In Vitro Dosage de SUMOylation pour étudier l’activité de Ligase E3 SUMO

L’objectif global de cette expérience est de vérifier qu’une protéine d’intérêt peut être SUMOylée ou qu’il s’agit d’une lygase SUMO E3. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la SUMOylation, telles que l’identification de la lygase SUMO E3. Le principal avantage de cette technique est qu’elle pourrait être utilisée pour l’étude de la spécificité de la lygase SUMO E3 envers différentes formes iso SUMO.

Wan-Shan Young, un étudiant au doctorat de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour purifier l’étiquette K-bZIP, incubez d’abord 10 millilitres de lysat cellulaire avec 50 microlitres de billes magnétiques marquées d’anticorps dans un tube en polypropylène de 14 millilitres. Ensuite, faites tourner le tube à 50 tours par minute à quatre degrés Celsius pendant trois heures dans un mélangeur à suspension.

Une fois la protéine capturée, centrifugez l’échantillon à 800 fois g pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius pour granuler les billes. Jetez tout sauf un millilitre de surnageant pour remettre les billes en suspension. Et transférez les billes dissoutes dans un tube de 1,5 millilitre.

Pour laver les protéines capturées, placez le tube avec les billes sur un support magnétique. Attendez environ trois secondes que les billes adhèrent aux parois latérales du tube, puis retirez le surnageant. Pour laver les billes, ajoutez un millilitre de tampon de lyse dans le tube de 1,5 millilitre.

Ensuite, retournez le tube dix fois. Ensuite, placez le tube de 1,5 millilitre sur le support magnétique et retirez le surnageant une fois que les billes adhèrent aux parois. Pour laver à nouveau les billes, ajoutez un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate dans le tube de 1,5 millilitre et retournez-le dix fois.

Transférez ensuite le tube sur le support magnétique et retirez le surnageant une fois que les billes se sont fixées aux parois latérales. Pour éluer les protéines marquées K-bZIP des billes magnétiques marquées par anticorps, ajoutez 100 microlitres à 150 microgrammes par millilitre d’octapeptide dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate dans le tube de 1,5 millilitre. Faites ensuite tourner le tube sur un mélangeur à suspension à 50 tours par minute pendant dix minutes à température ambiante.

Transférez le tube sur le support magnétique. Et puis collectez le surnageant contenant le K-bZIP. Ensuite, pour analyser l’étiquette K-bZIP purifiée, soumettez un à cinq microlitres de la protéine purifiée à la page SDS, suivi d’une coloration au bleu de Coomassie.

Chargez 0,5, 1 et 2 microgrammes d’albumine sérique bovine comme étalons sur le gel pour quantifier la concentration de K-bZIP. Pendant le traitement de l’image sur l’image J.Next, diluez le K-bZIP purifié dans une solution saline tamponnée au phosphate. Atteindre une concentration finale de 100 nanogrammes par microlitre.

Et stockez-le à moins 80 degrés Celsius dans de petites aliquotes. Ajoutez trois microlitres de 100 nanogrammes par microlitre de K-bZIP purifié marqué dans la réaction de mélange maître de SUMOylation in vitro. Mélangez ensuite doucement le contenu du mélange principal et incubez à 30 degrés Celsius pendant trois heures.

Ensuite, ajoutez 20 microlitres de page SDS 2X avec tampon de chargement pour arrêter la réaction. Ensuite, chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour dénaturer la protéine. Ensuite, chargez 20 microlitres de l’échantillon sur un gel de page FDS à 10 %.

Et faites fonctionner le gel à 80 volts pendant environ 120 minutes jusqu’à ce que le colorant atteigne le fond du gel. Une fois l’électroparésie terminée, débranchez l’appareil à gel. Et transférez le gel dans un tampon de transfert semi-sec pendant cinq minutes.

Ensuite, faites tremper la membrane PVDF dans un autre récipient rempli de méthanol pendant une minute. Retirez la membrane PVDF du méthanol et trempez-la dans un tampon de transfert semi-sec. Ensuite, agitez doucement la membrane pendant cinq minutes.

Retirez le couvercle de sécurité de l’appareil électrophorétique semi-sec. Pré-mouillez un papier filtre. Et préparez un sandwich de gel au bas de l’anode en platine.

