Name: Surveiller l’effet du Stress osmotique sur les vésicules de sécrétion et exocytose (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Découvrez comment surveiller l'effet du stress osmotique sur les vésicules de sécrétion et l'exocytose en utilisant des cellules chromaffines et des enregistrements ampérométriques. Cette méthode permet d'analyser la libération de neurotransmetteurs en temps réel.

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Les auteurs aimeraient remercier le Conseil de recherche suédois (349-2007-8680) pour le financement et la Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Suède) pour don de bovins des glandes surrénales.

<ol><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>Dunevall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+Catecholamine+Content+of+Single+Mammalian+Vesicles+by+Collision-Adsorption+Events+at+an+Electrode%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode.</a> J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).</li>
<li>Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromaffin+vesicle%3A+advances+in+understanding+the+composition+of+a+versatile%2C+multifunctional+secretory+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle.</a> Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).</li>
<li>Morris, S., Schultens, H., Schober, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+osmometer+model+for+changes+in+the+buoyant+density+of+chromaffin+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules.</a> Biophys J. 20 (1), 33(1977).</li>
<li>Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinkler%2C+H+%22Handbook+of+Physiology%22">Handbook of Physiology</a>. 6 (7), 321-399 (1975).</li>
<li>Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+calcium%2C+magnesium%2C+copper+and+iron+in+the+bovine+adrenal+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla.</a> Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).</li>
<li>Estévez-Herrera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP%3A+The+crucial+component+of+secretory+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">ATP: The crucial component of secretory vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).</li>
<li>Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+intravesicular+calcium+in+the+motion+and+exocytosis+of+secretory+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+integr+biol%22%5BJournal%5D)">On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles.</a> Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).</li>
<li>Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).</li>
<li>Terland, O., Flatmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+as+a+natural+constituent+of+chromaffin+granules+from+the+bovine+adrenal+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla.</a> FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).</li>
<li>Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragranular+pH+rapidly+modulates+exocytosis+in+adrenal+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells.</a> J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).</li>
<li>Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+characteristics+of+quantal+secretion+of+catecholamines+from+adrenal+medullary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).</li>
<li>Daniels, A., Williams, R., Wright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+character+of+the+stored+molecules+in+chromaffin+granules+of+the+adrenal+medulla%3A+a+nuclear+magnetic+resonance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study.</a> Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).</li>
<li>Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+external+osmotic+pressure+on+vesicular+secretion+from+bovine+adrenal+medullary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).</li>
<li>Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+vesicle+fusion+and+exocytosis+in+hypertonic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions.</a> Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).</li>
<li>Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+osmotic+stress+on+mast+cell+vesicles+of+the+beige+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membrane+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse.</a> J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).</li>
<li>Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+exocytosis+under+hypotonic+conditions+shows+two+distinct+populations+of+dense+core+vesicles+in+bovine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells.</a> Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).</li>
<li>Hampton, R. Y., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+changes+in+osmolality+on+the+stability+and+function+of+cultured+chromaffin+cells+and+the+possible+role+of+osmotic+forces+in+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis.</a> J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).</li>
<li>Troyer, K. P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+separation+of+vesicle+release+from+vesicle+fusion+during+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis.</a> J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).</li>
<li>Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytotic+release+from+individual+granules+exhibits+similar+properties+at+mast+and+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells.</a> Biophys J. 71 (3), 1633(1996).</li>
<li>Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ionic+composition+alters+kinetics+of+vesicular+release+of+catecholamines+and+quantal+size+during+exocytosis+at+adrenal+medullary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells.</a> J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).</li>
<li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+receptor-mediated+catecholamine+secretion+from+individual+chromaffin+cells.+Chemical+evidence+for+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis.</a> J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).</li>
<li>Wightman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+resolved+catecholamine+spikes+correspond+to+single+vesicle+release+from+individual+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells.</a> P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).</li>
<li>Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+osmotic+stress+reduces+the+vesicle+size+while+keeping+a+constant+neurotransmitter+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration.</a> ACS Chemical Neuroscience. , (2017).</li>
<li>Bath, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsecond+adsorption+and+desorption+of+dopamine+at+carbon-fiber+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes.</a> Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).</li>
<li>Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Measurement+of+Transmitters+in+Individual+Vesicles+in+the+Cytoplasm+of+Single+Cells+with+Nanotip+Electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes.</a> Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).</li>
<li>Zoski, C. G., Mirkin, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+limiting+currents+at+finite+conical+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes.</a> Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).</li>
<li>Mosharov, E. V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+exocytotic+events+recorded+by+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of exocytotic events recorded by amperometry.</a> Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).</li>
<li>Morris, J. K. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/244955881_A_Formaldehyde-Glutaraldehyde_Fixative_of_High_Osmolality_for_Use_in_Electron_Microscopy">A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).</li>
<li>Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docked+granules%2C+the+exocytic+burst%2C+and+the+need+for+ATP+hydrolysis+in+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells.</a> Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous présentons ici un protocole et les avantages de la combinaison de trois méthodes d’analyse complémentaires visant à analyser les vésicules sécrétrices et le processus d’exocytose à mieux comprendre comment une force physique comme la pression osmotique peut affecter des vésicules sécrétrices et le processus d’exocytose dans les cellules sécrétrices. Ces méthodes incluent la fibre de carbone avec des microélectrodes ampérométrie, qui est une méthode établie pour l’enregistrement de l’activité exocytose, intracellulai...

