Name: In Vitro Dosage de SUMOylation pour étudier l’activité de Ligase E3 SUMO (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Découvrez un protocole de SUMOylation in vitro modifié pour identifier de nouvelles ligases E3 SUMO et étudier leur spécificité envers différentes isoformes. Cette méthode permet de vérifier les protéines cibles et d'explorer les mécanismes de modification post-traductionnelle.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la ministère des sciences et de la technologie (MOST, 105-2320-B-010-007-MY3 au PCC), de l’Institut National de recherche en santé (INRH-EX105-10215BC au PCC), du ministère de la Science et technologie (plus 105-2314-B-400-019 à HJK) et de la National Health Research Institute (INRH MG-105-SP-10, INRH MG-106-SP-10 au HJK). Ce travail a été également soutenu en partie avec l’Université nationale Yang-Ming sur publication du manuscrit de PCC. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou réparation du manuscrit.

1. préparation des Baculovirus Expression constructions
<ol><li>
Purifier le SUMO E3 ligase K-bZIP en clonant l’ADNc de K-bZIP19 dans un vecteur de baculovirus expression double (voir Table des matières) avec une balise épitope N-terminale. Nous avons eu des succès à l’aide d’une balise de l’octapeptide (indiquée dans le protocole comme vecteur-tag-K-bZIP). Remarque : La matrice d’ADN pour le clonage de K-bZIP polymerase chain reaction (PCR) est cDNA reverse transcription de l’ARN isolé de cellules TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 suite de traitement doxycycline20.<ol>
<li>Transfert K-bZIP ADNc pleine longueur19 dans le vecteur d’expression double avec CpoI sites de clonage. CPO J’ai digérer le produit PCR et 1 µg du vecteur d’expression double à 37 ° C pendant 3 h21.</li>
		<li>Séparer et extraire l’ADN digéré après électrophorèse sur gel d’agarose 0,8 %22. Ligaturer l’insert (K-bZIP) et vector par T4 DNA ligase à 16 ° C, pendant 30 min selon les instructions du fabricant (voir Table des matières).</li>
		<li>Ajouter 5 µL de ligature ADN à 50 µL compétentes d' e. coli cellules « A » (voir Table des matières) dans un tube de 1,5 mL. Mettre sur la glace pendant 30 min. Puis, incuber le tube de 1,5 mL dans un bain d’eau de 42 ° C pour 45 s et mettre immédiatement le tube sur la glace pendant 3 min.</li>
		<li>Ajouter 600 µL de milieu O.S.C. (0,5 % (p/v) d’extrait de levure, 2 % (p/v) tryptone, 10 mM NaCl, KCl 2,5 mM, 20 mM MgSO4et 4 % (p/v) de glucose) dans le tube et incuber à 37 ° C pendant 1 h. Puis, centrifuger le tube à température ambiante pendant 3 min à 600 g.</li>
		<li>Retirer le surnageant, resuspendre le culot avec 60 µL de milieu Luria-Bertani (LB, 1 % (p/v) tryptone, 0,5 % (p/v) extrait de levure et 85 mM NaCl) et bien le répartir sur les boîtes de gélose LB contenant 100 ampicilline µg/mL. Incuber la gélose à 37 ° C pendant 16 h23,24.</li>
		<li>Sélectionnez 1 colonie d’inoculer dans le milieu LB de 5 mL contenant 100 µg/mL ampicilline et à la culture à 37 ° C pendant 16 h avec 250 tr/min secouant. Ensuite, extrayez le plasmide, vecteur-tag-K-bZIP, par un kit d’extraction de plasmide selon les instructions du fabricant (voir Table des matières).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Générer le bacmid recombinant contenant la balise-K-bZIP par transformation de la vector-tag-K-bZIP en compétent e. coli cellules « B » (voir Table des matières).
	<ol>
<li>Mélanger 0,2 µg vector-tag-K-bZIP plasmide et 100 µL compétente E. cellules de coli « B » dans un tube de 1,5 mL et le mettre sur glace pendant 30 min. Incuber le tube dans le bain-marie à 42 ° C pendant 45 s et mettre immédiatement le tube sur la glace pendant 3 min.</li>
		<li>Ajouter 900 µL de milieu O.S.C. dans le tube et incuber à 37 ° C pendant 4 h avec rotation à 50 tr/min. Ensuite, prenez 10 µL de milieu, ajouter une supplémentaire 50 µL de S.O.C moyen pour diffuser sur plaques de gélose LB contenant 50 kanamycine µg/mL, 7 gentamicine µg/mL, 10 µg/mL, substrat de galactosidase 100 µg/mL et à 40 µg/mL isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ) et incuber les boîtes pendant 48 h à 37 ° C.</li>
		<li>Ensemencer une colonie blanche dans le milieu LB de 5 mL contenant 50 µg/mL kanamycine, gentamicine 7 de µg/mL et 10 tétracycline µg/mL. Incuber à 37 ° C avec 250 tr/min, secouer pendant 16 h.</li>
		<li>Isoler la bacmid recombinant DNA contenant la balise-K-bZIP, quantifier et remettre en suspension à une concentration de 1 µg/µL25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Générer des baculovirus recombinants exprimant tag-K-bZIP par transfection 1 µg de bacmid recombinant DNA contenant la balise-K-bZIP en cellules Sf9 dans un puits d’une plaque de 6 puits.
	<ol>
<li>Graine 2 x 106 Sf9 cellules (voir Table des matières) dans un milieu de 2 mL Grace insecte fourni avec 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % de gentamicine dans chaque puits d’une plaque 6 puits, puis incuber à 27 ° C pendant 1 h.</li>
