Immobilisation dirigée de protéine morphogénétique osseuse 2 aux Surfaces solides par Click Chemistry

L’objectif global de cette étude est la production robuste et reproductible d’un échafaudage ostéogénique par couplage dirigé et covalent d’une variante BMP2 nouvellement conçue par chimie click. Cette méthode peut aider à surmonter les problèmes liés aux techniques couramment utilisées pour le traitement de la non-cicatrisation des défauts des os longs. Les méthodes d’absorption ou d’encapsulation nécessitent des quantités super physiologiques de BMP2 qui provoquent plusieurs effets secondaires graves.

Le principal avantage de cette technique est d’utiliser des quantités plus faibles de la nouvelle variante BMP2 liée de manière covalente aux échafaudages de manière dirigée latéralement. Propager une seule colonie pendant la nuit dans 50 millilitres de milieu LB avec 50 microgrammes par millilitre de kanamycine et 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline à 37 degrés Celsius. Diluez les cultures de nuit de un à 20 dans 800 millilitres d’un excellent milieu de bouillon complété par 50 microgrammes par millilitre de kanamycine et 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline.

Cultivez les cultures à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’une densité optique de 600 nanomètres de 0,7 soit atteinte. Ajoutez ensuite le propofol L-Lycine à une concentration finale de 10 millimolaires. Induire l’expression génique par l’ajout d’IPTG pour une concentration finale d’un millimolaire.

Cultivez la culture à 37 degrés Celsius pendant 16 heures dans un agitateur orbital à 180 tr/min. Après l’incubation, centrifuger toute la culture à 9 000 fois g pendant 30 minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille bactérienne dans 30 millilitres de tampon TBSE.

Pesez un bécher centrifuge vide et transférez la pastille remise en suspension dans le bécher vide. Ensuite, centrifugez la pastille remise en suspension à 6, 360 fois g pendant 20 minutes. Jetez le surnageant et pesez le bécher avec la pastille.

Soustrayez le poids du bécher vide pour calculer le poids de la pastille. Ensuite, remettez le granulé en suspension dans le tampon STE. Utilisez 200 millilitres de tampon STE pour 10 grammes de granulés.

Soniquer la suspension sur de la glace avant de centrifuger à 6, 360 fois g pendant 20 minutes. Jetez le surnageant et pesez la pastille. Après avoir répété quatre fois les étapes de sonication et de centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 100 millilitres de tampon TBS.

Centrifuger à 6, 360 fois g pendant 20 minutes. Ensuite, jetez le surnageant et pesez la pastille. Remettez le granulé en suspension dans un tampon de nucléases avec des nucléases fraîchement ajoutées en utilisant 10 millilitres par gramme de granulé.

Incuber la suspension une nuit à température ambiante sur une plaque d’agitation à 30 tr/min. Le lendemain, ajoutez Triton Buffer à la suspension. Le volume de Triton Buffer à ajouter correspond à une partie de volume de 0,5 de la suspension.

Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, centrifuger la suspension à 6, 360 fois g pendant 20 minutes. Jetez le surnageant et pesez la pastille. Ensuite, mettez le granulé en suspension dans TE Buffer en utilisant huit millilitres par gramme de granulé.

Après la centrifugation comme précédemment, jetez le surnageant et pesez la pastille. Maintenant, remettez la pastille en suspension en ajoutant quatre millilitres par gramme d’acitate de sodium 25 millimolaires, PH5, et cinq millilitres par gramme de chlorure de guanidinium à six molaires avec un DTT millimolaire. Incuber la suspension pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur une plaque d’agitation.

Après une centrifugation à 75 500 fois g pendant 20 minutes, le surnageant contient la protéine BMP2 monomère dépliée. Recueillir le surnageant et concentrer cet extrait à une densité optique par millilitre de 20 à l’aide d’une membrane de coupure de poids moléculaire de trois kilodaltons dans une cellule de concentration. Ajouter les monomères concentrés en gouttes simples dans le tampon de renaturation tout en remuant.

Ensuite, incubez la solution à température ambiante pendant 120 heures dans l’obscurité. Ajustez le pH de la solution à 3,0 à l’aide d’acide chlorhydrique concentré avant de dialyser la solution contre un acide chlorhydrique millimolaire. Concentrer la solution dialysée à l’aide d’une membrane de coupure de poids moléculaire de 10 kilodaltons dans une cellule de concentration.

Ensuite, chargez la solution protéique sur la colonne équilibrée, diluez les fractions à l’aide d’un gradient linéaire de tampon B, en recueillant deux fractions millimétriques. Analyser 20 microlitres de chaque fraction par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS suivie d’une coloration au bleu brillant de Coomassie pour déterminer les fractions contenant des monomères et les fractions contenant des dimères. Ensuite, tirez le dimère contenant des fractions.

