Surveiller l’effet du Stress osmotique sur les vésicules de sécrétion et exocytose

L’objectif global de cette méthodologie analytique combinée est de fournir des informations sur la façon dont les vésicules sécrétoires dans les cellules réagissent à une force physique, telle que la pression osmotique extracellulaire, et comment les ajustements de ces organites affectent davantage le processus d’exocytose. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que : comment les vésicules sécrétoires réagissent-elles directement aux changements de l’environnement extracellulaire ou au traitement médicamenteux ? Le principal avantage de cette approche est de surveiller les effets directs sur le contenu vésiculaire des cellules vivantes et de savoir distinguer l’altération de leur libération chimique avant et après le traitement de l’exocytose.

Pour obtenir une surface d’électrode à disque plat, placez l’électrode dans le support d’un microbroyeur et biseautez chaque électrode en fibre de carbone à un angle de 45 degrés. Ensuite, marquez le capillaire pour référence future sur la façon de localiser la surface de l’électrode du disque à un angle de 45 degrés lorsque vous placez l’électrode près des cellules pour la mesure de l’exocytose. Pour effectuer un enregistrement ampérométrique sur des cellules individuelles, montez la microélectrode à disque en fibre de carbone fraîchement biseautée et testée dans le porte-électrode de l’étage de tête qui est utilisé avec un potentiostat.

Avant utilisation, placez chaque microélectrode en fibre de carbone dans une solution d’essai pour surveiller le courant d’état d’étude à l’aide de la voltampérométrie cyclique. Pour un balayage voltampérométrique cyclique, appliquez une forme d’onde potentielle triangulaire de moins 0,2 volt à positif 0,8 volts contre une électrode de référence argent-chlorure d’argent à 100 millivolts par seconde pour assurer une bonne cinétique de réaction. Pour l’enregistrement ampérométrique de l’exocytose, placez la boîte de Pétri avec des cellules de chromaffine cultivées dans un tampon isotonique sur un microscope inversé dans une cage de Faraday.

Utilisez une platine chauffante de microscope pour maintenir une température de 37 degrés Celsius pendant les expériences sur cellule. Ensuite, utilisez un instrument de pince patch à faible bruit pour appliquer un potentiel constant de positif 700 millivolts à l’électrode de travail. Pour l’enregistrement de l’exocytose des cellules chromaffines, numérisez le signal à 10 kilohertz et appliquez un filtre de Bessel passe-bas interne à deux kilohertz pour filtrer le signal enregistré.

Notez que l’électrode du disque ovale doit être placée à plat sur le dessus des cellules et parallèlement à la surface de la boîte de Pétri. De plus, les électrodes sont biseautées le même jour que les expériences pour assurer une surface d’électrode propre. Pour stimuler l’exocytose cellulaire, placez une micropipette en verre remplie de cinq millimolaires de chlorure de baryum à une distance d’au moins 20 micromètres de la cellule.

Ensuite, appliquez une impulsion d’injection de cinq millimolaires de solution de chlorure de baryum sur la surface de la cellule pour stimuler l’exocytose cellulaire. Placez la pipette à tige dans la solution et stimulez l’exocytose cellulaire en appliquant une impulsion d’injection de baryum tout en enregistrant les transitoires de courant ampérométrique pendant environ trois minutes. Pour comparer les réponses exocytotiques dans des conditions isotoniques à des conditions hypertoniques, incubez les cellules pendant 10 minutes dans une solution tampon hypertonique.

Par la suite, appliquez une impulsion d’injection de baryum pour stimuler l’exocytose et effectuez trois minutes d’enregistrement ampérométrique. Pour la réponse réversible des cellules, incubez à nouveau les cellules pendant 10 minutes dans une solution tampon isotonique. Stimulez les cellules en appliquant une impulsion d’injection de baryum et effectuez trois minutes d’enregistrement de la réponse exocytotique.