		<li>Maintenir une culture en phase journal des cellules Sf9 en milieu d’insecte de Grace fourni avec 10 % FBS, gentamicine 1 % et 1 % de détergent C (voir Table des matières) à 27 ° C en suspension orbitale à 140 tr/mn. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et le bleu trypan Coloration ; viabilité cellulaire devrait dépasser 95 %. Maintenir les cellules en utilisant un ratio de sous-culture de 1:3 tous les 2-3 jours (densité minimale ~0.5 x 106 cellules/mL).</li>
		<li>Ajouter 2 µL bacmid ADN (1 µg/µL) et 98 µL réduit médias de sérum (voir Table des matières) dans un tube de 2 mL. Puis, ajoutez 4 µL de réactif de transfection (voir Table des matières) pour le tube et bien mélanger. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes.</li>
		<li>Ajouter ce mélange de transfection (104 µL) dans chaque puits et incuber à 27 ° C pendant 12 à 16 h.</li>
		<li>Retirez les supports épuisés avec aspiration douce et remplacez par 2 mL d’insecte moyen frais Grace fourni avec 10 % de SVF et 1 % de gentamicine. Les cellules Sf9 adhèrent librement à la surface de la plaque et ne sera pas dérangés avec aspirant doucement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recueillir les baculovirus recombinant après transfection et amplifient les baculovirus pour obtenir des stocks de haut-titre (P1) pour d’autres expériences.
	<ol>
<li>72 h après avoir changé de support, gratter le Sf9 cellules à l’aide d’un poussoir de cellules stériles, recueillir le surnageant de chaque puit individuel dans un tube de 1,5 mL et vortexer pendant 10 s.</li>
		<li>Centrifuger à 4 ° C pendant 3 min à 150 x g. frais viré surnageant comme P0 baculovirus et partie aliquote dans des tubes de 1,5 mL (baculovirus 1 mL dans chaque tube). Conserver à-80 ° C.</li>
		<li>Cellules7 Sf9 graine 1 x 10 dans le milieu d’insecte de 10 mL Grace fourni avec 10 % de SVF et 1 % de gentamicine dans une boîte de Pétri de 10 cm et incuber à 27 ° C pendant 1 h.</li>
		<li>Pour l’amplification des baculovirus recombinant exprimant sa balise-K-bZIP, ajouter 0,5 mL de baculovirus P0 aux cellules Sf9 ensemencés et incuber à 27 ° C pendant 48 h.</li>
		<li>Recueillir le surnageant comme P1 baculovirus dans un tube de 15 mL et conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. purification du K-bZIP
<ol><li>Maintenir une culture en phase journal des cellules Sf9 en milieu d’insecte de Grace fourni avec 10 % FBS, gentamicine 1 % et 1 % de détergent C à 27 ° C en suspension orbitale à 140 tr/mn comme indiqué au point 1.3.2.</li>
	<li>Le jour de la transduction, ajouter 1 mL du surnageant contenant des baculovirus (P1) dans 250 mL de cellules Sf9 avec une densité de 2 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Incuber les cellules Sf9 pendant 72 h à 27 ° C dans un agitateur orbital avec 140 t/mn secouer, puis recueillir par centrifugation à 2 740 x g pendant 15 min à 4 ° C.</li>
	<li>Éliminer le surnageant et lyse granules cellulaires dans 10 mL de tampon de lyse (20 mM HEPES pH 7,9, 0,5 M de NaCl, 1 % de détergent un glycérol 2 % (voir Table des matières), inhibiteur de la protéase cocktail) et tourner à 50 tr/min à l’aide d’un mélangeur de suspension à 4 ° C pendant 30 min.</li>
	<li>Cellule de centrifugeuse lysat à 15 000 x g pendant 15 min recueillir le liquide surnageant.</li>
	<li>Pour purifier le tag-K-bZIP, incuber les lysats cellulaires (10 mL) avec 50 µL d’anticorps marqués des billes magnétiques dans des tubes en polypropylène 14 mL et faire tourner à 50 tr/min pendant 3 h à 4 ° C à l’aide d’un mélangeur de suspension. Après leur capture de protéine, pellet les perles en 800 x centrifugation g pendant 30 s à 4 ° C. Enlever la plupart du surnageant et remettre en suspension les perles dans le volume résiduel d’environ 1 mL transférer dans un tube de 1,5 mL pour le lavage.</li>
	<li>Lavez la protéine capturée en plaçant le tube contenant les perles sur un support magnétique et retirer le surnageant après que les billes magnétiques ont pleinement adhéré à la paroi du tube.</li>
	<li>
Laver les billes avec tampon de lyse quatre fois.
	<ol>
<li>Ajouter le tampon de lyse 1 mL dans des tubes de 1,5 mL, puis retournez les tubes 10 fois. Placer le tube de 1,5 mL sur un support magnétique et éliminer le surnageant comme indiqué au point 2.7.</li>
		<li>Répétez l’étape précédente, un autre 3 fois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Laver une fois les perles avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS).
	<ol>
<li>Ajouter 1 mL de PBS (137 mM NaCl, KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4 2,7 mM) dans des tubes de 1,5 mL, puis retournez les tubes 10 fois.</li>
		<li>Mettre le tuyau de 1,5 mL sur un support magnétique, puis enlever le surnageant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Éluer tag-K-bZIP protéine de billes magnétiques anticorps marqués en ajoutant 100 µL de l’octapeptide 150 µg/mL dilué dans du PBS dans un tube de 1,5 mL. Tourner le tube pendant 10 min à 50 tr/min par mixer de suspension à la température ambiante. Ensuite, replacez le tube sur le support magnétique et recueillir le surnageant contenant K-bZIP dans un tube propre 1,5 mL.</li>
