Détection visuelle de plusieurs acides nucléiques dans une gamme capillaire

L’objectif global de cette procédure est de fabriquer une petite cassette prête à l’emploi qui peut être utilisée pour la détection visuelle de plusieurs acides nucléiques en un seul test facile à utiliser. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la détection multiplex des acides nucléiques, telles que les organismes génétiquement modifiés ou la détection d’OGM. Pour nettoyer les capillaires, enfilez un uniforme de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants de protection chimique.

Placez les capillaires dans un bécher. Nettoyez les capillaires avec 30 millilitres d’acétone pendant cinq minutes pour éliminer les matières organiques. Et ensuite, lavez les capillaires avec de l’eau déminéralisée.

Ensuite, préparez la solution de piranha en versant une dizaine de millilitres de peroxyde d’hydrogène dans le bécher. Ensuite, ajoutez 30 millilitres d’acide sulfurique dans le peroxyde d’hydrogène en secouant lentement pour éviter la surchauffe. Assurez-vous que la solution recouvre complètement les capillaires pendant au moins 30 minutes.

Ensuite, lavez la solution de piranha avec une grande quantité d’eau. Lavez les capillaires avec de l’éthanol et de l’eau déminéralisée pendant cinq minutes chacun. Faites sécher les capillaires dans une étuve de séchage.

Ensuite, pesez les réactifs de base et d’engrenage PDMS dans un rapport de un pour un dans un tube de 50 millilitres. En règle générale, mélangez cinq grammes de base d’élastomère avec cinq grammes d’agent de durcissement en élastomère. Remuez soigneusement le mélange pendant environ cinq minutes avec une tige de verre.

Placez le bécher avec le PDMS dans un bocal à cloche sous vide pendant trente minutes pour le dégazage. Ensuite, versez lentement le PDMS dans le cylindre du moule en acier inoxydable. Laissez le PDMS durcir pendant trois heures dans une étuve de séchage à 60 degrés Celsius.

Après durcissement du PDMS, retirez le moule en tirant le moule avec du cylindar. Retirez le PDMS du cylindre en coupant le bord du moule à l’aide d’un scalpel. Lavez le PDMS trois fois avec de l’éthanol et de l’eau déminéralisée.

Ensuite, séchez le support PDMS avec de l’azote. Traitez la surface inférieure du support PDMS pour qu’elle soit hydrophobe en trempant le support PDMS dans une couche super hydrophobe pendant une seconde. Ensuite, séchez-le pendant dix minutes à température ambiante.

Ensuite, insérez les capillaires de quatre millimètres nettoyés dans les trous du support PDMS, en laissant zéro virgule cinq millimètres des capillaires à l’extérieur de la surface supérieure du support PDMS. Assurez-vous que les extrémités des capillaires sont au même niveau. Pour traiter la surface externe des capillaires et la surface supérieure du support PDMS pour qu’elles soient hydrophobes, ajoutez 15 microlitres de la couche super hydrophobe sur la surface du support PDMS.

Faites sécher à l’air libre le réseau capillaire modifié super hydrophobe. Ensuite, ajoutez un point six microlitres du mélange de fixation d’amorce d’un ensemble d’amorces pour remplir un capillaire correspondant du réseau capillaire selon un ordre préconçu. Ancrez le réseau dans un puits transparent d’une plaque standard à fond plat de 96 puits et séchez le réseau à 60 degrés Celsius pendant au moins deux heures.

Pour assembler la cassette, placez un adaptateur de chargement sur le dessus du réseau ancré. Assurez-vous que la parabole de l’adaptateur ne couvre que les parties exposées des dix capillaires. Pour préparer le mélange réactionnel LAMP, ajoutez des réactifs au mélange conformément au protocole textuel et agitez le mélange réactionnel pendant cinq secondes après l’ajout de la calcine.

Retournez doucement le tube vingt fois après l’ajout de la Bst polymérase. Les traces d’ADN qui existent dans l’environnement peuvent être éliminées en nettoyant plus tôt avec une mole par litre d’acide chlorhydrique avant de remettre le mélange LAMP. Aspirez 20 microlitres du mélange réactionnel LAMP avec un embout standard de 100 microlitres.

Insérez l’embout dans l’entrée de l’adaptateur de chargement pour le verrouiller. Injectez doucement le mélange réactionnel dans le plat de l’adaptateur. Le mélange réactionnel remplira rapidement le bol, puis chargera automatiquement les capillaires par la force capillaire.

Retirez l’adaptateur avec l’embout de verrouillage et scellez le puits à l’aide d’un film d’étanchéité transparent compatible PCR. Ensuite, incubez le réseau capillaire dans un incubateur à 63 degrés Celsius pendant une heure. Pour acquérir des images de l’émission de fluorescence, utilisez une lampe de poche UV pour exciter la calcine dissociée afin d’émettre de la fluorescence.

Capturez des images du haut du réseau capillaire à l’aide d’un appareil photo numérique ou d’un téléphone intelligent. Lorsque vous prenez une image, assurez-vous que la caméra zoome autant que possible sur la zone des capillaires pour obtenir des images claires et de haute qualité. Ensuite, ouvrez l’image à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.

Ensuite, sélectionnez image, moule, niveaux de gris, oui et image, moule, 16 bits, oui. Sélectionnez fichier, enregistrer sous, format, TIFF, pour convertir l’image au format TIFF 16 bits. Pour extraire la valeur de l’intensité de fluorescence, ouvrez le logiciel d’analyse de microarray.

Faites glisser l’image au format TIFF 16 bits dans l’interface du logiciel, puis sélectionnez la longueur d’onde de 532 nanomètres et une couleur verte pour afficher l’image. Ensuite, créez un nouveau bloc pour localiser le signal de fluorescence des capillaires. Sélectionnez des outils, de nouveaux blocs, puis placez le nombre de colonnes et de lignes en tant que un à un et deux à cinq dans les interfaces de blocs et de fonctionnalités séparément.

Faites un clic droit et sélectionnez le modèle de fonctionnalités. Ensuite, ajustez l’emplacement et le diamètre pour s’adapter à la zone de fluorescence des capillaires. Sélectionnez Analyser pour extraire la valeur de l’intensité de fluorescence.

Enfin, sélectionnez fichier, enregistrer les paramètres sous, pour enregistrer les documents du bloc. Ensuite, sélectionnez, classez, enregistrez les résultats pour enregistrer les résultats de l’intensité de fluorescence. Voici la disposition du réseau capillaire.

Capillaires un à huit, préfixés par des jeux d’amorces LAMP. Les capillaires neuf et dix représentent deux, aucun contrôle d’amorce. Voici la photographie fluorescente pour la détection du maïs génétiquement modifié, MON863, où la couleur verte représente l’amplification positive de la LAMP.

Amplification réussie, présentée uniquement dans les capillaires attendus un, six, sept et huit, sans contamination parmi les capillaires vierges. Cette photographie fluorescente est destinée à la détection du mélange d’OGM. La couleur verte présentait l’amplification positive de la LAMP.

L’amplification réussie n’a été présentée que dans les capillaires attendus un, quatre, cinq, six, sept et huit sans contamination parmi les capillaires vierges. La photographie fluorescente montrée ici concerne la détection de maïs non génétiquement modifié, la couleur verte présentant l’amplification positive du PAL. Amplification réussie uniquement présentée dans le huit capillaire attendu, et sans contamination parmi les capillaires vierges.

Une fois maîtrisée, cette procédure de détection peut être effectuée en un point cinq heures si elle est effectuée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication d’une cassette capillaire pour effectuer la détection de plusieurs acides nucléiques.