Pour fabriquer les électrodes pour les mesures de taille quantique vésiculaire, préparez une électrode en fibre de carbone d’un diamètre de cinq micromètres. Sous un microscope, utilisez un scalpel pour couper la fibre de carbone qui s’étend hors de la pointe de verre de sorte qu’il ne reste que 30 à 100 micromètres. Utilisez une flamme de butane pour préparer une pointe gravée à la flamme de l’électrode en fibre de carbone.

Pour obtenir une pointe d’électrode de forme cylindrique uniformément gravée, tenez l’électrode en fibre de carbone de forme cylindrique tout en la faisant tourner. Et placez la fibre de carbone s’étendant du verre dans le bord bleu de la flamme de butane jusqu’à ce que la pointe du carbone développe une couleur rouge. Après la gravure à la flamme, placez l’électrode sous un microscope pour évaluer la pointe de l’électrode.

La taille de la pointe de l’électrode gravée doit être d’environ 50 à 100 nanomètres de diamètre. Ensuite, insérez la microélectrode cylindrique à nanopointe dans la solution d’époxy pendant trois minutes, suivie d’un trempage de 15 secondes de la pointe de l’électrode dans la solution d’acétone. Cela permet à l’époxy de sceller l’espace potentiel entre la fibre de carbone et la paroi capillaire du gaz isolant.

Alors que l’acétone nettoie l’époxy de la surface de l’électrode en fibre de carbone gravée. Pour durcir l’époxy, faites cuire les électrodes dans un four pendant la nuit à 100 degrés Celsius. Avant utilisation, testez le courant en régime permanent de chaque microélectrode en fibre de carbone à l’aide de la voltampérométrie cyclique.

Pour les expériences, n’utilisez que des électrodes qui affichent un courant de plateau d’environ 1,5 à 2,5 nanoampères. Pour les mesures d’ampérométrie intracellulaire, placez les cellules sous le microscope et utilisez les mêmes paramètres expérimentaux que le potentiostat. Prévenir des dommages physiques importants à la cellule.

Insérez la microélectrode cylindrique à nanopointes dans la cellule en ajoutant une force mécanique douce. Juste assez pour pousser l’électrode à travers la membrane plasmique cellulaire et dans le cytoplasme cellulaire à l’aide d’un micromanipulateur. Après l’insertion, et avec la membrane cellulaire scellée autour de l’électrode cylindrique, démarrez l’enregistrement ampérométrique in situ sur la cellule vivante.

Au potentiel d’oxydation appliqué à l’électrode, les vésicules s’adsorbent à la surface de l’électrode et se rompent stochastiquement. Par conséquent, il n’y a pas besoin d’un quelconque stimulus pour initier ce processus. Pour déterminer l’effet osmotique sur la taille quantique vésiculaire, collectez les mesures de cytométrie intracellulaire d’un groupe de cellules qui ont été incubées dans un tampon isotonique et hypertonique en utilisant les conditions expérimentales.

L’effet de l’osmolalité extracellulaire sur l’activité de l’exocytose est présenté comme la fréquence des événements d’exocytose lorsque les cellules de chromaffine sont stimulées avec une solution de baryum dans des conditions isotoniques, puis hypertoniques et enfin isotoniques. Ces données montrent une inhibition de l’activité de l’exocytose chez les cellules soumises à un stress osmotique et une récupération partielle peut être obtenue après le retour des cellules dans un environnement isotonique. L’expérience de contrôle montre la fréquence des événements d’exocytose après trois stimulations barytées consécutives au niveau des cellules chromaffines dans des conditions isotoniques.

Cela montre que la stimulation multiple du baryum dans le laps de temps utilisé dans ces expériences provoque une réduction de l’activité de l’exocytose par une stimulation cellulaire consécutive. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer ces méthodes analytiques complémentaires qui vous permettent de comparer comment les vésicules sécrétoires et le processus d’exocytose sont affectés par les altérations de l’environnement extracellulaire.