	<li>Analyse 1-5 µL purifiée tag-K-bZIP protéine par SDS-PAGE, suivie de bleu de Coomassie26. Chargez 2 µg, 1 µg et 0,5 µg échantillons d’albumine sérique bovine (BSA) sur le même gel et utilisent pour quantifier avec un programme de traitement d’image, comme ImageJ. Estimation de la concentration de K-bZIP par comparaison aux normes BSA.</li>
	<li>Le K-bZIP purifiée est maintenant prêt à être utilisé dans chaque essai de SUMOylation. Diluer le K-bZIP dans du PBS à une concentration finale de 100 ng/µL et magasin en petites parties aliquotes à-80 ° C.</li>
</ol>3. SUMOylation Assay
<ol><li>Ajouter 3 µL de 100 ng/µL de tag-K-bZIP purifiée dans le mélange maître de chaque in vitro SUMOylation réaction. Composants en mélange maître contiennent 1 µL de tampon de protéines, 1 x tampon de SUMOylation, protéine de p53 0,5 µL (0,5 mg/mL), 25 nM de E1 activation enzymatique (conc. stock : 1 µM), 50 nM de E2 conjugaison (conc. stock : 10 µM) et 250 nM chacun des peptides SUMO (SUMO-1 , SUMO-2 ou SUMO-3 ; conc. stock : 5 µM) pour un volume final de 17 µL.</li>
	<li>Mélanger doucement et incuber la réaction à 30 ° C pendant 3 h. arrêter la réaction en ajoutant 20 µL de tampon de charge SDS-PAGE 2 (100 millimètres Tris-HCL pH 6,8, dodécylsulfate de sodium 4 %, 0,2 % (p/v) bleu de bromophénol, 20 % (v/v) de glycérol et 200 mM β-mercaptoéthanol) et dénaturer les échantillons à 95 ° C pendant 5 min.</li>
	<li>
Séparer les échantillons SDS-page, de transférer les protéines séparées sur une membrane en PVDF en utilisant un dispositif de transfert électrophorétique demi-sec et analyse par Western blot à l’aide d’anticorps anti-p53.
	<ol>
<li>Mettre en place l’appareil de gel comme à l’étape 2.11 et charger 20 µL de l’échantillon dans les puits du gel.</li>
		<li>Exécutez le gel de 10 % dans une constante courante à 80 V pour environ 120 min (jusqu'à ce que la bande de colorant atteigne le bas du gel). À l’issue de l’électrophorèse, couper l’alimentation.</li>
		<li>Débranchez l’appareil gel et gel de cassettes pour sortir le gel et flotter le gel dans le tampon de transfert semi-sec (48 mM Tris-HCl, glycine de 39 mM, méthanol 20 %) pendant 5 min.</li>
		<li>Prenez un autre récipient et laisser tremper la membrane PVDF dans le méthanol pendant 1 min. Ensuite, sortez PVDF méthanol et mis en mémoire tampon de transfert semi-sec. Agiter délicatement la membrane pendant 5 min.</li>
		<li>Retirez le couvercle de sécurité de l’appareil d’électrophorèse demi-sec.</li>
		<li>Pré mouillage du filtre en papier et préparez un sandwich de gel sur l’anode de platine de fond comme suit : papier filtre, PVDF membrane, gel et papier filtre.</li>
		<li>Cathode sûr cover plaque et de la sécurité, puis exécutez blot à 15 V un courant constant de 90 min. tour coupe l’alimentation électrique, débrancher les appareils semi sèche et retirer la membrane PVDF.</li>
		<li>Membrane de PVDF bloc avec un tampon de blocage (lait écrémé 5 % dans un tampon TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1 % de détergent B (voir Table des matières), pH 7,6)) à température ambiante pendant 1 h avec 30 tr/min, secouant par agitateur orbital.</li>
		<li>Hybrider les membranes PVDF avec anticorps anti-p53 dilué (1:1, 000) dans un tampon bloquant pour 12-16 h à 4 ° C avec 30 t/mn agitation à l’aide d’un mélangeur de suspension.</li>
		<li>Retirez la membrane en PVDF dans un récipient et mettre dans un mélange TBST. Rincer les membranes PVDF avec un mélange TBST deux fois plus.</li>
		<li>Tremper la membrane PVDF dans TBST pendant 30 min à 45 tr/min, secouant par agitateur orbital.</li>
		<li>Hybrider les membranes PVDF avec anticorps de anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) diluée (1:4, 000) dans un tampon bloquant pendant 1 h à température ambiante avec 30 t/mn, secouant à l’aide d’un mélangeur de suspension.</li>
		<li>Laver la membrane en PVDF avec un mélange TBST 3 fois comme décrit à l’étape 3.4.10.</li>
		<li>Faire tremper la membrane PVDF dans TBST pendant 30 min avec 45 t/mn agitation à l’aide d’un mélangeur de suspension. Supprimez un mélange TBST et PBS pour préserver la membrane en PVDF à 4 ° C pendant 12 h.</li>
		<li>Mélanger le réactif substrat chimioluminescent améliorée (substrat de l’ECL) 1 et 2 (1:1) (voir la Table des matières). Retirer la membrane PVDF le PBS, éponger brièvement avec un essuie-tout ou un essuie-glace arrière légers pour absorber l’excès d’humidité et immédiatement ajouter 400 µL de réactif de l’ECL à la surface de chaque membrane pour 3-5 min. enlever excès ECL réactif en tamponnant brièvement, mais ne permettent pas de la m embrane pour sécher complètement.</li>
		<li>Exposer la tache à l’aide d’un système d’imagerie luminescence ou autoradiographie film27.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne divulguer aucun conflit d’intérêt potentiel.