Les cellules chromaffines dans les glandes surrénales sont des cellules neuroendocrines qui libèrent des molécules de neurotransmetteur dans la circulation sanguine. Cela se produit à travers un processus cellulaire qui comporte l’arrimage et la fusion de vésicules remplies de neurotransmetteurs, résultant en une libération contenue des vésicules à l’espace extracellulaire dans un processus appelé exocytose. Les neurotransmetteurs (adrénaline et noradrénaline) dans les cellules chromaffines sont activement transportés par les protéines de membrane dans les vésicules de grand noyau dense (LDCVs) et stockés à des concentrations élevées (~0.5-1 M)1,2. Accumulation de neurotransmetteurs à l’intérieur des LDCVs s’effectue par l’affinité des molécules de catécholamines pour la matrice de protéine de noyau dense intravésiculaire composée de chromogranine protéines (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6et une solution de cocktail intravésiculaire contenant des composants clés pour le chargement de catécholamines et de stockage dans la vésicule tels que l’ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 µM dans la solution et ~ 40 mM lié à la matrice de protéine)8Mg2 + (5 mM)9, ascorbate (10-30 mM)10et un pH de ~5.511,12. Les LDCVs maintiennent une condition iso-osmotique avec la cellule cytoplasme (310 mOsm/kg)13, même si la concentration en soluté théorique à l’intérieur des vésicules somme jusqu'à plus de 750 mM. La composition des composants intravésiculaire n’est pas seulement essentielle pour le chargement et le stockage des catécholamines, mais aussi pour l’agrégation des solutés à la matrice de protéine de noyau dense. Ceci réduit considérablement l’osmolarité des vésicules est réduit de façon significative et peuvent affecter la catécholamine de quantité qui est libérée au cours de l’exocytose5,6.
Études sur l’effet de la pression osmotique extracellulaire sur le processus d’exocytose par ampérométrique enregistrement ont rapporté cette forte pression osmotique extracellulaire inhibe l’activité de l’exocytose et réduit le nombre de neurotransmetteurs sécrétés par simple vésicule compartiments4,14,15,16,17,18,19. Les explications de ces observations ont spéculé sur la possible amélioration d’entassement macromoléculaires dans les événements de fusion cellule cytoplasme inhibant vésicule et une altération des propriétés biophysiques de la membrane affectant le nombre de neurotransmetteurs libérés au cours de l’exocytose. Ces pensées suppose que le stress osmotique extracellulaire élevé n’affecte pas la taille quantiques de vésicules, qui définit le nombre de molécules de neurotransmetteurs stockés dans un compartiment de vésicules au stade préalable d’exocytose déclenchée14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. dans ampérométrique mesures de libération d’exocytose dans des cellules individuelles, une microélectrode de disque Fibre de carbone est placée en contact étroit avec la surface de la cellule, créant ainsi un ensemble expérimental en imitant la configuration de la synapse, où l’ampérométrique électrode sert un détecteur postsynaptique (Figure 1)22,23. En stimulant une cellule à l’exocytose, on peut induire des vésicules remplies de neurotransmetteurs fusionnent avec la membrane plasmique et de libérer la partie ou le contenu de la vésicule complète dans l’espace extracellulaire. Ces molécules de neurotransmetteur libérés à la surface de l’électrode peuvent être détectées par voie électrochimique si les neurotransmetteurs sont des polymères électroactifs (p. ex., catécholamines) en appliquant un potentiel redox de + 700 mV vs une électrode de référence Ag/AgCl . En conséquence, une série de pointes de courants marquent la détection des événements individuels de l’exocytose. De l’approche actuelle et trace temporelle dans un enregistrement ampérométrique, la zone située sous chaque Picot ampérométrique unique représente la charge détectée par l’événement de l’exocytose et peut être convertie à la taupe des neurotransmetteurs libérés, à l’aide de l’équation de Faraday. Par conséquent, les enregistrements ampérométrique fournissent des informations quantitatives sur les neurotransmetteurs montant expulsés d’événements unique exocytose et rapport sur la fréquence des phénomènes d’exocytose, mais ne présentent pas d’informations quantitatives sur les vésicules de sécrétion contenu avant la fusion des vésicules et la libération des neurotransmetteurs a été lancé.
