin d’examiner l’apoptose en réponse à l’infection bactérienne. Les résultats montrent que la mort cellulaire par apoptose a augmenté chez les souris exposées à la bactérie, par rapport aux animaux témoins.

Enfin, TUNEL de coloration peut être utilisée sur des échantillons de tumeur humaine, afin de déterminer la réactivité de la tumeur aux médicaments. Dans cet exemple, des échantillons de tumeur ont été récoltés sur des patients humains et cultivées ex vivo. Ensuite, ils ont été traités avec des médicaments précliniques et évalués pour une réponse à l’aide de l’essai TUNEL. Les données obtenues montrent que le traitement avec un médicament qui inhibe la protéine de choc thermique 90 sensiblement augmente l’apoptose dans le tissu tumoral.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur l’utilisation de l’essai TUNEL pour détecter les cellules en apoptose. Cette vidéo a examiné les principes qui sous-tendent le TUNEL de coloration et un protocole étape par étape pour effectuer l’essai TUNEL sur coupes de tissus. Nous avons également examiné comment cette méthode pourrait être appliquée pour comprendre la mort cellulaire programmée lors du développement et de la maladie. Comme toujours, Merci pour regarder !

Transcript

The TUNEL assay is most commonly used to detect cells undergoing apoptosis, which is a form of programmed cell death. Apoptosis is an important biological process during development, and for maintaining tissue homeostasis. TUNEL staining allows for visualization and quantification of apoptotic cells. This helps scientists test efficacy of new treatments for disorders in which apoptosis is either inhibited, like in cancer, or enhanced, as in neurodegeneration.

This video will explain how the TUNEL assay can be used to label cells undergoing apoptosis, a step-by-step protocol for performing this method in tissue sections, and how researchers are applying this technique to understand mechanisms of cell death.

Before delving into the protocol of the TUNEL assay, let’s discuss the principles behind this technique.

One of the many hallmark characteristics of apoptosis is DNA fragmentation. How does DNA fragmentation occur? Apoptosis is carried out by enzymes called caspases present in the cytosol. Their primary role is to cleave proteins in order to dismantle the cell. In addition, caspases activate an enzyme called caspase-activated DNase, or CAD, by detaching it from its inhibitor—ICAD. Activated CAD is an endonuclease that travels to the nucleus and cleaves chromosomal DNA.

Cleavage of DNA ultimately causes accumulation of DNA fragments with nicked ends, and the TUNEL assay fluorescently labels these nicked ends of fragmented DNA, allowing scientists to detect apoptosis. But how does this happen? For that you have to understand the TUNEL reaction. TUNEL stands for terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling. The two main TUNEL reagents are terminal deoxynucleotidyl transferase, or TdT, and deoxyuridine triphosphate, or dUTP, which may be fluorescently labeled for ease of detection.

In order to understand the TUNEL reaction, let’s go back to the apoptotic cells with DNA fragments. These nicked fragments have free 3′ hydroxyl groups. Once you add the TUNEL reagents to a sample containing apoptotic cells, the fluorescently labeled dUTPs attach to these 3′ hydroxyl groups with the help of the catalyst enzyme TdT. The cells stained using this procedure are called TUNEL positive cells, which can then be visualized using fluorescence microscopy.

Now that you understand the basic principles and concepts behind the TUNEL assay, let’s outline a general protocol for performing this technique in tissue sections. The major steps of the TUNEL assay include fixing the tissue of interest, permeabilization of the tissue, adding TUNEL reagents, stopping the TUNEL reaction, and finally the analysis.

First, the tissue of interest must be fixed in order to preserve biological structures. Fixation works by crosslinking proteins within cells. For the TUNEL assay, tissues can be fixed by adding them to a solution containing 4% paraformaldehyde for 4–24 hours at 4°C. After fixation, cryosection the tissue into thin slices of 10 µm or less.

The next step is permeabilization, which allows for reagents such as the TdT enzyme to penetrate the cell nucleus. Permeabilization of tissue sections can be performed by adding the tissue to proteinase K solution for 5–15 minutes at 37°C. Rinse tissue sections with phosphate buffered saline on an orbital shaker for 15–30 minutes at room temperature.

Following permeabilization, the TdT enzyme and fluorescently labeled dUTPs are added to the tissue sections, along with a labeling buffer containing cobalt that acts as a cofactor for the TUNEL reaction. Together, the TUNEL reaction mixture and the tissue section are incubated for 1–3 hours at 37°C, and protected from light to prevent the fluorescence from fading.

Following incubation, stop buffer is added to the tissue section to cease the TUNEL reaction, and after a short incubation the sections are washed with phosphate buffered saline. Finally, tissue sections stained using fluorescently tagged dUTP are visualized using fluorescence microscopy, and assessed for localization of TUNEL positive cells within a given tissue. One can quantify cell death simply by counting the percentage of TUNEL positive cells in a given tissue section.

Now that you’ve seen how to perform the TUNEL assay to detect apoptotic cells, let’s discuss how this assay can be used to address questions asked by cell biologists.

Cell death occurs as a normal part of development for the sculpting of tissues and structures, and for the elimination of unnecessary cells. Therefore, scientists interested in this phenomenon study the effect of prenatal exposure to different substances on apoptosis during development. Here, scientists were interested in examining the effect of prenatal alcohol exposure on brain development. The results of TUNEL staining performed on fetal brains revealed increased apoptosis in tissues that were prenatally exposed to alcohol, as compared to control animals.

Scientists also use the TUNEL assay to investigate apoptosis in response to bacterial infection. In this experiment, scientists developed a model of pneumonia by injecting mice with Pseudomonas aeruginosa, which induces lung inflammation. Then, lung tissue was removed and TUNEL staining was performed to examine apoptosis in response to the bacterial infection. Results show that apoptotic cell death increased in mice exposed to the bacteria, as compared to control animals.

Lastly, TUNEL staining can be used on human tumor samples, in order to determine tumor responsiveness to drugs. In this example, tumor samples were harvested from human patients and cultured ex vivo. Next, they were treated with pre-clinical drugs and assessed for a response using the TUNEL assay. Data obtained show that treatment with a drug that inhibits heat shock protein 90 significantly increases apoptosis in tumor tissue.

You’ve just watched JoVE’s video on using the TUNEL assay to detect cells undergoing apoptosis. This video reviewed the principles behind TUNEL staining, and a step-by-step protocol to perform the TUNEL assay on tissue sections. We also reviewed how this method could be applied to understand programmed cell death during development and disease. As always, thanks for watching!

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