L' in vitro SUMOylation protocole décrit ici régulièrement sert à établir le statut de SUMOylation de substrats de Ubc9 identifiés. La limitation majeure en utilisant le protocole standard utilisé pour étudier la fonction de SUMOylation de ligase E3 SUMO est l’abondance de SUMO E1 activation et enzymes de conjugaison E2 Ubc9 qui maximisent la conjugaison de SUMO dans des systèmes in vitro . Compte tenu de ce défi, nous croyons que par titrage de la quantité d’enzymes SUMO E1 et E2 au niveau qu’on peut d...

Modification de SUMO a été initialement identifiée comme une modification post-traductionnelle réversible (PTM) qui régule la stabilité protéique1. En plus de la conjugaison directe, SUMO peut être attaché à une protéine par l’intermédiaire des interactions non covalentes par SUMO interaction motifs (SIMs)2. Similaire à la liaison de tyrosyl-phosphorylation par les molécules d’héberger l’homologie Src 2 (SH2) ou la liaison de la phosphotyrosine (PTB) domaines3,4, modification de SUMO fournit une plateforme d’interaction additionnelle pour sélective recrutement de SIM contenant effecteur protéines5,6. En plus de la réglementation de la transduction du signal, SUMOylation de facteurs de transcriptionnelles et de molécules de remodelage de la chromatine servent à moduler l’expression de gène7,8. Études de schémas de SUMOylation pangénomique ont révélé que modification de SUMO est associée de positif9,10 ou négative10,11,12 transcription Règlement, en partie en raison de la spécificité de paralogue de SUMOylation.
Il existe trois principales isoformes SUMO pour protéine conjugaison présent dans les cellules de mammifères ; Il s’agit de SUMO-1 et le très homologues SUMO-2 et le SUMO-3 (dénommé SUMO-2/3)13. SUMO est généralement conjugué au résidu lysine (K) dans le motif de ψKxD/E consensus dans la protéine cible. La carte SIM dans le SUMO E3 ligases est responsable de la spécificité de paralogue14. Contrairement aux voies de l’ubiquitination contenant des centaines de E3 ligases, ont été signalés quelques SUMO E3 ligases identifiés15. Ligase E3 SUMO est définies par les propriétés, y compris leur capacité à (i) lier Ubc9, (ii) se lient portion SUMO via un domaine SIM et (iii) améliorer le transfert de SUMO de Ubc9 sur substrat. Ligase E3 n’est pas absolument requis pour SUMO conjugaison16, mais fournit le substrat et la spécificité de SUMO-paralogue. Depuis habituellement seulement une petite fraction de la protéine substrat total est modifié SUMO, détection de protéines SUMOylated en vivo est toujours un défi. Par conséquent, les dosages exacts et reproductibles sont nécessaires afin d’élucider la fonction précise de modification du SUMO.
L' in vitro SUMOylation test, qui évalue la capacité de Ubc9 purifié de catalyser la SUMOylation de substrats protéiques, est un dosage reconnu pour l’étude de SUMO modification17. Toutefois, l’activité ligase E3 SUMO dans la plupart des cas ne peuvent pas être détectée ou ne peut être détectée avec muté ligase SUMO avec forte activité de ligase E3 SUMO et de spécificité de substrat faible par le protocole standard en raison de la présence d’une quantité abondante de Ubc918 . La réussite de ce test dépend en grande partie le titrage prudent de Ubc9 purifié. L’essai in vitro SUMOylation avec décrite ici est modifié par rapport à une norme SUMOylation protocole (voir Table des matières). L’observation des modification de SUMO mondiale accrue au cours de la réactivation de l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi (KSHV) nous a amenés à identifier la ligase E3 SUMO virale qui peut-être être responsable de la régulation de SUMOylation. Après une projection à petite échelle des protéines interagissants de viral SUMO E3 ligase K-bZIP, p53 a été identifié comme un nouveau substrat. Dans ce protocole, nous montrent en détail dans les étapes impliquées dans l’expression et purification de type sauvage K-bZIP, une ligase E3 SUMO virale avec spécificité SUMO-2/3 des cellules d’insecte. La capacité de la K-bZIP purifiée afin d’améliorer la SUMOylation de p53, un substrat bien connu de SUMO, est évaluée en présence de quantités réduites d’enzymes E1 et E2. À l’aide de ce test de SUMOylation modifié, chercheurs peuvent sûrement définissent les capacités de ligase E3 SUMO SUMOylate roman ou substrats connus, qui est une première étape dans l’étude des protéines SUMOylation. En outre, cette méthode permet d’identifier les nouveaux SUMO E3 ligases avec activité de ligase faible mais la spécificité de substrat de haute.