Par conséquent, pour obtenir une meilleure compréhension de comment sécrétoires vésicules dans la cellule cytoplasme répondre au stress osmotique extracellulaire avant que la cellule est activée pour subir une exocytose, autres méthodes analytiques complémentaires peuvent servir à enrichir ces informations. Par exemple, afin de déterminer si le stress osmotique modifie le volume de la vésicule, microscopie électronique à transmission (TEM) analyse d’imagerie peut servir à mesurer la taille de la vésicule des cellules après fixation chimique. Pour examiner si un stress osmotique affecte la vésicule taille quantique, une technique ampérométrique développée récemment appelée intracellulaire électrochimique cytométrie en flux, peut être appliqué pour la quantification du contenu de neurotransmetteur vésicule en vésicules sécrétrices dans leur état natif alors résident encore dans le cytoplasme des cellules vivantes,26. Dans la technique de cytométrie électrochimique intracellulaire, une électrode cylindrique en fibre de carbone de NANOPOINTES est délicatement insérée dans le cytoplasme de cellules vivantes et, en appliquant un potentiel de mV + 700 à cette électrode (électrode de référence vs un Ag/AgCl), la la teneur en catécholamines dans les vésicules peut être quantifiée par la détection d’un dopage actuel redox des vésicules simples collision, adsorbant et par la suite stochastique une rupture à la surface de l’électrode et libérant ainsi leur contenu contre la électrode de surface26. Ainsi, dans l’ampérométrique actuel contre trace temporelle, chaque événement rompre seule vésicule peut entraîner un courant transitoire et, en intégrant le domaine de chaque épi actuel, la taille quantique de la vésicule peut être calculée à l’aide de Faraday´s Loi.
Par conséquent, en liant l’information quantitative tirée des mesures de taille de vésicule TEM imagerie ainsi qu’analyse de vésicules de taille quantiques, tel qu’enregistré par cytométrie de flux électrochimique intracellulaire, concentration de neurotransmetteur vésicule peut également être déterminée. Cela permet la caractérisation de la vésicule quand les cellules sont exposées à diverses conditions osmotiques et offre une meilleure vue sur comment les vésicules peuvent répondre au stress osmotique extracellulaire au stade avant l’exocytose. Les résultats de la combinaison de ces méthodes ont montré qu’en présence d’une pression osmotique élevée extracellulaire vésicules rétrécissement et ajuster leur taille quantique et en comparant les informations quantitatives sur les variations relatives de ces mesures montre que tout en réduisant, vésicules ajuster leur contenu et les dimensions pour maintenir une concentration de neurotransmetteur constante24. Ainsi, cette compréhension est précieuse en mettant avec les observations faites sur la libération des neurotransmetteurs dans les cellules exposées à un stress osmotique. Dans ces protocoles, nous décrivons l’utilisation de ces trois méthodes complémentaires permettant la caractérisation des vésicules de sécrétion comment dans leur environnement natif de répondre à l’osmolalité extracellulaire et les effets de cette réponse sur l’exocytose processus. En plus de nos observations précédentes concernant l’effet de la pression osmotique élevée sur exocytose24, nous présentons des expériences supplémentaires qui décrivent des cellules après un choc osmotique et l’effet de multiples stimulations de baryum dans chromaffines cellules.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2670</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase P</td><td>Roche, Suède</td><td>11 213 857 001</td><td></td></tr><tr><td>100-&micro ; M Nylon mesh</td><td>Fisher Sientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1677</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV plat en plastique de 60 mm revêtu</td><td>de collagène VWR</td><td>354416</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Avanti J-20XP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillaire en verre borosilicaté</td><td>Sutter instrument Co., Novato, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Narishing Inc., Japon</td><td>PE-21</td><td></td></tr><tr><td>Solutions époxy (A et B)</td><td>Technologie époxy, Billerica, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beveller</td><td>Narishing Inc.</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp Instrument</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Burleigh Instrument Inc., USA</td><td>PCS-5000</td><td></td></tr><tr><td>Butane Flame</td><td>Multiflame AB, H&auml ; sselholm, Suède</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopie électronique à transmission</td><td>Omega</td><td>Leo 912 AB</td><td></td></tr></tbody></table>

