Caractérisation des Extensions de la Membrane cellulaire et d’étudier leur rôle dans le Cancer Cell Adhesion dynamique

L’objectif global est de déterminer l’effet des altérations expérimentales sur le répertoire d’extension cellulaire et comment il est lié à la fonction d’adhésion cellulaire dans le cancer. Cette méthode peut aider à identifier les rôles clés du répertoire d’extension de la membrane cellulaire dans la modulation du comportement cellulaire tel que l’adhésion, la motilité et l’invasion cellulaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est relativement simple à réaliser et qu’elle peut être facilement adaptée à diverses conditions expérimentales.

Les implications de cette technique s’étendent à notre thérapie ou à notre diagnostic de cancers localement avancés ou métastatiques, car elle aide à quantifier avec précision les changements dans le répertoire d’extension cellulaire associés aux altérations des cellules tumorales dans les capacités adhésives et invasives. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que la régulation des canaux ioniques, qui est connu pour jouer un rôle important dans la formation de l’extension cellulaire et les processus physiologiques normaux. La démonstration visuelle et l’enregistrement de cette méthode sont essentiels, car le comptage des étapes d’extension cellulaire est difficile à apprendre en raison des subtilités de leur apparence parfois.

Un jour avant l’imagerie, comptez les cellules SW 13, SW Neo et SW DKK3 cultivées dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à l’aide d’un hémocytomètre. Placez les lamelles de verre stériles dans des puits individuels de trois plaques à six puits. Utilisez une plaque distincte pour chaque lignée cellulaire et plaquez les trois lignées cellulaires à une densité de 5 000 cellules par puits dans ces six plaques de puits.

Placez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius et à cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le lendemain, de chaque puits aspirez le milieu de croissance. Ensuite, lavez les cellules dans un millilitre de PBS chaud.

Par la suite, ajoutez un millilitre de formaldéhyde à 3,7 % dans chaque puits pour fixer les cellules. Laissez les cellules dans le fixateur pendant 10 minutes. Une fois la fixation terminée, aspirez le formaldéhyde.

Ajoutez un millilitre de violet cristallin à 0,05 % dans chaque puits pour colorer les cellules pendant 30 minutes. Ensuite, éliminez l’excès de tache en lavant les cellules avec un millilitre d’eau déminéralisée par puits trois fois. Ensuite, placez une goutte de réactif de montage transparent sur une lame de verre étiquetée.

Ensuite, à l’aide d’une pince à pointe fine, récupérez délicatement les lamelles et placez-les face vers le bas sur les réactifs de montage. Après avoir monté toutes les lamelles colorées sur des lames, choisissez au microscope optique 20 vues aléatoires de cellules qui ne se chevauchent pas dans chaque lamelle. Prenez des micrographies photo d’un grossissement de 400 pour chaque champ de vision.

Ensuite, observez et comptez le nombre de types d’extension dans chacune des 20 cellules représentatives. Utilisez les définitions et le protocole textuel pour guider votre classification de l’extension membranaire en filopodie, lobopodia ou lamellipodie. Lorsque vous comptez pour la première fois les types d’extension de cellule, il peut être utile de garder une image de référence à disposition pour examen.

Si possible, le comptage à l’aveugle par rapport à leurs échantillons expérimentaux fournira une objectivité supplémentaire. Déterminer le nombre moyen d’extensions de chaque type par cellule dans chacune des trois lignées cellulaires examinées. L’utilisation de l’anova à un facteur pour tester la différence dans le pourcentage moyen d’extensions de la membrane cellulaire entre les différents types de cellules est statistiquement significative.

La veille du dosage, à l’aide d’un hémocytomètre, comptage des cellules SW 13, SW Neo et SW DKK3. Plaquez ces cellules à une densité de 100 000 cellules par puits dans six plaques de puits à l’aide d’une plaque pour chacun des six points temporels désignés qui seront testés. Placez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius et à cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant la nuit.

Le lendemain, retirez la plaque de l’incubateur et lavez les cellules une fois avec du PBS chaud. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de solution de dissociation cellulaire non enzymatique à concentration unique dans chaque puits. Tournez doucement les plaques pour même étaler la solution ajoutée.

Incuber les plaques avec la solution pendant des temps définis. Aspirez la plaque désignée à la fin de chaque point de temps. Peu de temps après chaque aspiration, lavez les cellules avec un millilitre de PBS chaud.

Tapotez ensuite doucement la plaque pour détacher les cellules mal fixées. Répétez le lavage en même temps que le tapotement intermittent deux fois de plus. Enfin, aspirez tout PBS restant et fixez les cellules qui sont restées dans la plaque avec un millilitre de formaldéhyde à 3,7 %.

Une fois la fixation terminée, aspirez le formaldéhyde. Ensuite, ajoutez un millilitre de violet cristallin à 0,05 % dans chaque puits pour colorer les cellules. Une fois la coloration terminée, éliminez l’excès de teinture en lavant les cellules avec un millilitre d’eau déminéralisée par puits trois fois.

À l’aide d’un microscope optique à un grossissement de 100, comptez les cellules restantes dans chaque puits pour chaque plaque. Déterminez ensuite le pourcentage de cellules qui sont restées détachées pendant les différents points temporels pour les trois lignées cellulaires testées. À l’aide d’une anova à deux facteurs, le test des différences et des taux de détachement cellulaire entre les trois lignées cellulaires est statistiquement significatif.

Les cellules de contrôle SW 13 et SW Neo colorées en violet cristallin ont formé principalement des filopodes et des lamellipodes. En revanche, les cellules exprimant DKK3 ont formé plus de lobopodia avec une absence presque totale de lamellipodes et très peu de filopodes. Notez également les différences de polarité entre les cellules exprimant DKK3 et les lignées cellulaires témoins.

Le graphique montre la proportion de différentes extensions cellulaires dans les trois lignées cellulaires testées. Notez la proportion significativement plus élevée de lobopodes dans les cellules exprimant DKK3. Les graphiques linéaires montrent le pourcentage de cellules qui sont restées attachées à la plaque après le traitement avec la solution de dissociation pour les points temporels indiqués dans l’axe des X.

À tous les points de temps jusqu’à 10 minutes, les cellules exprimant DKK3 ont montré une force d’attachement cellulaire significativement plus élevée par rapport aux cellules témoins. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée dans une période d’un à deux jours selon votre configuration expérimentale si elle est réalisée correctement. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’évaluer comment les changements dans la morphologie de l’extension cellulaire affectent la capacité adhésive.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier avec précision les extensions cellulaires en relation avec les changements dans les caractéristiques d’adhésion des cellules cancéreuses. Bonne chance et merci d’avoir regardé.