<table><tbody><tr><td>pFastBac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>vecteur baculovirus à double expression vecteur</td></tr><tr><td>pCR2.1-TOPO vecteur</td> de <td>produit PCR</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr> cellule <tr><td>compétente&nbsp ; E. coli DH5&alpha ;</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYE678-80VL</td><td>compétent E. coli cellules A</td></tr><tr><td>E. coli DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>compétent E. coli cellules B</td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Roche</td><td>04709705001</td><td>réactif de transfection</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>milieu sérique réduit</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>NEW England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>CpoI (RsrII)</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0741</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1690</td><td>substrat galactosidase</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Insecte Moyen</td><td>Gibco</td><td>11605094</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Thermo Fisher</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0254-20ML</td><td></td></tr><tr><td>gentamicine</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>tétracycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Merk</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>dodécylsulfate de sodium</td><td>Merk</td><td>1.13760.1000</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (Base)</td><td>J.T.Baker</td><td>4109-06</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé</td><td>Fonterra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glycérol</td><td>J.T.Baker</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td>détergent A</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-500ML</td><td>détergent B</td></tr><tr><td>Poloxamer 188 solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556-100ML</td><td>détergent C</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase Cocktail Tablet</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>3x Flag peptide</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG m2 Perles magnétiques</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8823</td><td>perles magnétiques marquées par anticorps</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-1 Kit</td><td>Active Motif</td><td>40120</td><td>protocole SUMOylation standard&nbsp ;</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-2/3 Kit</td><td>Active Motif</td><td>40220</td><td>protocole SUMOylation standard&nbsp ;</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12123</td><td>Kit d’extraction de plasmides</td></tr><tr><td>Tubes en polypropylène Falcon</td><td></td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Corning</td><td>CNG3008</td><td></td></tr><tr><td>Pointe de chargement</td><td>Sorenson BioScience</td><td>28480</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>PerkinPapier</td> filtre <td>NEF1002</td><td></td></tr><tr><td>buvard</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini appareil de gel de dalle (Bio-Rad Mini Protean II Cell)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001 EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Cellule de transfert électrophorétique</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting</td><td>Thermo</td><td>32106</td><td>ECL mélangeur</td></tr><tr><td>de suspension de réactifs</td><td>Digisystem laboratory instruments&nbsp ; Inc.</td><td>Agitateur orbital SM-3000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kansin instruments Co.</td><td>OS701</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000 imageur biomoléculaire</td><td>GE Healthcare</td><td>28955810</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Thermo Scientific</td><td>B82501</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-p53</td><td>Cell Signaling</td><td>#9282</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-lapin</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro dosage de sumoylation pour étudier l’activité de ligase e3 sumo

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Modification de petite ubiquitin-comme modificateur (SUMO) est une importante modification poteau-de translation (PTM) qui intervient dans la transduction du signal principalement par le biais d’interactions protéine-protéine de modulation. Semblable à la modification de l’ubiquitine, SUMOylation est réalisée par une cascade enzymatique séquentielle dont E1-activation enzymatique (SAE1/SAE2), enzyme de conjugaison E2 (Ubc9) et E3-ligase (c.-à-d., famille PIAS, RanBP2 et Pc2). Cependant, différent de l’ubiquitination, une ligase E3 n’est pas essentiel pour la réaction, mais ne fournissent la précision et l’efficacité pour la conjugaison de SUMO. Protéines modifiées par SUMOylation peuvent être identifiés par l’essai in vivo avec par immunoprécipitation avec des anticorps spécifiques substrat et immunoblotting avec des anticorps spécifiques à SUMO. Toutefois, la démonstration de l’activité protéine SUMO E3 ligase exige en vitro reconstitution de SUMOylation dosages utilisant des enzymes purifiées, substrat et protéines SUMO. Étant donné que dans les réactions in vitro , habituellement SAE1/SAE2 et Ubc9, seuls sont suffisants pour la conjugaison de SUMO, amélioration de SUMOylation par une ligase E3 putative n’est pas toujours facile à détecter. Nous décrivons ici une mis à jour le in vitro SUMOylation protocole qui identifie toujours modification de SUMO à l’aide d’un système in vitro reconstitué. Un protocole étape par étape pour purifier catalytiquement active K-bZIP, une ligase E3 SUMO-2/3 virale, est également présenté. Les activités de SUMOylation de la K-bZIP purifiée figurent sur p53, un objectif bien connu de SUMO. Ce protocole peut être utilisé non seulement pour élucider roman SUMO E3 ligases, mais aussi pour avoir révélé leur spécificité paralogue SUMO.