surveiller l’effet du stress osmotique sur les vésicules de sécrétion et exocytose

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Ampérométrie enregistrement des cellules soumises à un choc osmotique Voir la répondant par les cellules sécrétrices à ce stress physique en réduisant l’activité de l’exocytose et la quantité de neurotransmetteur libéré des vésicules dans les événements de l’exocytose unique. Il a été suggéré que la réduction des neurotransmetteurs expulsés est en raison de modifications dans les propriétés biophysiques de la membrane lorsque les cellules se rétrécissement en réponse au stress osmotique et hypothèses que sécrétoires vésicules dans le cytoplasme de la cellule ne sont pas affectés par le stress osmotique extracellulaire. Ampérométrie enregistrement d’exocytose surveille ce qui est libéré des cellules du moment une vésicule fusionne avec la membrane plasmique, mais ne fournit pas d’informations sur le contenu de la vésicule avant la fusion des vésicules est déclenchée. Par conséquent, en combinant ampérométrie enregistrement avec d’autres méthodes analytiques complémentaires qui sont capables de caractériser les vésicules sécrétrices avant l’exocytose à cellules est déclenchée offre un aperçu plus large pour l’examen des vésicules sécrétrices comment et la processus d’exocytose sont affectés par choc osmotique. Nous décrivons ici comment compléter ampérométrie enregistrement intracellulaire cytometry électrochimique et imagerie de microscopie électronique (met) de transmission peut être utilisé pour caractériser les modifications dans le contenu de taille et de neurotransmetteur des vésicules sécrétrices à cellules chromaffines par rapport aux activités de l’exocytose avant et après exposition à un stress osmotique. En liant l’information quantitative tirée des expériences utilisant les trois méthodes d’analyses, conclusions apportées précédemment que les vésicules sécrétrices réagissent au stress osmotique extracellulaire en diminution en taille et en réduisant la taille quantiques de vésicules à maintenir une concentration de neurotransmetteur vésicule constant. Par conséquent, ce qui donne quelques précisions au sujet de pourquoi les vésicules, en réponse au stress osmotique, réduisent les neurotransmetteurs montant libérés au cours de la libération de l’exocytose. Les enregistrements ampérométrique ici indiquent que c’est un processus réversible et que la vésicule après un choc osmotique sont remplis avec les neurotransmetteurs lorsque les cellules placées sont revenues dans un milieu isotonique.

Nous décrivons ici le protocole car comment combinant l’imagerie TEM ainsi que deux méthodes électrochimiques, ampérométrie en fibre de carbone et intracellulaire cytometry électrochimique, peut fournir des informations qui acquiert une vision plus large, faisant allusion à l’effet de pression osmotique extracellulaire sur les vésicules de sécrétion et le processus d’exocytose. En comparant les enregistrements ampérométrie représentatif de relâchement de l’exocytose à cellules chromaffines simples utilisant l’expérimenta...

Le stress osmotique affecte exocytose et la quantité de neurotransmetteur libéré au cours de ce processus. Nous démontrons comment combinant méthodes électrochimiques ainsi que de la microscopie électronique peut être utilisé pour étudier l’effet de la pression osmotique extracellulaire sur l’activité de l’exocytose, la vésicule quantique taille et la quantité de neurotransmetteur libéré au cours de l’exocytose.

Surveiller l’effet du Stress osmotique sur les vésicules de sécrétion et exocytose

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

L’objectif global de cette méthodologie analytique combinée est de fournir des informations sur la façon dont les vésicules sécrétoires dans les cellules réagissent à une force physique, telle que la pression osmotique extracellulaire, et comment les ajustements de ces organites affectent davantage le processus d’exocytose. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que : comment les vésicules sécrétoires réagissent-elles directement aux changements de l’environnement extracellulaire ou au traitement médicamenteux ? Le principal avantage de cette approche est de surveiller les effets directs sur le contenu vésiculaire des cellules vivantes et de savoir distinguer l’altération de leur libération chimique avant et après le traitement de l’exocytose.Pour obtenir une surface d’électrode à disque plat, placez l’électrode dans le support d’un microbroyeur et biseautez chaque électrode en fibre de carbone à un angle de 45 degrés. Ensuite, marquez le capillaire pour référence future sur la façon de localiser la surface de l’électrode du disque à un angle de 45 degrés lorsque vous placez l’électrode près des cellules pour la mesure de

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Cette vidéo montre une technique pour visualiser l’exocytose dans les mastocytes. Les cellules sont incubées avec du FITC-dextran – un rapporteur fluorescent – qui est absorbé par les cellules à l’intérieur des granules sécrétoires (SG), où le pH acide éteint sa fluorescence. Lors de la stimulation de l'exocytose granulaire, le pH plus élevé du milieu induit une fluorescence rapporteure à l'intérieur des SG fusionnés, qui est visualisée à l'aide d'un microscope à fluorescence.