Après avoir fixé la plaque cathodique dans le couvercle de sécurité, faites fonctionner le transfert à courant constant de 15 volts pendant 90 minutes. Ensuite, coupez l’alimentation électrique et retirez la membrane PVDF après avoir débranché l’appareil semi-sec. Bloquez maintenant la membrane PVDF avec un tampon de blocage pendant une heure à température ambiante sur un agitateur orbital à 30 tours par minute.

Ensuite, hybridez la membrane PVDF avec un anticorps anti-p53 et un tampon de blocage pendant 12 à 16 heures à quatre degrés Celsius sur un mélangeur en suspension à 30 tours par minute. Retirez ensuite la membrane PVDF et transférez-la dans un récipient rempli de solution saline tamponnée Tris tween 20. Ensuite, trempez la membrane PVDF dans une solution saline tamponnée Tris tween 20 pendant 30 minutes sur l’agitateur orbital à 45 tours par minute.

Hybrider ensuite la membrane PVDF avec un anticorps anti-lapin conjugué à de la peroxydase de raifort diluée dans un tampon bloquant pendant une heure à température ambiante sur le mélangeur en suspension à 30 tours par minute. Ensuite, lavez trois fois la membrane PVDF avec une solution saline tamponnée Tris t. Après le lavage, trempez la membrane PVDF dans une solution saline tamponnée Tris tween 20 pendant 30 minutes sur le mélangeur à suspension à 45 tours par minute.

Remplacez ensuite la solution saline tamponnée au Tris tween 20 par une solution saline tamponnée au phosphate. Pour conserver la membrane PVDF à quatre degrés Celsius jusqu’à 12 heures. Ensuite, mélangez les réactifs de substrat chimiluminescents améliorés un et deux dans un rapport de un à un.

Retirez ensuite la membrane PVDF de la solution saline tamponnée au phosphate et épongez brièvement avec les poches de perforation pour absorber l’excès d’humidité. Ajoutez immédiatement 400 microlitres de réactif chimiluminescent à la surface de la membrane et attendez trois à cinq minutes. Épongez brièvement pour drainer l’excès de réactif chimiluminescent, empêchant la membrane de sécher complètement.

Utilisez le système d’imagerie de Luminescent pour exposer la tache. Ici, une analyse immuno-blot a été effectuée pour montrer la concentration de l’enzyme Ubc9 nécessaire pour SUMOyler les cibles p53. Cela montre que 1/2 et 1/5 de la concentration de l’enzyme Ubc9 peuvent suffire à SUMOylate p53 dans un test de SUMOylation in vitro utilisant les peptides SUMO 1 et SUMO 2.

Pour analyser le p53 SUMOylé, la membrane a été sondée avec un anticorps anti-p53. Une analyse immuno-blot similaire a été effectuée pour montrer que la moitié de la concentration E1 et 1/10 des enzymes Ubc9 sont nécessaires pour SUMOyler la cible p53 dans un test de SUMOylation in vitro utilisant les peptides SUMO 1, SUMO 2 et SUMO 3. Ici, la membrane a été colorée avec Coomassie pour montrer la protéine K-bZIP purifiée.

Le système d’expression du baculovirus a été utilisé pour exprimer le K-bZIP purifié qui a été analysé sur la page SDS avec de l’albumine sérique bovine comme étalon de comparaison. Une analyse immuno-blot supplémentaire a également été effectuée et a montré qu’en augmentant la concentration de K-bZIP, elle catalyse la SUMOylation de p53 en présence de la moitié de la quantité d’enzymes E1 et de 1/10 de la quantité d’enzymes Ubc9, respectivement. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de conserver tous les réactifs pour l’essai de SUMOylation in vitro sur de la glace et d’effectuer la dilution en série plutôt qu’en une seule dilution géante. Trouver cette procédure, d’autres méthodes comme la surexpression SUMOlygase peuvent être effectuées afin de vérifier la SUMOylation in vitro. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la SUMOylation pour explorer davantage de SUMOlygase et valider leur pouvoir de spécificité.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier un lygase SUMO e3 à l’aide d’un test de simulation in vitro.