Selon les informations fournies par le fabricant, la quantité standard d’enzyme E1 et E2 dans le dosage de la SUMOylation est de 50 nM et 500 nM, respectivement. La quantité minimale d’E2 conjugaison Ubc9 qui est capable de SUMOylate p53 a été tout d’abord déterminée par un essai in vitro SUMOylation avec. Aussi bas que le cinquième de la quantité de Ubc9 utilisé dans le standard en vitro protocole d’analyse de SUMOylation a pu efficacement SUMOylate p53 (<strong class="...

Contrairement à l’ubiquitine ligases, quelques ligase E3 SUMO ont été identifiés. Ce modifié in vitro SUMOylation protocole est capable d’identifier de nouveaux SUMO E3 ligases par un essai de reconstitution in vitro .

In Vitro Dosage de SUMOylation pour étudier l’activité de Ligase E3 SUMO

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

L’objectif global de cette expérience est de vérifier qu’une protéine d’intérêt peut être SUMOylée ou qu’il s’agit d’une lygase SUMO E3. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la SUMOylation, telles que l’identification de la lygase SUMO E3. Le principal avantage de cette technique est qu’elle pourrait être utilisée pour l’étude de la spécificité de la lygase SUMO E3 envers différentes formes iso SUMO.Wan-Shan Young, un étudiant au doctorat de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour purifier l’étiquette K-bZIP, incubez d’abord 10 millilitres de lysat cellulaire avec 50 microlitres de billes magnétiques marquées d’anticorps dans un tube en polypropylène de 14 millilitres. Ensuite, faites tourner le tube à 50 tours par minute à quatre degrés Celsius pendant trois heures dans un mélangeur à suspension.Une fois la protéine capturée, centrifugez l’échantillon à 800 fois g pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius pour granuler les billes. Jetez tout sauf un millilitre de surnageant pour remettre les billes en suspension. Et transférez les billes dissoutes dans un tube de 1,5 millilitre.Pour laver les protéines capturées, placez le tube avec les billes sur un support magnétique. Attendez environ trois secondes que les billes adhèrent aux parois latérales du tube, puis retirez le surnageant. Pour laver les billes, ajoutez un millilitre de tampon de lyse dans le tube de 1,5 millilitre.Ensuite, retournez le tube dix fois. Ensuite, placez le tube de 1,5 millilitre sur le support magnétique et retirez le surnageant une fois que les billes adhèrent aux parois. Pour laver à nouveau les billes, ajoutez un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate dans le tube de 1,5 millilitre et retournez-le dix fois.Transférez ensuite le tube sur le support magnétique et retirez le surnageant une fois que les billes se sont fixées aux parois latérales. Pour éluer les protéines marquées K-bZIP des billes magnétiques marquées par anticorps, ajoutez 100 microlitres à 150 microgrammes par millilitre d’octapeptide dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate dans le tube de 1,5 millilitre. Faites ensuite tourner le tube sur un mélangeur à suspension à 50 tours par minute pendant dix minutes à température ambiante.Transférez le tube sur le support magnétique. Et puis collectez le surnageant contenant le K-bZIP. Ensuite, pour analyser l’étiquette K-bZIP purifiée, soumettez un à cinq microlitres de la protéine purifiée à la page SDS, suivi d’une coloration au bleu de Coomassie.Chargez 0,5, 1 et 2 microgrammes d’albumine sérique bovine comme étalons sur le gel pour quantifier la concentration de K-bZIP. Pendant le traitement de l’image sur l’image J.Next, diluez le K-bZIP purifié dans une solution saline tamponnée au phosphate. Atteindre une concentration finale de 100 nanogrammes par microlitre.Et stockez-le à moins 80 degrés Celsius dans de petites aliquotes. Ajoutez trois microlitres de 100 nanogrammes par microlitre de K-bZIP purifié marqué dans la réaction de mélange maître de SUMOylation in vitro. Mélangez ensuite doucement le contenu du mélange principal et incubez à 30 degrés Celsius pendant trois heures.Ensuite, ajoutez 20 microlitres de page SDS 2X avec tampon de chargement pour arrêter la réaction. Ensuite, chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour dénaturer la protéine. Ensuite, chargez 20 microlitres de l’échantillon sur un gel de page FDS à 10 %.Et faites fonctionner le gel à 80 volts pendant environ 120 minutes jusqu’à ce que le colorant atteigne le fond du gel. Une fois l’électroparésie terminée, débranchez l’appareil à gel. Et transférez le gel dans un tampon de transfert semi-sec pendant cinq minutes.Ensuite, faites tremper la membrane PVDF dans un autre récipient rempli de