Une technique in vitro pour visualiser l’exocytose des granules sécrétoires dans les mastocytes

Deux méthodes complémentaires basées sur la cytométrie en flux et la microscopie sont présentées qui permettent la quantification, au niveau de la cellule unique, de la dynamique de l'expression génique induits par l'activation d'une voie de MAPK dans la levure.

Quantification temporelle d&#39;expression MAPK induite en simples cellules de levure

Cet article propose une méthode pour étudier la dynamique des vésicules de neurotransmetteurs dans les cellules de neuroblastome, à l’aide d’une construction synaptobrevin2-pHluorin et de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale. La stratégie développée pour le traitement d’images et l’analyse des données est également rapportée.

TIRFM et GFP-sondes sensibles au pH pour l&#39;évaluation des vésicules de neurotransmetteur Dynamics dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données

L'objectif du présent Protocole est de développer une méthode qui permettra aux analyses de génomique fonctionnelle de la sécrétion des mastocytes. Le protocole est basé sur l'évaluation quantitative de la libération d'un gène rapporteur fluorescent cotrasfected avec le gène d'intérêt et des analyses en temps réel de la morphologie du granule sécrétoire.

Enquête mât cellules sécrétoires granulés; de biosynthèse d&#39;exocytose

Endocytose Vésicule synaptique est détectée par microscopie de pHluorin fusionnée avec des protéines de la vésicule synaptique et par microscopie électronique de l’absorption de la vésicule.

Mesurer l’endocytose de la vésicule synaptique dans des neurones Hippocampal cultivés

Nous présentons une technique de micromanipulation sans contact de vésicules, avec des gradients d’ion calcium localisée. La microinjection d’une solution d’ion calcium, à proximité d’une vésicule lipidique géant, est utilisée pour remodeler la membrane lipidique, aboutissent à l’obtention de protubérances tubulaires de membrane.

Remodelage de membrane de vésicules géants en réponse aux Gradients d’Ion Calcium localisée

Ici nous détailler une méthode d’imagerie de cellules vivantes d’exocytose régulée. Cette méthode utilise la FITC-dextran, qui s’accumule dans les organites liés lysosome, comme journaliste. Cette méthode simple permet également de faire la distinction entre les différents modes d’exocytose régulée dans les cellules qui sont difficiles à manipuler génétiquement.

L’imagerie FITC-dextran comme Reporter pour l’exocytose régulée

L’imagerie en direct de l’exocytose lysosomale sur les cellules micropatternées permet une quantification spatiale de ce processus. La normalisation de la morphologie à l’aide de micropatterns est un outil exceptionnel pour découvrir des règles générales sur la distribution spatiale des processus cellulaires.

Quantification des paramètres spatiotemporal de l’exocytose cellulaire dans les cellules micropatternées

Nous avons développé un logiciel de vision par ordinateur automatisé pour détecter les événements exocytaires marqués par des sondes fluorescentes sensibles au pH. Ici, nous démontrons l’utilisation d’une interface utilisateur graphique et de RStudio pour détecter les événements de fusion, analyser et afficher les paramètres spatio-temporels de la fusion et classer les événements en modes de fusion distincts.

Détection et analyse automatisées de l’exocytose

Cet article décrit les procédures pour la préparation de coupes d'hippocampe de rats et de souris transgéniques pour l'étude des altérations synaptiques associés au vieillissement du cerveau et liée à l'âge des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer.

Préparation des coupes d&#39;hippocampe aiguë chez des rats et des souris transgéniques pour l&#39;étude des altérations synaptiques au cours du vieillissement et de l&#39;amylose pathologie

Découvrez comment surveiller l'effet du stress osmotique sur les vésicules de sécrétion et l'exocytose en utilisant des cellules chromaffines et des enregistrements ampérométriques. Cette méthode permet d'analyser la libération de neurotransmetteurs en temps réel.

Surveiller l’effet du Stress osmotique sur les vésicules de sécrétion et exocytose

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