Dialysez la flaque de dimères contenant des fractions pendant la nuit à quatre degrés Celsius contre cinq litres d’acide chlorhydrique millimolaire. Concentrez le produit à l’aide d’une unité de filtration centrifuge concentratrice de 10 kilodaltons avant d’analyser le produit final par coloration SDS-PAGE et Coomassie Brilliant Blue. Combinez 20 micromolaires de type BMP2-K3Plk ou BMP2-while qui est utilisé comme contrôle négatif avec 20 microlitres de billes d’agarose activées par l’azoture dans un tampon de réaction à un volume total de 500 microlitres.

Incuber pendant deux heures à température ambiante sur un mélange rotatif à 20 tr/min. Arrêtez la réaction en ajoutant une concentration finale de cinq millimolaires d’EDTA. Incuber la solution à température ambiante pendant 15 minutes sur un mélangeur rotatif à 20 tr/min.

Ensuite, centrifugez les échantillons à 20 000 fois g pendant une minute à température ambiante et collectez les surnageants. Lavez ensuite le granulé contenant les billes avec 1 000 microlitres de tampon HBS 500. Centrifugez l’échantillon à 20 000 fois g pendant une minute à température ambiante et prélevez le surnageant.

Répétez cette procédure de lavage deux fois de plus avec le tampon HBS 500, trois fois avec du chlorure de magnésium à quatre molaires et deux fois avec du PBS, en recueillant le surnageant à chaque fois. Stockez les billes couplées dans 1 000 microlitres de PBS à quatre degrés Celsius. Effectuez le test ALP comme décrit dans le protocole texte.

Pour effectuer la coloration ALP, cultivez des cellules promyoblastiques C2C12 dans du DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal ainsi que 100 unités par millilitre de pénicilline G et de streptomycine à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée à 5 % de dioxyde de carbone. Alimentez des cellules C2C12 à une densité de 30 000 cellules par puits dans une microplaque de 96 puits. Après avoir laissé les cellules se fixer pendant la nuit, retirez le milieu et ajoutez 20 microlitres par puits de billes couplées PMB2-K3PLK.

Ajoutez ensuite 20 microlitres d’agarose à 0,4 % à bas point de fusion dans chaque puits. Centrifugez la microplaque à 96 puits à 2 000 fois g pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius. Ajoutez ensuite 80 microlitres du même milieu.

Incuber à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée à 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Après l’incubation, retirer le milieu en prenant soin de ne pas détacher l’agarose solidifié à 0,4 %. Ajouter 100 microlitres par puits de solution sub-droite MBT-BCIP en une étape.

Analysez la coloration au phosphatidate alcalin à l’aide de la microscopie optique immédiatement après l’apparition de la coloration violette. Utilisez la microscopie à fond clair et prenez des photos. La bioactivité de la variante BMP2-K3Plk nouvellement produite est validée par l’induction de l’expression du gène de la phosphatase alcaline dans les cellules C2C12.

Le test in vitro montre des niveaux d’expression génique similaires de la phosphatase alcaline induits par le type BMP2 ou BMP2-K3Plk. Les billes enrobées de BMP2-K3Plk via l’ajout d’alcyne cyclo catalysé par l’azoture ont produit des fluorescents lorsqu’elles ont été incubées avec l’éco-domaine 1A du récepteur BMP démarqué. La liaison du récepteur BMP 1A à BMP2-K3Plk confirme la rétention de la bioactivité après couplage.

La bioactivité des billes fonctionnalisées BMP2-K3Plk a été prouvée par coloration médiée par ALP. La coloration ne s’est produite que dans les cellules qui étaient en contact direct avec les billes fonctionnalisées BMP2-K3Plk, confirmant que la protéine est effectivement liée de manière covalente aux billes et qu’elle n’est pas simplement absorbée. Si la protéine avait été libérée dans la situation absorbée, une coloration plus étalée à de plus grandes distances aurait été observée, comme on le voit ici pour la coloration à la phosphatase alcaline lors d’un traitement avec des BMP2-K2Plk solubles.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer et de produire des protéines biologiquement actives par expansion génétique et de la façon de coupler de manière covalente une protéine fictive à des microsphères par réaction chimique click. La génération de variance protéique par expansion génétique permet, en principe, l’introduction d’acides aminés artificiels à n’importe quelle position de la séquence protéique primaire. L’introduction d’une mutation dans la séquence BMP2 peut affecter l’efficacité du repliement et peut également modifier les paramètres de la protéine.

La production de BMP2-K3Plk a nécessité une modification de la méthode établie pour l’expression du type BMP2. Les BMP2-K3Plk produites ont montré une activité biologique comparable à celle de la protéine de type while. Notre approche de couplage covalent de la variante BMP2 à des billes d’agarose fictives azire par chimie clic a pu être réalisée avec une grande efficacité, aboutissant à des billes fictives, figurant une différenciation génétique in vitro.

Une protection standard selon les bonnes pratiques de laboratoire doit être assurée.