méthanol pendant une minute. Retirez la membrane PVDF du méthanol et trempez-la dans un tampon de transfert semi-sec. Ensuite, agitez doucement la membrane pendant cinq minutes.Retirez le couvercle de sécurité de l’appareil électrophorétique semi-sec. Pré-mouillez un papier filtre. Et préparez un sandwich de gel au bas de l’anode en platine.Après avoir fixé la plaque cathodique dans le couvercle de sécurité, faites fonctionner le transfert à courant constant de 15 volts pendant 90 minutes. Ensuite, coupez l’alimentation électrique et retirez la membrane PVDF après avoir débranché l’appareil semi-sec. Bloquez maintenant la membrane PVDF avec un tampon de blocage pendant une heure à température ambiante sur un agitateur orbital à 30 tours par minute.Ensuite, hybridez la membrane PVDF avec un anticorps anti-p53 et un tampon de blocage pendant 12 à 16 heures à quatre degrés Celsius sur un mélangeur en suspension à 30 tours par minute. Retirez ensuite la membrane PVDF et transférez-la dans un récipient rempli de solution saline tamponnée Tris tween 20. Ensuite, trempez la membrane PVDF dans une solution saline tamponnée Tris tween 20 pendant 30 minutes sur l’agitateur orbital à 45 tours par minute.Hybrider ensuite la membrane PVDF avec un anticorps anti-lapin conjugué à de la peroxydase de raifort diluée dans un tampon bloquant pendant une heure à température ambiante sur le mélangeur en suspension à 30 tours par minute. Ensuite, lavez trois fois la membrane PVDF avec une solution saline tamponnée Tris t. Après le lavage, trempez la membrane PVDF dans une solution saline tamponnée Tris tween 20 pendant 30 minutes sur le mélangeur à suspension à 45 tours par minute.Remplacez ensuite la solution saline tamponnée au Tris tween 20 par une solution saline tamponnée au phosphate. Pour conserver la membrane PVDF à quatre degrés Celsius jusqu’à 12 heures. Ensuite, mélangez les réactifs de substrat chimiluminescents améliorés un et deux dans un rapport de un à un.Retirez ensuite la membrane PVDF de la solution saline tamponnée au phosphate et épongez brièvement avec les poches de perforation pour absorber l’excès d’humidité. Ajoutez immédiatement 400 microlitres de réactif chimiluminescent à la surface de la membrane et attendez trois à cinq minutes. Épongez brièvement pour drainer l’excès de réactif chimiluminescent, empêchant la membrane de sécher complètement.Utilisez le système d’imagerie de Luminescent pour exposer la tache. Ici, une analyse immuno-blot a été effectuée pour montrer la concentration de l’enzyme Ubc9 nécessaire pour SUMOyler les cibles p53. Cela montre que 1/2 et 1/5 de la concentration de l’enzyme Ubc9 peuvent suffire à SUMOylate p53 dans un test de SUMOylation in vitro utilisant les peptides SUMO 1 et SUMO 2.Pour analyser le p53 SUMOylé, la membrane a été sondée avec un anticorps anti-p53. Une analyse immuno-blot similaire a été effectuée pour montrer que la moitié de la concentration E1 et 1/10 des enzymes Ubc9 sont nécessaires pour SUMOyler la cible p53 dans un test de SUMOylation in vitro utilisant les peptides SUMO 1, SUMO 2 et SUMO 3. Ici, la membrane a été colorée avec Coomassie pour montrer la protéine K-bZIP purifiée.Le système d’expression du baculovirus a été utilisé pour exprimer le K-bZIP purifié qui a été analysé sur la page SDS avec de l’albumine sérique bovine comme étalon de comparaison. Une analyse immuno-blot supplémentaire a également été effectuée et a montré qu’en augmentant la concentration de K-bZIP, elle catalyse la SUMOylation de p53 en présence de la moitié de la quantité d’enzymes E1 et de 1/10 de la quantité d’enzymes Ubc9, respectivement. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est exécutée correctement.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de conserver tous les réactifs pour l’essai de SUMOylation in vitro sur de la glace et d’effectuer la dilution en série plutôt qu’en une seule dilution géante. Trouver cette procédure, d’autres méthodes comme la surexpression SUMOlygase peuvent être effectuées afin de vérifier la SUMOylation in vitro. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la SUMOylation pour explorer davantage de SUMOlygase et valider leur pouvoir de spécificité.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier un lygase SUMO e3 à l’aide d’un test de simulation in vitro.

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Cette vidéo montre la méthode in vitro de SUMOylation des protéines de substrat à l’aide d’une cascade enzymatique séquentielle. De plus, l’état SUMOylé de la protéine est identifié à l’aide de la technique d’électrophorèse et d’immunobuvardage.

Dosage de SUMOylation : une technique in vitro pour détecter l’état de SUMOylation des protéines de substrat par immunobuvardage

Ce manuscrit décrit la détection de la sumoylation de protéines et ubiquitination kinétochoriens, Ndc10 Ndc80 et, dans le bourgeonnement levure Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technique qui permet la détection de sumoylation et Ubiquitination de levure bourgeonnante kinétochoriens protéines Ndc10 et Ndc80

Protéines de la famille petit axés sur l’ubiquitine modificateur (SUMO) sont conjugués aux résidus lysine de protéines cibles pour réglementer divers processus cellulaires. Cet article décrit un protocole pour la détection de la protéine du rétinoblastome (Rb) SUMOylation conditions endogènes et exogènes dans les cellules humaines.

In Vivo Détection et analyse des Rb SUMOylation de protéines dans les cellules humaines

Le SUMO est une protéine modificatrice essentielle et très conservée, de petite taille, comme l’ubiquitine. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’une protéine de piégeage de SUMO recombinant tolérante au stress (kmUTAG) pour visualiser les conjugués de SUMO natifs et non marqués et leur localisation dans une variété de types de cellules.

Localisation des protéines modifiées par SUMO à l’aide de protéines de piégeage du sumo fluorescent

Ici, nous présentons un protocole pour enrichir, isoler, identifier, et caractériser des protéines modifiées par SUMO in vivo à la fois à partir de cellules humaines d'hépatome et de tumeurs hépatiques obtenues à partir de modèles murins du carcinome hépatocellulaire en utilisant des entités reliures SUMO (SUBEs).

SumO-Binding Entities (SUBEs) comme outils pour l'enrichissement, l'isolement, l'identification et la caractérisation du protéome SUMO dans le cancer du foie

L'objectif de ce manuscrit est de présenter un aperçu des études biochimiques et fonctionnelles complètes des ligases d'ubiquitine E3 de type RING. Ce pipeline en plusieurs étapes, avec des protocoles détaillés, valide une activité enzymatique de la protéine testée et démontre comment lier l'activité à la fonction.

Caractérisation fonctionnelle des ligases d'ubiquitine RING-Type E3 In Vitro et In Planta

La présente étude fournit des protocoles détaillés de dosage d’ubiquitylation in vitro pour l’analyse de l’activité catalytique de l’ubiquitine ligase E3. Les protéines recombinantes ont été exprimées à l’aide de systèmes procaryotes tels que la culture d’Escherichia coli.

In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

Nous fournissons un protocole détaillé pour un test d’ubiquitylation d’un substrat spécifique et d’une ubiquitine-ligase E3 dans des cellules de mammifères. Les lignées cellulaires HEK293T ont été utilisées pour la surexpression des protéines, le substrat polyubiquitylé a été purifié des lysats cellulaires par immunoprécipitation et résolu dans SDS-PAGE. L’immunoblotting a été utilisé pour visualiser cette modification post-traductionnelle.

Évaluation de l’ubiquitylation du substrat par l’ubiquitine-ligase E3 dans les lysats de cellules de mammifères

Le présent protocole met en évidence une méthode modifiée pour détecter et quantifier les réticulations ADN-protéines (DPC) et leurs modifications post-traductionnelles (PTM), y compris l’ubiquitylation, la SUMOylation et l’ADP-ribosylation induites par les inhibiteurs de la topoisomérase et par le formaldéhyde, permettant ainsi l’étude de la formation et de la réparation des DPC et de leurs PTM.

Détection quantitative des réticulations ADN-protéines et de leurs modifications post-traductionnelles

L’ubiquitination est un régulateur critique des fonctions intracellulaires des protéines. Ici, nous décrivons deux méthodes de lyse cellulaire pour détecter les niveaux d’ubiquitination des protéines du substrat dans les cellules de mammifères et comparons leur efficacité dans l’analyse des niveaux d’ubiquitination. La surexpression des protéines dans HEK293T cellules a été induite par transfection transitoire, et des protéines ubiquitinées ont été détectées par analyse western blot.

Stratégies comparatives pour la détection de l’ubiquitination dans les lysats cellulaires de mammifères en utilisant SMAD2/SMURF2 comme modèle

Ce protocole décrit une méthode pour ubiquitiner Streptococcus pneumoniae en utilisant un lysat cellulaire de mammifère ou un complexe enzymatique d’ubiquitine pur, suivie d’un traitement avec un complexe protéique VCP/p97-UFD1-NPLOC4 purifié afin d’évaluer son activité bactériolytique, permettant l’étude des effecteurs immunitaires dépendants de l’ubiquitine.

In-vitro Reconstitution de l’ubiquitination bactérienne et élimination médiatisée par VCP/p97

Découvrez un protocole de SUMOylation in vitro modifié pour identifier de nouvelles ligases E3 SUMO et étudier leur spécificité envers différentes isoformes. Cette méthode permet de vérifier les protéines cibles et d'explorer les mécanismes de modification post-traductionnelle.

In Vitro Dosage de SUMOylation pour étudier l’activité de Ligase E3 SUMO

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